Zastosowanie anaizy faktorowej do równoczesnego oznaczania aspiryny, saicyamidu i kofeiny w środkach uśmierzających bó 1. Wprowadzenie Równoczesne oznaczenie iości poszczegónych składników obecnych w próbce anaitycznej stanowi częsty probem w praktyce aboratoryjnej rozwiązywany zazwyczaj przez zastosowanie rozmaitych technik rozdzieania składników takich jak na przykład chromatografia gazowa ub ciekła, spektroskopia masowa, ekstrakcja etc. o samo zadanie wypełniają z powodzeniem techniki chemometryczne objęte ogónym mianem wieowymiarowych technik kaibracyjnych. Jedną z takich technik, konceptuanie dopracowanych i skutecznych w praktyce, jest namiarowa anaiza faktorowa (arget Factor Anaysis - FA). Namiarowa anaiza faktorowa jest jedną z wieu metod anaizy faktorowej (Factor Anaysis - FA) zwanej równieŝ zastępczo anaizą głównych składników (Principa Component Anaysis - PCA). Jej zasady i sposób praktycznego zastosowania do iościowego oznaczenia składu próbki anaitycznej będącej mieszaninę trzech znanych składników stanowią jeden z tematów niniejszego ćwiczenia. Podstawą wszystkich metod anaizy faktorowej są macierze danych obrazujące zmiany w anaizowanym układzie wywołane zazwyczaj przez ewoucję składu będącą następstwem procesów chemicznych, zmian ph, zmian temperaturowych itp. Na ogół przyjmuje się, iŝ kaŝdy wiersz takiej macierzy odpowiada pojedynczemu obiektowi (próbce), a kaŝda koumna związana jest z pojedynczą zmienną. Przykładem tego typu macierzy danych moŝe być macierz, której wiersze odpowiadają poszczegónym widmom a koumny reprezentują zmiany intensywności da okreśonej długości fai np. macierz widm absorpcyjnych ub fuorescencyjnych. Jest rzeczą oczywistą, iŝ w przypadku jednej próbki wieoskładnikowej moŝna zarejestrować tyko jedno widmo, a zatem zastosowanie anaizy faktorowej nie jest tutaj moŝiwe. Probem ten moŝna jednak rozwiązać stosując na przykład uogónioną metodę dodatku wzorca, co zostanie zademonstrowane poniŝej w daszej części tego opracowania. Notacja. W anaizie faktorowej duŝą tłustą czcionką oznacza się macierze, natomiast małą tłustą czcionką wektory. Macierz transponowaną w stosunku do macierzy X oznacza się jako X, macierz będącą oszacowaniem macierzy X jako ˆX i wreszcie tak zwaną macierz obciętą jako X. a ostatnia macierz jest macierzą reprodukującą macierz X w oparciu o okreśoną iczbę istotnych faktorów, o czym mówimy poniŝej. Ogónie, w anaizie faktorowej przyjmuje się, Ŝe kaŝdą macierz danych widmowych X, o wymiarach m x n, moŝna rozłoŝyć w taki sposób, Ŝe X = X + E = CS + E (1) gdzie macierz C, o wymiarach m x f, jest macierzą abstrakcyjnych profii stęŝeniowych czyi abstrakcyjnych zmian w składzie, macierz S, o wymiarach n x f, jest macierzą abstrakcyjnych profii widmowych czyi abstrakcyjnych widm, natomiast macierz E, o wymiarach n x m, jest macierzą szumów (błędów) doświadczanych. Wskaźnik f oznacza iczbę istotnych faktorów i jest równowaŝny rzędowi macierzy X. Po wyznaczeniu właściwej iczby istotnych faktorów f macierz X powinna wyjaśniać prawie całą wariancję macierzy 1
danych X, to znaczy powinna reprodukować macierz X z dokładnością do szumów, które ujęto w macierzy E. Istnieją iczne agorytmy, które prowadzą do rozkładu macierzy X zgodnie z zapisem równania (1). Do najpowszechniej stosowanych zaicza się rozkład według wartości szczegónych (Singuar Vaue Decomposition - SVD). Macierz danych X o wymiarach m x n rozkłada się na ioczyn nie dwóch, ecz trzech macierzy, przy czym macierz U jest równieŝ macierzą o wymiarach m x n, macierz Λ jest macierzą diagonaną o wymiarach n x n, a macierz V posiada identyczne wymiary jak macierz Λ. Mamy zatem X = UΛV () przy czym macierz U jest koumnowo ortogonana, tzn. U U = 1, macierz V jest koumnowo ortogonana, ae równieŝ wierszowo ortogonana, czyi V V = 1 oraz VV = 1, natomiast macierz Λ zawiera na głównej diagonai wartości szczegóne uporządkowane od wartości największej do najmniejszej. Jeśi znana jest iczba faktorów f zawartych w macierzy danych X, to równanie () moŝemy formanie zapisać w następujący sposób f n λ kλk k =1 k = + 1 X = u v + u v (3) Pierwsza suma w równaniu (3) definiuje macierz obciętą X w równaniu (1), natomiast druga suma w równaniu (3) odpowiada macierzy szumów doświadczanych E w równaniu (1). Rozkład według wartości szczegónych zobrazowano graficznie na Rys. 1. Macierz obcięta X powstaje w wyniku przemnoŝenia niebieskich podmacierzy wyciętych z macierzy U, Λ i V, zwanych U, Λ i V, natomiast macierz E to efekt przemnoŝenia czarnych podmacierzy macierzy U, Λ i V, które nie posiadają swoich specyficznych nazw. Niebieskie i czarne podmacierze wycięte z macierzy Λ to oczywiście kwadratowe macierze diagonane (patrz Rys. 1). W nawiązaniu do równania (1) przyjmuje się na ogół, Ŝe C = U, natomiast S = ΛV. Rys. 1 Rozkład ekonomiczny macierzy danych X w oparciu o metodę SVD.
Wektory u i v łączą następujące reacje Xv = λu (4a) X u = λ v (4b) co prowadzi do następujących macierzowych zagadnień własnych X Xv = γ v (5a) XX u = γ u (5b) Rozwiązanie równań (5a) i (5b) stanowi treść najstarszego agorytmu PCA, zwanego agorytmem Jacobi ego, przy czym jeśi m > n to macierz X X (o wymiarach n x n) nosi miano rdzeniowej abo małej macierzy kowariancji, natomiast macierz XX (o wymiarach m x m) nazywa się duŝą abo pełną macierzą kowariancji. Wektory v i u to wektory własne, odpowiednich zagadnień własnych (5a) i (5b); γ to stowarzyszone z nimi wartości własne. Z porównania równań (4) i (5) wynika, Ŝe pomiędzy wartościami własnymi γ i wartościami szczegónymi λ zachodzi związek 1 Λ = Γ (6) Łatwo pokazać, Ŝe oba agorytmy anaizy faktorowej, agorytm Jacobi ego i metoda SVD, prowadzą do tych samych rozwiązań. Weźmy da przykładu macierz X X. Formanie moŝemy napisać X X = ( UΛV ) UΛV = ( V ) Λ U UΛV = VΛ ΛV = VΛ V (7) MnoŜąc obie strony równania (7) prawostronnie przez V otrzymamy X XV = VΛ V V = VΛ = VΓ (8) 3
Równanie (8) jest zatem uogónionym zapisem szczegónego zagadnienia własnego przedstawionego w równaniu (5a). W anaogiczny sposób, wychodząc z macierzy XX, moŝna znaeźć uogónienie równania (5b). Zazwyczaj iczba składników posiadających wkłady widmowe w anaizowanym zakresie spektranym odpowiada iczbie istotnych faktorów, ae moŝe się teŝ zdarzyć, Ŝe zmiany widmowe wywołane zostaną przez czynniki natury fizycznej takie jak systematyczne dryfowanie tła w czasie pomiarów ub zmiany temperaturowe. Liczbę istotnych faktorów f wyznacza się tradycyjnie w oparciu o kika kryteriów empirycznych i statystycznych, do których naeŝą między innymi: resztkowe odchyenie standardowe czyi tzw. błąd rzeczywisty (RE) i związana z nim faktorowa funkcja wskaźnikowa Mainowskiego (IND), zredukowane wartości własne (REV), test Fishera sprawdzający negatywną hipotezę przynaeŝności poszczegónych wartości własnych do grupy szumowych wartości własnych (SL), i inne. Na Rys. przedstawiono da ceów iustracyjnych 48 widm absorpcyjnych barwnika fioetu pyrokatechinowego, zestawionych w macierz danych widmowych X o wymiarach 50 x 48 i zarejestrowanych w zakresie widmowym 400 79 nm z krokiem 8 nm. Widma te nie są wystarczająco gładkie, gdyŝ zastosowany krok widmowy był zbyt duŝy. Przedstawione widma pochodzą z pakietu programów do Anaizy Faktorowej ARGE96M opracowanego przez Mainowskiego. Z powtórzonych pomiarów da tej samej serii roztworów wyznaczono błąd pomiarowy absorbancji równy w przybiŝeniu ± 0.00 umownej jednostki absorbancji. Fioet pyrokatechinowy jest barwnikiem, który moŝe wymieniać cztery jony wodorowe. Pięć róŝnych indywiduów chemicznych wywodzących się z fioetu pyrokatechinowego moŝna przedstawić ogónie jako H 4 I, H 3 I -, H I -, H 3 I 3- i I 4-. 48 róŝnych roztworów fioetu pyrokatechinowego odpowiada 48 róŝnym wartościom ph zmieniającym się od 4.6 do 14.0 z krokiem 0.. Na Rys. 3 przedstawiono wyniki kiku kryteriów okreśających iczbę faktorów odpowiedzianych za macierz X widm absorpcji fioetu pyrokatechinowego. Wszystkie kryteria wskazują zgodnie na obecność 4 faktorów. Są to jonowe formy chemiczne fioetu pyrokatechinowego; forma niezdysocjowana H 4 I nie wnosi swojego wkładu widmowego do macierzy X, gdyŝ pojawia się dopiero poniŝej ph 4.0. 4
Rys. Widma absorpcji róŝnych form jonowych fioetu pyrokatechinowego w funkcji ph. Rys. 3 Cztery kryteria wyznaczające iczbę faktorów da macierzy X fioetu pyrokatechinowego: u góry RE i IND, na doe REV i SL. Wyznaczona 5
jednoznacznie przez wszystkie kryteria iczba faktorów f wynosi 4. Wniosek ten jest konsekwencją następujących zachowań: błąd rzeczywisty RE jest duŝy i obniŝa się gwałtownie da pierwszych 4 faktorów, a później obniŝa się o wiee woniej, funkcja wskaźnikowa IND wykazuje minimum da f = 4, zredukowane wartości własne REV osiągają pateau począwszy od f = 5, co wskazuje na to, Ŝe wszystkie wartości własne powyŝej f = 4 naeŝą do grupy wartości szumowych, poziom istotności wartości własnych SL podnosi się wyraźnie ponad dopuszczane granice począwszy od f = 5, co okuje wszystkie wartości własne powyŝej f = 4 wśród grupy szumowych wartości własnych. Macierze abstrakcyjnych profii C i S stanowią kombinacje iniowe odpowiednio rzeczywistych profii stęŝeniowych C i rzeczywistych profii widmowych S pojedynczych składników. Po ustaeniu właściwej iczby faktorów f i odrzuceniu macierzy błędów E, otrzymuje się w przybiŝeniu prawdziwą reację X CS = X (9) Głównym zadaniem anaizy faktorowej jest teraz znaezienie takiej macierzy transformacji R (macierzy rotacji), która przekształci abstrakcyjne profie stęŝeniowe C i widmowe S w przewidywane rzeczywiste profie stęŝeniowe Ĉ i widmowe Ŝ poszczegónych składników. 1 1 = ( )( ) = ˆ ˆ X CRR S CR R S CS = X ˆ (10) Probem wyznaczenia wszystkich eementów macierzy transformacji R, o wymiarach f x f, nie jest probemem trywianym i jego rozwiązanie kasycznymi metodami anaizy faktorowej jest moŝiwe tyko wtedy, gdy w anaizowanej mieszaninie spektranej zachodzi specyficzna ewoucja składu. 1.1 Kasyczna metoda najmniejszych kwadratów (Cassica Least Squares - CLS) Wyznaczenie wszystkich eementów macierzy rotacji R staje się automatycznie bardzo proste, jeśi macierz danych widmowych X odpowiada roztworom kaibracyjnym C, o znanym udziae kaŝdego składnika w kaŝdym roztworze. KaŜda koumna macierzy C zawiera wówczas zmiany stęŝeniowe tyko jednego składnika. MoŜemy w takim przypadku napisać C = Cˆ CR (11) Rozwiązując to równanie macierzowe przy uŝyciu metody najmniejszych kwadratów otrzymuje się zaeŝność R = ( C C) ( C C ) (1) 1 ˆ która pozwaa wyznaczyć macierz rzeczywistych profii widmowych wszystkich składników ˆ 1 S = R S (13) 6
Otrzymane rzeczywiste profie widmowe składników (a ściśej przewidywane rzeczywiste widma) moŝna teraz wykorzystać do wyznaczenia iości tych składników w innych próbkach zawierających te same składniki. MoŜiwe są tutaj dwa warianty: bezpośredniego oznaczenia iości składników ub pośredniego z zastosowaniem uogónionej metody dodatku wzorca. W obu przypadkach obecność innych substancji wnoszących swój wkład do anaizowanej macierzy danych nie pozwaa na poprawne oznaczenie iości anaizowanych składników. A. Metoda bezpośredniego oznaczenia iości składników. Posiadając rzeczywiste widma wszystkich składników otrzymane poprzez anaizę faktorową przeprowadzoną da roztworów kaibracyjnych, moŝna uŝyć ich daej do oznaczenia iości tych składników w próbkach zawierających te same składniki o nieznanym składzie i generujących macierz danych widmowych Y, o wymiarach x n. PoniewaŜ a zatem ˆ ˆ Y C S (14) Y ˆ ˆ ˆ = ( ˆ) 1 C YS S S (15) Y NaeŜy tutaj zaznaczyć, iŝ bezpośrednie wyznaczenie C ˆ Y z reacji ˆ C = ( ) 1 Y Y S nie jest moŝiwe, gdyŝ macierz Ŝ jest macierzą prostokątną i jej odwrotność nie istnieje, stąd konieczność odwołania się do metody najmniejszych kwadratów i w konsekwencji wprowadzenia macierzy S ˆ ( S ˆ S ˆ ) 1 zwanej prawą pseudoodwrotnością macierzy S ˆ. W ceu otrzymania roztworów wieoskładnikowych, gdzie > f, pobiera się z roztworu podstawowego róŝne aikwoty objętościowe tego roztworu i uzupełnia rozpuszczanikiem. B. Uogóniona metoda dodatku wzorca. Do kaŝdego roztworu kaibracyjnego o znanym składzie dodaje się ustaoną objętość pobraną z roztworu podstawowego badanej próbki wieoskładnikowej. Da m tak zmodyfikowanych roztworów kaibracyjnych zestawia się macierz danych widmowych Z. Poszukuje się rozwiązania w postaci ˆ ˆ ˆ ˆ = + ˆ ˆ Z C S C S CS (16) Z Y gdzie ˆ ˆ CS = X ˆ, jest macierzą danych widmowych otrzymaną da roztworów kaibracyjnych przed dodaniem ustaonej objętości badanej próbki. Po wyznaczeniu widm czystych składników zgodnie z równaniem (13) otrzymujemy ostatecznie Cˆ = ZSˆ ( Sˆ Sˆ ) 1 C ˆ (17) Y 1. Namiarowa anaiza faktorowa (arget Factor Anaysis FA) Widma pojedynczych czystych składników są zazwyczaj bardzo dobrze znane i opisane szczegółowo w odpowiednich atasach widm. Dotyczy to w szczegóności widm absorpcyjnych. Powstaje zatem pytanie czy podejrzewając obecność danego składnika w mieszaninie danych widmowych moŝna skorzystać ze zmierzonego wcześniej widma takiego 7
składnika i stwierdzić jego obecność w badanej mieszaninie? Odpowiedź na to pytanie jest pozytywna, a zadanie to wypełnia z powodzeniem namiarowa anaiza faktorowa. Nazwa tej odmiany anaizy faktorowej wywodzi się właśnie z procesu namierzania faktorów czyi składników chemicznych w anaizowanej macierzy danych widmowych. Aby zrozumieć ideę namierzania faktorów w takiej wersji tzn. z uŝyciem istniejących widm czystych składników, przekształcimy horyzontanie zorientowaną macierz danych widmowych X przedstawioną w równaniu (10) w macierz ustawioną wertykanie 1 1 1 ( ) = ( ) ( ) = = ˆ X CRR S S R R C SRR C X (18) Ostateczny wynik tego przekształcenia jest konsekwencją ortogonaności macierzy rotacji tzn. istnienia reacji 1 R = R. Odtworzona w równaniu (18) macierz danych widmowych ˆX nie jest identyczna z zarejestrowaną macierzą danych widmowych X, stanowi jednak jej najepsze moŝiwe przybiŝenie. Wniosek wynikający z równania (18) moŝna inaczej zapisać następująco ˆ 1 = ( )( ) = ˆ ˆ X SR R C SC (19) Równanie (19) mówi nam, Ŝe przewidywaną macierz widm przemnoŝenia przewidywanej macierzy widm czystych składników X ˆ otrzymuje się z Ŝ przez transponowaną przewidywaną macierz zmian stęŝeniowych czystych składników C ˆ. Jedynymi znanymi macierzami w równaniu (19) są macierze obcięte S i C otrzymane w wyniku zastosowania metody SVD ub innego agorytmu PCA do rozkładu macierzy widm X. Z równania (19) wynika, Ŝe -tą koumnę macierzy Ŝ otrzymuje się z przemnoŝenia macierzy S przez -tą koumnę macierzy R, tzn. s = Sr (0) ˆ Wektor s ˆ nazywa się wektorem przewidywanym (czyi w naszym przypadku przewidywanym widmem), natomiast wektor r jest stowarzyszonym z nim wektorem transformacji. Aby wygenerować wektor r, który pozwoi otrzymać przewidywany wektor s ˆ, w największym stopniu zbiŝony do wektora próbnego s zwanego namiarem (czyi do posiadanego widma czystego składnika), naeŝy daej skorzystać z metody najmniejszych kwadratów, która zminimaizuje odchyenia pomiędzy wektorem namierzanym a wektorem przewidywanym i w ten sposób wytworzy najepszy z moŝiwych wektorów transformacji da rozwaŝanego testu namierzania indywiduanego faktora. Wektor transformacji r posiada składowe r1, r,..., r f. KaŜdy wiersz macierzy S moŝna traktować jako wektor wierszowy, na przykład i-ty wektor macierzy S to wektor mający składowe s,..., i1, si s if. MoŜna go oznaczyć umownie jako wektor si i, da odróŝnienia od i-tej koumny macierzy S, która jest wektorem oznaczanym odpowiednio jako skaarny wektora si i i wektora r okreśa i-ty eement wektora s ˆ, czyi s i i Ioczyn sˆ i = si i r = si 1r1 + si r +... + sif rf (1) 8
Sumowanie we wzorze (1) przebiega po wszystkich f głównych faktorach. MnoŜąc kaŝdy wiersz macierzy S przez wektor r otrzymujemy wszystkie eementy wektora przewidywanego s ˆ, czyi sˆ ˆ ˆ 1, s,..., s n. KaŜdy eement tego wektora naeŝy następnie porównać z odpowiednim eementem wektora próbnego s, posiadającego składowe s, s,..., s n. RóŜnicę pomiędzy wartością s ˆi a wartością s i zapisujemy jako si 1 s = sˆ s = s r + s r +... + s r s () i i i i1 1 i if f i Aby uzyskać najepszy wektor r minimaizuje się odchyenie wektora próbnego (namierzanego) od wektora przewidywanego przyrównując do zera sumę pochodnych kwadratów róŝnic wzgędem odpowiedniego eementu wektora transformacji. Na przykład, pochodna kwadratu róŝnicy wzgędem eementu r 1 okreśona jest następująco d( si ) dr 1 = s r + s s r +... + s s r s s (3) i1 1 i1 i i1 if f i1 i Podobne wyraŝenia otrzymuje się da pozostałych indeksów wierszowych. Po zsumowaniu tych wyraŝeń i zastosowaniu kryteriów metody najmniejszych kwadratów otrzymujemy ostatecznie następujące równanie d( s ) n n n n n i = 0 = r1 si 1 + r si 1si +... + rf si 1sif si 1si i= 1 dr1 i i i i (4) Powtarzając te rachunki otrzymuje się sumy kwadratów pochodnych wzgędem pozostałych eementów wektora transformacji r (tzn. wzgędem r, r3,..., r f ). Prowadzi to do następującego układu równań s s = r s + r s s +... + r s s i1 i 1 i1 i1 i f i1 if s s = r s s + r s +... + r s s i i 1 i1 i i f i if s s = r s s + r s s +... + r s if i 1 i1 if i if f if (5) W notacji macierzowej równanie (5) przyjmuje postać a = Br (6) gdzie 9
a s s i1 i s s i i s s if i (7) r r1 r rf (8) B s s s s s i1 i1 i i1 if i1 i i i if s s s s s s s s s s i1 if i if if (9) MnoŜąc obie strony równania (6) przez 1 B otrzymujemy 1 r = B a (30) Dokładna anaiza równania (9) ujawnia, Ŝe natomiast równania (7), Ŝe B = S S (31) a S s (3) = gdzie s jest wektorem próbnym (namierzanym). Równanie (30) moŝna zatem zapisać w postaci 1 r = ( S S) S s (33) Jest to najwaŝniejsze równanie namiarowej anaizy faktorowej. Przedstawia się je niekiedy w formie bardziej zwartej jako + r = S s (34) + gdzie macierz S jest tzw. ewą pseudoodwrotnością macierzy S. Po wstawieniu równania (34) do równania (0) otrzymujemy ostatecznie 10
+ sˆ = SS s (35) Idea indywiduanego namierzania faktorów staje się teraz oczywista. MoŜna ją wyrazić obrazowo w następujący sposób: wektor próbny s zostaje przefitrowany przez macierz + SS, wynikiem tej transformacji jest wektor przewidywany s ˆ ; jeśi wektor s jest związany z rzeczywistym faktorem, to kaŝdy eement wektora s ˆ będzie równy, w granicach dopuszczanego błędu, odpowiedniemu eementowi wektora s ; jeśi przeciwnie, nie będzie związany z prawdziwym faktorem, to róŝnice pomiędzy odpowiednimi eementami będą większe niŝ naeŝałoby oczekiwać. Kryteria sprawdzania tej odpowiedniości opisał Mainowski. 1 Stosując namiarową anaizę faktorową naeŝy pamiętać o jednym istotnym szczegóe: kaŝda iniowa kombinacja widm odpowiadających rzeczywistym faktorom, a w szczegóności abstrakcyjne profie widmowe zawarte w macierzy S, równieŝ z powodzeniem przechodzą test namierzania faktorów. A zatem jeśi nie dysponuje się widmami czystych składników, ecz jedynie domniemanymi widmami takich składników otrzymanymi na przykład na drodze ich niekompetnego rozdzieenia, to wynik namierzania faktorów będzie poprawny, ae nie oznacza to, Ŝe namierzane widma odpowiadają widmom czystych składników. Na Rys. 4 przedstawiono widma fuorescencji dwuskładnikowej mieszaniny antracenfuoranten w n-heksanie. Nie ma wśród nich widm czystych składników. Rys. 5 przedstawia widma trzech czystych składników: antracenu, fuorantenu i chryzenu w tym samym rozpuszczaniku. Widm tych uŝyto jako wektorów próbnych do indywiduanego namierzania faktorów. Rezutaty namierzania faktorów pokazano na Rys. 6. Rys. 7 przedstawia natomiast przewidywane rzeczywiste profie stęŝeniowe (zmiany składu) obu namierzonych składników mieszaniny. 11
Rys. 4 Widma fuorescencji dwuskładnikowej mieszaniny antracen-fuoranten w n-heksanie (7 obiektów). Rys. 5 Unormowane widma fuorescencji czystych substancji w n-heksanie: chryzenu (c inia czerwona), antracenu (a inia niebieska)) i fuorantenu (f inia zieona). abea I. Wyniki namierzania faktorów w oparciu o program ttest.m z pakietu ARGE96M opracowanego przez Mainowskiego. namiar # AE REP RE SPOIL %SL 1 1.716e+001 1.19e+001 1.995e+001 1.1508e+000 4.960e+001 1.808e+001 1.11e+001 1.4186e+001 1.653e+000 4.3106e+001 3.5195e+00 6.5744e+000.5187e+00 3.8310e+001.0854e-005 Znaczenie symboi w abei I jest następujące: AE - pozorny błąd w wektorze próbnym, REP rzeczywisty błąd wektora przewidywanego, RE - rzeczywisty błąd wektora próbnego, przy czym (AE) = (REP) + (RE). Funkcja SPOIL zdefiniowana przez Mainowskiego kwaifikuje wektor próbny jako moŝiwy do przyjęcia jeśi przyjmuje wartości w przedziae 1.0 do 3.0. Podobną roę odrywa poziom istotności %SL, który weryfikuje pozytywną hipotezę kwaifikacyjną wobec wektora próbnego. Jeśi jest większy niŝ 10, to wektor próbny jest moŝiwym do przyjęcia kandydatem na dobry namiar. 1
13
Rys. 6 Koreacja pomiędzy wektorem próbnym i wektorem przewidywanym: udana da widm fuorescencji antracenu i fuorantenu (dwa pierwsze wykresy - a,b) i nieudana da widma fuorescencji chryzenu (trzeci wykres - c). Wyniki namierzania faktorów przedstawione w abei I i na Rys. 6 są jednoznaczne: chryzen jako składnik nie wchodzi w skład anaizowanej mieszaniny widmowej. Na Rys. 7 przedstawiono przewidywane profie stęŝeniowe (ściśe biorąc intensywnościowe) otrzymane przy pomocy programu toad.m z pakietu ARGE96M. Da koejnych 7 mieszanin spektranych antracenu i fuorantenu wzgędne stosunki stęŝeniowe powinny zmieniać się następująco: :8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:. 14
Rys. 7 Przewidywane rzeczywiste profie stęŝeniowe da fuoryzującej mieszaniny antracen-fuoranten w n-heksanie: profi monotonicznie rosnący da antracenu i profi monotonicznie opadający da fuorantenu. Zagadnienia do opracowania 1. Podstawowe pojęcia agebry macierzowej: definicje wektorów i macierzy, działania na macierzach, rząd macierzy, równania macierzowe, rozwiązanie najmniejszych kwadratów, macierz odwrotna i pseudoodwrotna, wektory własne i wartości własne.. Pakiet Matab 6.0 (ub wyŝsze wersje) wczytywanie i zapamiętywanie danych, wykonywanie prostych działań na wektorach i macierzach, sporządzanie wykresów D i ich modyfikacja. 3. Anaiza głównych składników (PCA): duŝa i mała macierz kowariancji, macierzowe zagadnienia własne, macierz rotacji, kryteria wyznaczania iczby istotnych faktorów. 4. Rozkład macierzy według wartości osobiwych (SVD). 5. Własności transformacji namiarowej (target transformation), wektor próbny, wektor przewidywany, kryteria skuteczności namiaru. 6. Uogóniona metoda dodatku wzorca i jej wykorzystanie w spektroskopii absorpcyjnej do oznaczania iości poszczegónych składników w próbce. 15
Część doświadczana Aparatura 3 koby miarowe na 100 m, 1 koba miarowa na 50 m, 15 kobek miarowych na 10 m, mikropipeta, naczyńka wagowe, zewki, kuwety kwarcowe do pomiarów widm absorpcyjnych, spektrofotometr Heios β, komputer z programem MALAB wersja 6.0 ub wyŝsze, z oprogramowaniem do anaizy faktorowej (pakiet ARGE 96 M). Odczynniki aspiryna, saicyamid, kofeina, metano. Wykonanie ćwiczenia 1. Dokładnie odwaŝone nawaŝki zawierające ok. 0-5 mg aspiryny, saicyamidu oraz kofeiny rozpuszcza się w ok. 50 m metanou, a następnie rozcieńcza do kreski tym samym rozpuszczanikiem w kobach miarowych na 100 m.. Z otrzymanych w pkt. 1 jednoskładnikowych roztworów podstawowych pobiera się mikropipetą po 0.50 m tych roztworów i przenosi do trzech kobek miarowych na 10 m, a następnie uzupełnia do kreski metanoem. Da rozcieńczonych w ten sposób roztworów jednoskładnikowych rejestruje się widma absorpcji w zakresie 0-370 nm stosując jako odnośnik metano. 3. Z tych samych roztworów podstawowych sporządza się 6 roztworów trójskładnikowych. W tym ceu pobiera się mikropipetą odpowiednie iości roztworów podstawowych według załączonej przez asystenta tabei i przenosi do kobek miarowych na 10 m. Kobki uzupełnia się do kreski miarowej metanoem. Da wszystkich 6 roztworów rejestruje się widma absorpcji (macierz X) w zakresie 0-370 nm stosując jako odnośnik metano. abea typowego składu roztworów kaibracyjnych. Nr roztworu Objętości roztworów podstawowych [m] Saicyamid Aspiryna Kofeina 1 0.3 0.40 0.3 0 0.7 0.40 3 0.4 1.0 0 4 0.40 0.48 0.08 5 0.48 0 0.4 6 0.16 0.4 0.48 4. Asystent ub wybrany student sporządza nieznany roztwór trójskładnikowy. W tym ceu przenosi do koby miarowej na 50 m okreśone iości miiitrów podstawowych roztworów jednoskładnikowych, np. 0.50 m roztworu saicyamidu, 1.00 m roztworu aspiryny i 0.50 m roztworu kofeiny. Kobę uzupełnia się do kreski miarowej rozpuszczanikiem. 16
5. Nieznany roztwór trójskładnikowy przenosi się w iościach po 5.00 m do 6 kobek miarowych na 10 m. Kobki te uzupełnia się do kreski miarowej 6 roztworami kaibracyjnymi opisanymi w pkt. 3 dodając do kaŝdej kobki jeden taki roztwór. Da otrzymanych roztworów rejestruje się widma absorpcyjne (macierz Y) w zakresie 0-370 nm uŝywając metano jako odnośnika. Opracowanie wyników 1. Narysować wzory strukturane anaizowanych środków przeciwbóowych i odpowiadające im widma absorpcyjne.. Przedstawić na rysunku widma absorpcyjne roztworów kaibracyjnych (macierz X). 3. Stosując program pcomp.m (z pakietu ARGE 96 M) przeprowadzić anaizę iości istotnych faktorów w macierzy X. Wyniki zebrać w tabei i ziustrować odpowiednim rysunkiem. 4. Da wyznaczonej iczby istotnych faktorów przeprowadzić rozkład macierzy kaibracyjnej X na ioczyn macierzy abstrakcyjnych widm S i abstrakcyjnych profii stęŝeniowych C : X X = SC Do przeprowadzenia tego rozkładu wykorzystać procedurę matabowską svd.m w jej wersji ekonomicznej. Wyniki ziustrować na odpowiednich rysunkach. 5. Na podstawie znajomości rzeczywistych profii stęŝeniowych roztworów kaibracyjnych C odzyskać z macierzy X przewidywane rzeczywiste widma czystych składników mieszanin widmowych, posługując się następującym przekształceniem (wykonywanym w programie Matab): ( ) 1 Sˆ = XC C C Odzyskane w ten sposób widma absorpcyjne aspiryny, saicyamidu i kofeiny przedstawić na rysunku, a po unormowaniu do powierzchni jednostkowej porównać z podobnie unormowanymi zmierzonymi widmami czystych składników. 6. W stosunku do roztworów kaibracyjnych zastosować procedurę namiarowej anaizy faktorowej (program ttest.m z pakietu ARGE 96 M), uŝywając jako namiarów widm czystych składników. Wyniki namiarowej anaizy faktorowej zestawić w tabei. Na rysunkach przedstawić koreacje między wektorem namierzanym a wektorem przewidywanym. 7. Punkty, 3 i 4 wykonać da macierzy Y (widma próbek uzyskanych przez dodanie okreśonej iości mieszaniny trójskładnikowej do poszczegónych roztworów kaibracyjnych). 8. Korzystając z wyznaczonych w pkt. 5 przewidywanych widm rzeczywistych czystych składników Ŝ odzyskać z macierzy Y przewidywane rzeczywiste profie stęŝeniowe Ĉ, w oparciu o następujące przekształcenie (wykonywane w programie Matab): 17
( ) 1 ˆ ˆ ˆ ˆ C = S S S Y Przewidywane rzeczywiste profie stęŝeniowe uzyskane w uogónionej metodzie dodatków wzorca zestawić w tabei: Nr próbki 1 3 4 5 6 Objętości roztworów podstawowych [m] Saicyamid Aspiryna Kofeina PoniewaŜ roztwory próbek otrzymano mieszając ze sobą roztwory kaibracyjne i roztwór trójskładnikowy o nieznanym składzie zawsze w stosunku 1:1, tzn. 5 m roztworu kaibracyjnego i 5 m roztworu nieznanej próbki, datego stęŝenie saicyamidu, aspiryny i kofeiny w mieszaninie próbki trójskładnikowej o nieznanym składzie moŝna obiczyć uŝywając wzoru: cx = ( c 0.5 c0 ) 5, ( c x - stęŝenie danego składnika w nieznanej próbce, c stęŝenie danego składnika w roztworze powstałym z połączenia roztworu kaibracyjnego i nieznanej próbki, c 0 stęŝenie tegoŝ składnika w wyjściowym roztworze kaibracyjnym). Liczba 5 w powyŝszym wzorze wynika z przeiczenia objętości kobek (50 m/10 m). Po uśrednieniu po wszystkich roztworach otrzymuje się stęŝenia składników w badanej próbce wyraŝone w m roztworów podstawowych, które moŝna teraz przeiczyć na stęŝenia moowe. 9. Przeprowadzić tak jak w pkt. 6 namiarową anaizę faktorową da macierzy Y wykorzystując: a) przewidywane rzeczywiste widma czystych składników Ŝ otrzymane w pkt. 5. b) zarejestrowane widma czystych składników S. Da obu przypadków wyznaczyć przewidywane rzeczywiste profie stęŝeniowe w oparciu o program toad.m (z pakietu ARGE 96 M) i przedstawić w tabeach jak w pkt. 8. Wyznaczyć w anaogiczny sposób jak w pkt. 8 średnie iości składników wyraŝone w m roztworów podstawowych i przeiczyć na stęŝenia moowe. Literatura podstawowa [1] E. R. Mainowski, Factor Anaysis in Chemistry, Wyd. 3, John Wiey & Sons, New York Chichester Brisbane oronto Singapore, 00 str. str. 3-59, 65-69. [] S. Brandt, Anaiza Danych Wyd. 1, PWN, Warszawa, 1998, str. str. 506-513, 535-541, 553-559. [3] M. J. Chares, N. W. Martin, H. Z. Msimanga, J. Chem. Education, 74, str. str. 1114-1117, (1997) Simutaneous Determination of Aspirin, Saicyamide, and Caffeine in Pain Reievers by arget Factor Anaysis 18
Literatura uzupełniająca [4] M. Maeder, Ana. Chem.. 59, 57 (1987). [5] J. oft, Chem. Inte. Lab. Syst., 9, 189 (1995). [6] B. M. Wise, N. B. Gaagher, PLS_oobox 3.0 for use with MALAB M, Eigenvector Research, Inc., 003. 19