RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 211466 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 381046 (22) Data zgłoszenia: 13.11.2006 (51) Int.Cl. A01N 65/00 (2006.01) A01N 33/04 (2006.01) A01N 43/50 (2006.01) A01P 1/00 (2006.01) A01P 3/00 (2006.01) A01P 7/04 (2006.01) (54) Sposób otrzymywania ekstraktu z kurki Cantharellus cibarius, ekstrakt z kurki Cantharellus cibarius i zastosowanie ekstraktu z kurki Cantharellus cibarius (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT PRZEMYSŁU ORGANICZNEGO, Warszawa, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: 26.05.2008 BUP 11/08 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.05.2012 WUP 05/12 (72) Twórca(y) wynalazku: ANNA CIENIECKA-ROSŁONKIEWICZ, Warszawa, PL AGNIESZKA SAS, Warszawa, PL ELŻBIETA PRZYBYSZ, Warszawa, PL BOLESŁAW MORYTZ, Warszawa, PL JERZY KAZIMIERCZAK, Warszawa, PL JULIUSZ PERNAK, Poznań, PL ANNA SYGUDA, Częstochowa, PL PL 211466 B1
2 PL 211 466 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania ekstraktu z kurki Cantharellus cibarius rosnącej w Polsce i północnej części Europy oraz ekstrakt otrzymany tym sposobem. Kurka - pieprznik jadalny Cantharellus cibarius, to popularny grzyb koloru żółtego rosnący w Polsce i północnej części Europy. Jest to grzyb bardzo charakterystyczny, trudny do pomylenia z grzybami trującymi, dlatego jest bezpieczny podczas zbierania. Zawiera między innymi tłuszcze, kwasy tłuszczowe, karoteny, steroidy i witaminy. Należy do nielicznych grzybów, które nie są atakowane przez owady i ślimaki - ten efekt przypisuje się działaniu nienasyconych kwasów tłuszczowych. Znane jest owadobójcze działanie ekstraktów z kurki Cantharellus cibarius. W publikacji: Anna Cieniecka-Rosłonkiewicz, Elżbieta Przybysz, Bolesław Morytz Studies on the utilization of higher fungi metabolites against agrophages. The evaluation of biological activity of extract from Cantharellus cibarius" Pestycydy/Pesticides, 2002, 1-4, 53-60 opisano działanie owadobójcze ekstraktu z kurki uzyskanego za pomocą octanu etylu. Ekstrakty z kurki o działaniu owadobójczym otrzymywano również za pomocą heksanu. Z opisu zgłoszenia patentowego nr GB827403 znane jest hipoglikemiczne działanie ekstraktów z kurki. Ekstrakty zgodnie z ww. rozwiązaniem otrzymywano na drodze wielokrotnej ekstrakcji za pomocą konwencjonalnych rozpuszczalników, takich jak alkohol metylowy, etylowy lub butylowy, aceton, eter, woda i chloroform. Celem wynalazku było uzyskanie ekstraktu z kurki zawierającego bogatszą gamę zawartych w grzybie substancji i posiadającego szersze właściwości bójcze. Cel ten osiągnięto przez zastosowanie do ekstrakcji cieczy jonowych. Sposób wytwarzania ekstraktu z kurki Cantharellus cibarius według wynalazku charakteryzuje się tym, że proces ekstrakcji prowadzi się za pomocą cieczy jonowej imidazoliowej lub amoniowej, w temperaturze od 20 C do 50 C w czasie od 1 godziny do 5 godzin, a następnie ekstrakt przemywa się niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym, niemieszającym się z cieczą jonową i rozpuszczalnik ewentualnie usuwa się, korzystnie na drodze destylacji. Korzystnie stosuje się ciecz jonową wybraną z: tetrafluoroboranu 1-metylo-3-pentyloksymetyloimidazoliowego [MPIM][BF 4 ] lub tetrafluoroboranu 1,3-dibutoksymetyloimidazoliowego [dbim][bf 4 ] lub salicylanu 1-nonyloksymetyloimidazoliowego [HNIM][Salicylan] lub azotanu(v) didecylodimetyloamoniowego [DDA][NO 3 ], Korzystnie stosuje się kurki w postaci wysuszonej, najkorzystniej w postaci sproszkowanej. Korzystnie jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się heksan, heptan, oktan. Przedmiotem wynalazku jest także ekstrakt z kurki Cantharellus cibarius, który charakteryzuje się tym, że stanowi go ekstrakt uzyskany na drodze ekstrakcji cieczą jonową imidazoliowa lub amoniową, korzystnie wybraną z: tetrafluoroboranu 1-metylo-3-pentyloksymetyloimidazoliowego [MPIM][BF 4 ] lub tetrafluoroboranu 1,3-dibutoksymetyloimidazoliowego [dbim][bf 4 ] lub salicylanu 1-nonyloksymetyloimidazoliowego [HNIM][Salicylan] lub azotanu(v) didecylodimetyloamoniowego [DDA][NO 3 ], otrzymany sposobem według wynalazku. Wynalazek obejmuje również zastosowanie ekstraktu z kurki Cantharellus cibarius, otrzymanego sposobem według wynalazku, jako środka o działaniu owadobójczym lub grzybobójczym lub bakteriobójczym. Zastosowane do ekstrakcji kurki Cantharellus cibarius jonowe polarne ciecze inaczej penetrują grzyb niż stosowane wcześniej rozpuszczalniki organiczne. Wysoka polarność decyduje o rozpuszczaniu niektórych produktów pochodzenia naturalnego, które są nierozpuszczalne w rozpuszczalnikach o niepolarnym charakterze. Ekstrakcja cieczą jonową prowadzi zatem do uzyskania mieszaniny o innym składzie chemicznym niż ekstrakt uzyskany przy zastosowaniu rozpuszczalników organicznych. Konsekwencją innego składu chemicznego ekstraktu są jego odmienne, bogatsze właściwości i możliwości zastosowania. Zgodnie z wynalazkiem stosuje się wymienione wyżej ciecze jonowe, ale można użyć także ciecze o dowolnym rodzaju: aprotonowe i protonowe, asymetryczne i symetryczne. Ciecz jonowa, ze względu na niemierzalną prężność par w temperaturze pokojowej może być zawracana ponownie do ekstrakcji kurki. Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach stosowania. P r z y k ł a d 1. Tetrafluoroboran 1-metylo-3-pentyloksymetyloimidazoliowy [MPIM][BF 4 ]
PL 211 466 B1 3 Do nasyconego roztworu wodnego (0,4 mola) chlorku 1-metylo-3-pentyloksymetyloimidazoliowego dodawano przy ciągłym mieszaniu mechanicznym stechiometryczną ilość tetrafluoroboranu sodu, z 10% nadmiarem (0,44 mola), w postaci nasyconego roztworu wodnego. Reakcję prowadzono przez 2 h w temperaturze pokojowej. Z roztworu wypadała ciecz, którą przemyto kilkakrotnie 30 cm 3 wody i suszono w warunkach obniżonego ciśnienia w temperaturze 50 C. Otrzymano ciecz jonową z wydajnością 85%, o gęstości 1,155 g/cm 3 i lepkości dynamicznej 92,9 mpa s. Strukturę związku potwierdzono wykonując widma protonowego i węglowego magnetycznego rezonansu jądrowego: 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ [ppm]: 9,25 (s, 1H); 7,84 (t, J= 2 Hz, 1H); 7,75 (t, J= 2Hz, 1H); 5,55 (s, 2H); 3,89 (s, 3H); 3,48 (t, J = 6,5 Hz, 2H); 1,50 (m, 2H); 1,24 (m, 4H); 0,85 (t, J = 7 Hz, 3H); 13 C NMR (DMSO-d 6 ) δ [ppm]: 137,0; 124,0; 121,8; 78,1; 69,2; 35,9; 30,9; 28,6; 23,1; 13,8. Analiza elementarna CHN dla C 10 H 19 ONBF 4 (M = 288,50): wartości wyliczone C = 41,16%, H = 66,52%, N = 4,85%; wartości zmierzone C = 42,05%, H = 65,40%, N = 4,29%. Określoną porcję (45 g) wysuszonych i sproszkowanych kurek Cantharellus cibarius zalewano w reaktorze cieczą jonową [MPIM][BF 4 ] i mieszano przez 3 godziny w temperaturze 40 C. Następnie grzyby odsączano na lejku Schotta. Ciecz jonową traktowano heksanem, który następnie oddestylowano. Otrzymano 0,1 g ekstraktu. P r z y k ł ad 2. Salicylan 1-nonyloksymetyloimidazoliowy [HNIM][Salicylan] 0,3 mola nonyloksymetyloimidazolu umieszczono w kolbie okrągłodennej o pojemności 500 cm 3 rozpuszczczono w 100 cm 3 metanolu, następnie dodano 0,3 mola kwasu salicylowego rozpuszczonego w 50 cm 3 metanolu. Reakcję prowadzono 12 godzin. Następnie odparowano metanol na wyparce próżniowej, całość rozpuszczono w acetonie i wytrącano heksanem. Aceton odparowano, a produkt ostatecznie suszono w warunkach obniżonego ciśnienia w temperaturze 50 C. Otrzymano ciecz z wydajnością 90%, o czystości 98%) określonej metodą miareczkowania dwufazowego (PN-EN ISO 2871-2) i gęstości 1,058 g/cm 3. Strukturę związku potwierdzono wykonując widma protonowego i węglowego magnetycznego rezonansu jądrowego: 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ [ppm]: 10,06 (s, 2H) 8,54 (s, 1H); 7,81 (d, J= 9,6 Hz, 1H); 7,54 (s, 1H); 7,38 (s, 1H); 7,33 (m, 1H); 6,82 (m, 2H); 4,11 (t, J = 7,1 Hz, 2H); 1,79 (q, J = 7,1, 2H); 1,23 (m, 12H); 0,87 (t, J= 6,7 Hz, 3H); 13 CNMR (DMSO-d 6 ) δ [ppm]: 172,6; 137,2; 125,5; 120,3; 161,6; 134,3; 130,3; 118,3; 116,7; 115,3; 76,4; 68,4; 31,1; 29,0; 28,8; 28,7; 25,4; 22,1; 13,9. Analiza elementarna CHN dla C 20 H 30 O 4 N (M = 391,71): wartości wyliczone C = 61,32%, H = 77,35%, N = 3,58%; wartości zmierzone C = 61,66%, H - 76,20%, N = 3,18%. 45 g wysuszonych i sproszkowanych kurek Cantharellus cibarius zalewano w reaktorze salicylanem 1-nonyloksymetyloimidazoliowym w ilości 100 g i mieszano przez 3 godziny w temperaturze 40 C. Następnie grzyby odsączano na lejku Schotta. Ciecz jonową przemywano heksanem. Roztwór heksanowy przeniesiono do wyparki i oddestylowano heksan. Otrzymano 3 g ekstraktu. P r z y k ł a d 3, porównawczy. Ekstrakcja octanem etylu. Wysuszone i sproszkowane grzyby w ilości 45 g umieszczano w reaktorze zaopatrzonym w mieszadło mechaniczne i termometr mieszano z dwukrotną objętością rozpuszczalnika, którym był octan etylu, w temperaturze 40 C w ciągu 3 godzin. Proces powtarzano trzykrotnie, a następnie rozpuszczalnik odparowywano i przekazywano do badań biologicznych. W tabeli 1 zestawiono masę ekstraktów z kurek otrzymanych na drodze ekstrakcji przy użyciu różnych cieczy jonowych. Ekstrakty oznaczone liczbami II i IV otrzymano sposobem analogicznym jak w przykładzie 1. Skuteczność ekstrakcji aktywnych związków z kurek zależała od rodzaju użytej cieczy jonowej. Największą ilość ekstraktu uzyskiwano stosując salicylan-1-nonyloksymetyloimidazoliowy. Nieco mniej ekstraktu uzyskiwano stosując octan etylu. Najmniejszą ilość ekstraktu uzyskano przy pomocy azotanu(v) didecylodimetyloamoniowego i tetrafluoroboranu 1-metylo-3-pentyloksymetyloimidazoliowego. P r z y k ł a d 4. Badania biologiczne Zbadano działanie uzyskanych ekstraktów z kurek w stosunku do owadów, bakterii i grzybów. Badania na owadach Zbadano działanie owadobójcze ekstraktów z kurek metodą indywidualnego dawkowania w stosunku do dwóch gatunków owadów: muchy domowej (Musca domestica L.) i karaczana wschod-
4 PL 211 466 B1 niego (Blatta orientalis L.). W teście stosowano 4-8 dniowe samice muchy domowej oraz 21-dniowe nimfy karaczana wschodniego. Acetonowy roztwór ekstraktu nanoszono na ciało owada w ilości 0,5; 1; 3 i 5 μl/osobnika. Śmiertelność owadów określano po 24 godzinach i 48 godzinach. Skuteczność działania owadobójczego wyrażano w procentach śmiertelności. Badania na mikroorganizmach Aktywność ekstraktów z kurek oceniano w stosunku do następujących szczepów bakterii: Staphylococcus aureus NCTC 4163, Pseudomonas aeruginosa NCTC 6749, Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas phaseolicola (Burkholder, Dowson), Pseudomonas syringae pv. Lachrymans (Smith et Bryah) Carsher, Erwinia carotovora subsp. atroseptica (van Hall), Dye oraz następujących grzybów pleśniowych: Aspergillus Niger (van Tieghem), Trichoderma viride (Pers ex Fries), Penicillium funiculosum (Thom), Scopulariopsis brevicalis [(Sacc.) Bain var. Glabra Thom], Penicillium ochrochloron (Biourge), Paecilomyces varioti (Bainier). Badanie wykonano metodą krążków bibułowych. Krążki bibuły o średnicy 1 cm zamaczano w roztworze acetonowym ekstraktu z kurek, a następnie suszono w komorze laminarnej w temperaturze pokojowej w celu odparowania acetonu. W próbie kontrolnej krążek bibuły zanurzono w acetonie i wysuszano. Suche krążki wykładano na płytki Petriego ze stałym podłożem odżywczym (nutrient agar dla bakterii i Sabeuraud agar dla drożdży i grzybów) zaszczepionym poszczególnymi szczepami testowymi. Płytki inkubowano w temperaturze 37 C dla bakterii ludzkich oraz 25 C dla bakterii roślinnych przez 48 godzin i w temperaturze 29 C dla grzybów przez 5 dni. Następnie mierzono średnice stref zahamowania wzrostu szczepów testowych. Wielkość strefy jest proporcjonalna do siły działania próbki. W Tabeli 2 i Tabeli 3 zestawiono rezultaty badania działania owadobójczego ekstraktów przedstawionych w Tabeli 1 w stosunku do muchy domowej i karaczana wschodniego. Działanie ekstraktów z użytych czterech cieczy jonowych było silniejsze niż ekstraktu octanowego. Najsilniej działał ekstrakt otrzymany przy użyciu salicylanu 1-nonyloksymetyloimidazoliowego. Stwierdzono silne działanie tego ekstraktu nawet w dawce 0,5 μl/osobnika. W Tabeli 4 zestawiono wyniki wskazujące na działanie ekstraktów z kurki Cantharellus cibarius wobec bakterii i drożdży, a w tabeli 5 wobec grzybów pleśniowych. T a b e l a 1 Lp Ekstrahent Masa ekstraktu [g] Nr ekstraktu 1 [MPIM] [BF 4 ] 0,1 I 2 [dbm] [BF 4 ] 0,7 II 3 [HNM] [Salicylan] 3,0 III 4 [DDA] [NO 3 ] 0,1 IV 5 octan etylu 2,3 V T a b e l a 2 Działanie ekstraktów na muchę domową Nr ekstraktu Śmiertelność much po 24 h w % Śmiertelność much po 48h w % 5 μ 3 μl 1 μl 0,5 μl 5 μl 3 μl 1 μl 0,5 μl I - 100 75 10-95 80 5 II 100 100* 63,3 10 100 100* 53,3 20 III 100 100 100 96,7 100 100 100 93,3 IV 100 100 33,3 0 100 100 30 3,3 V 100 60 10-100 55 10 - *Zastosowana dawka 2 μl/osobnika
PL 211 466 B1 5 Nr ekstraktu T a b e l a 3 Działanie ekstraktów z kurek na karaczana wschodniego Śmiertelność po 24 godz. w % Śmiertelność po 48 godz. w % 3 μl 1 μl 05 μl 3 μl 1 μl 0,5 μl I 100 100 80 100 100 80 II 100* 100 95 100* 100 95 III 100 100 85 100 100 85 IV 100 100 70 100 100 60 V 90 70-90 70 - Zastosowana dawka 2 μl/osobnika T a b e l a 4 Działanie ekstraktu z kurek na bakterie i drożdże Średnica strefy zahamowania wzrostu w mm Nr ekstraktu S. aureus P. aeruginosa B. subtilis P. phaseolicola P. syringae pv. lachrymans E. carotovora subsp. aroseptica I 15 15 20 25 20 15 10 II 10 10 15 20 15 15 0 III 50 40 40 60 50 55 30 IV 45 30 40 55 50 50 30 V 40 30 35 40 40 45 25 C. albicans Nr ekstraktu T a b e l a 5 Działanie ekstraktów z kurek na grzyby pleśniowe Średnica strefy zahamowania wzrostu w mm S. brevicalis P. ochrochloron P. varioti A. niger T. viride P. funiculosum I 30 30 15 0 20 20 II 25 20 0 0 0 10 III 70 70 30 15 60 40 IV 60 60 30 0 35 20 V 65 70 20 0 50 30 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania ekstraktu z kurki Cantharellus cibarius na drodze ekstrakcji, znamienny tym, że proces ekstrakcji prowadzi się za pomocą cieczy jonowej imidazoliowej lub amoniowej, w temperaturze od 20 C do 50 C, w czasie od 1 godziny do 5 godzin, a następnie ekstrakt przemywa się niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z cieczą jonową i rozpuszczalnik ewentualnie usuwa się. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako ciecz jonową stosuje się tetrafluoroboran 1-metylo-3-pentyloksymetyloimidazoliowy [MPIM][BF 4 ] lub tetrafluoroboran 1,3-dibutoksymetyloimidazoliowy [dbim][bf 4 ] lub salicylan 1-nonyloksymetyloimidazoliowy [HNIM][Salicylan] lub azotan(v) didecylodimetyloamoniowy [DDA][NO 3 ] 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się kurki w postaci wysuszonej. 4. Sposób według zastrz. 1 i 3, znamienny tym, że stosuje się kurki w postaci sproszkowanej.
6 PL 211 466 B1 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się heksan i/lub heptan i/lub oktan. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczalnik organiczny usuwa się na drodze destylacji. 7. Ekstrakt z kurki Cantharellus cibarius, znamienny tym, że stanowi go ekstrakt uzyskany na drodze ekstrakcji cieczą jonową imidazoliowa lub amoniową, w temperaturze od 20 C do 50 C w czasie od 1 godziny do 5 godzin, a następnie wydzielony za pomocą niepolarnego rozpuszczalnika organicznego. 8. Ekstrakt według zastrz. 7, znamienny tym, że ciecz jonowa jest wybrana z tetrafluoroboranu 1-metylo-3-pentyloksymetyloimidazoliowego [MPIM][BF 4 ] lub tetrafluoroboranu 1,3-dibutoksymetyloimidazoliowego [dbim][bf 4 ] lub salicylanu 1-nonyloksymetyloimidazoliowego [HNIM][Salicylan] lub azotanu(v) didecylodimetyloamoniowego [DDA][NO 3 ]. 9. Ekstrakt według zastrz. 7, znamienny tym, że stanowi go ekstrakt wydzielony za pomocą heksanu i/lub heptanu i/lub oktanu. 10. Zastosowanie ekstraktu z kurki Cantharellus cibarius, otrzymanego sposobem określonym w zastrzeżeniu 1 jako środka o działaniu owadobójczym i/lub grzybobójczym i/lub bakteriobójczym. Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)