PL B1. INSTYTUT PRZEMYSŁU ORGANICZNEGO, Warszawa, PL BUP 01/12

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. A61K 36/57 ( ) A61P 31/04 ( ) A61P 31/10 ( ) A01N 65/08 ( ) A01P 1/00 ( ) A01P 3/00 ( ) (54) Sposób otrzymywania ekstraktu z nasion gałki muszkatołowej i zastosowanie ekstraktu (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 01/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/16 (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT PRZEMYSŁU ORGANICZNEGO, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: ANNA CIENIECKA-ROSŁONKIEWICZ, Warszawa, PL ALICJA MICHALCZYK, Warszawa, PL JERZY KAZIMIERCZAK, Warszawa, PL JULIUSZ PERNAK, Poznań, PL KATARZYNA MATERNA, Czapury, PL AGNIESZKA ŁYSIK, Warszawa, PL

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania ekstraktu z nasion gałki muszkatołowej Myristica fragrans i zastosowanie tego ekstraktu. Muszkatołowiec wonny (Myristica fragrans) to tropikalne, wiecznie zielone dwupienne drzewo, występujące głównie w rejonie Indonezji i Sri Lanki. Nasiona muszkatołowca, powszechnie zwane gałką muszkatołową, stanowią źródło cennej aromatycznej przyprawy, a olejki i ekstrakty z nich uzyskane wykazują liczne właściwości biologiczne. Roślina wytwarza różnorodne aktywne metabolity wtórne, między innymi: mirystycynę, safrol, kwas mirystynowy, trimirystynę, eugenol, związki terpenowe i lignanowe, które decydują o jej właściwościach antybakteryjnych. Wiele przykładów wskazujących na bakteriobójcze działanie ekstraktów z gałki muszkatołowej oraz związków z nich izolowanych można znaleźć w literaturze. Ekstrakt z gałki muszkatołowej otrzymany za pomocą eteru naftowego wykazuje znaczną aktywność w stosunku do patogenów bakteryjnych powodujących zatrucia pokarmowe Shigella i Escherichia coli (Minakshi De, Amit Krishna De, A. B. Banerjee. Anti-microbial screening of some Indian spices. Phytotherapy Research 13, 7, ). Ekstrakt chloroformowy z gałki oraz wyodrębnione z niego trimirystyna, kwas mirystynowy i mirystycyna, wykazują działanie w stosunku do Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Microcooccus luteus, Pseudomonas aeruginosa (Narasimhan B., Dhake A.S., Antibacterial Principles from M. fragrans seeds, Journal of Medicinal Food 9(3), , 2006). Skuteczność bakteriobójczą w stosunku do Salmonella typhi wykazuje ekstrakt metanolowy z gałki (Cragg G.M., Newmann D.J., Yang S.S.. Natural product extracts of plant and marine origin having anti-leukemia potential. J. Nat. Prod. 69, , 2006). Stwierdzono ponadto, że w ekstrakcji związków aktywnych biologicznie z gałki dobrze sprawdza się ciekły CO 2 w stanie nadkrytycznym (Spricigo C.B., Pinto L.T., Bolzan A., Novais A.F., Extraction of essential oil and lipids from nutmeg by liquid carbon dioxide, J. Supercrit. Fluids 15, ,1999), stanowiący alternatywę dla rozpuszczalników organicznych. Celem wynalazku było uzyskanie ekstraktów z gałki muszkatołowej, które zawierają bogatszą gamę substancji aktywnych oraz wykazują większą skuteczność bakteriobójczą i drożdżobójczą niż ekstrakty otrzymane za pomocą konwencjonalnych rozpuszczalników organicznych. Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania ekstraktu z Myristica fragrans, w którym nasiona traktuje się cieczą jonową wybraną spośród: mleczanu benzalkoniowego [BA][C 3 H 5 O 3 ], mleczanu didecylodimetyloamoniowego [DDA][C 3 H 5 O 3 ], azotanu benzalkoniowego [BA][NO 3 ] lub azotanu didecylodimetyloamoniowego [DDA][NO] 3, w temperaturze od 15 do 30 C, w czasie od 2 do 4 godzin. Uzyskany ekstrakt w cieczy jonowej oddziela się od stałej pozostałości, ekstrakt przemywa się niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym, który nie miesza się z cieczą jonową, a następnie z roztworu w rozpuszczalniku organicznym rozpuszczalnik usuwa się na drodze destylacji. Korzystnie ciecz jonową z materiałem roślinnym miesza się w czasie procesu ekstrakcji. Korzystnie ekstrakcję cieczą jonową wspomaga się ultradźwiękami, najkorzystniej w czasie od 10 do 30 minut. Korzystnie do procesu ekstrakcji używa się nasion Myristica fragrans w postaci wysuszonej i sproszkowanej. Korzystnie jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się rozpuszczalnik organiczny niemieszający się z cieczą jonową, korzystnie węglowodór lub ester, najkorzystniej heksan, heptan, oktan, benzen, toluen lub octan etylu. Wynalazek dotyczy również zastosowania ekstraktu z nasion Myristica fragrans otrzymanego sposobem według wynalazku do wytwarzania środka o działaniu bakteriobójczym i drożdżobójczym. Korzystnie ekstrakt stosuje się do wytwarzania środka do zwalczania patogenów bakteryjnych wywołujących choroby zwierząt, ludzi, psucie się żywności oraz choroby roślin. Szczególnie korzystnie ekstrakt według wynalazku stosuje się do wytwarzania środka do zwalczania Paenibacillus larvae powodującego zgnilca u pszczół. Ciecze jonowe zastosowane do ekstrakcji związków o charakterze bakteriobójczym i drożdżobójczym z wysuszonych nasion Myristica fragrans inaczej penetrują tkanki rośliny niż rozpuszczalniki organiczne. Właściwości cieczy jonowych, a przede wszystkim ich wysoka polarność, decydują o rozpuszczaniu niektórych produktów pochodzenia naturalnego, które są nierozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych. Zastosowane ultradźwięki wywołują zjawisko kawitacji, które powoduje znaczny wzrost ciśnienia rozpuszczalnika, co przyspiesza zarówno jego wnikanie w głąb materiału roślinnego, jak i uwalnianie substancji poprzez rozrywanie ścian komórkowych. Ekstrakcja cieczą

3 PL B1 3 jonową, zwłaszcza wspomagana ultradźwiękami, prowadzi zatem do uzyskania ekstraktów o innym składzie chemicznym i odmiennych właściwościach biologicznych niż ekstrakty uzyskane przy zastosowaniu rozpuszczalników organicznych. Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach wykonania. P r z y k ł a d 1 Ekstrakcja L-mleczanem benzalkoniowym, [BA][C 3 H 5 O 3 ] [BA][C 3 H 5 O 3 ], umieszcza w łaźni ultradźwiękowej na 20 minut, a następnie miesza przez 3 godziny Otrzymuje się 1,31 g ekstraktu I. P r z y k ł a d 2 Ekstrakcja L-mleczanem didecylodimetyloamoniowym, [DDA][C 3 H 5 O 3 ] [DDA][C 3 H 5 O 3 ], umieszcza w łaźni ultradźwiękowej na 20 minut, a następnie miesza przez 3 godziny Otrzymuje się 0,77 g ekstraktu II. P r z y k ł a d 3 Ekstrakcja azotanem benzalkoniowym, [BA][NO 3 ] [BA][NO 3 ], umieszcza w łaźni ultradźwiękowej na 20 minut, a następnie miesza przez 3 godziny Otrzymuje się 0,81 g ekstraktu III. P r z y k ł a d 4 Ekstrakcja azotanem didecylodimetyloamoniowym, [DDA][NO 3 ] [DDA][NO 3 ], umieszcza w łaźni ultradźwiękowej na 20 minut, a następnie miesza przez 3 godziny Otrzymuje się 0,91 g ekstraktu IV. P r z y k ł a d 5, p o r ó w n a w c z y Ekstrakcja octanem etylu Wysuszone i rozdrobnione nasiona gałki muszkatołowej w ilości 25 g zalewa się dwukrotną objętością octanu etylu, umieszcza w łaźni ultradźwiękowej na 20 minut, a następnie miesza przez 3 godziny w temperaturze 20 C. Odsącza się stałą pozostałość, zaś z przesączu przy użyciu wyparki próżniowej octan etylu odparowuje się do sucha i uzyskuje 2,52 g ekstraktu V. P r z y k ł a d 6, p o r ó w n a w c z y Ekstrakcja heksanem Wysuszone i rozdrobnione nasiona gałki muszkatołowej w ilości 25 g zalewa się trzykrotną objętością heksanu, umieszcza w łaźni ultradźwiękowej na 20 minut, a następnie miesza przez 3 godziny w temperaturze 20 C. Odsącza się stałą pozostałość, zaś z przesączu przy użyciu wyparki próżniowej heksan odparowuje się do sucha i uzyskuje 3,05 g ekstraktu VI. P r z y k ł a d 7 Badania biologiczne Działanie ekstraktów uzyskanych z gałki muszkatołowej badano w stosunku do szczepów bakterii patogennych dla ludzi (Micrococcus luteus NCTC 7743, Staphylococcus aureus NCTC4163, Staphylococcus epidermidis ATCC 49134, Enterococcus faecium ATCC 49474, Moraxella catarhalis ATCC 25238, Escherichia coli ATCC 25922, Seratia marcescens ATCC 8100, Proteus vulgaris NCTC 4635, Pseudomonas aeruginosa NCTC 6749, Bacillus subtilis ATCC 6633), a także bakterii powodujących choroby roślin: (Pseudomonas lachrymans (Smith and Bryan) Carsner, Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Pseudomonas phaseolicola (Burkholder) Dowson i pszczół (Paenibcillus larvae subsp. larvae (White 1906) Ash et al emend. Genersch et al. 2006). Ponadto zbadano skuteczność ekstraktów w stosunku do drożdży Candida albicans (Robin) Berkhout ATCC i Rhodotorula rubra (Demme) Lodder, ATCC

4 4 PL B1 Badanie wykonano metodą krążkowo-dyfuzyjną. Krążki bibuły o średnicy 10 mm zamoczono w acetonowych roztworach ekstraktów z gałki muszkatołowej, a następnie suszono w komorze laminarnej w celu odparowania acetonu. Wysuszone krążki układano na podłożu agarowym (Triptic Soy Agar dla bakterii, Saburaud dla drożdży) zaszczepionym poszczególnymi szczepami testowymi. Płytki inkubowano w temperaturze 37 C w przypadku bakterii patogennych dla ludzi i pszczół, 48 godz. w temperaturze 25 C w przypadku bakterii roślinnych oraz 48 godz. w temperaturze 29 C w przypadku drożdży. Po inkubacji mierzono średnicę stref zahamowania wzrostu szczepów testowych przyjmując, że wielkość uzyskanych stref jest proporcjonalna do siły działania ekstraktów. W tabeli 1 zestawiono wyniki wskazujące na działanie ekstraktów z gałki muszkatołowej na bakterie, powodujące choroby ludzi i pszczół, w tabeli 2 wobec drożdży. Wyniki skuteczności ekstraktów w stosunku do bakterii patogennych dla roślin przedstawiono w tabeli 3. Stwierdzono, że ekstrakty: heksanowy (VI), octanowy (V) oraz azotanowy (III) nie wykazywały działania bakteriobójczego i drożdżobójczego. Najsilniejsze działanie bakteriobójcze i drożdżobójcze wykazał ekstrakt (I) z gałki wykonany za pomocą L-mleczanu benzalkoniowego. Działanie ekstraktów (II i IV) wykonanych mleczanem didecylodimetyloamoniowym oraz azotanem didecylodimetyloamoniowym było tego samego rzędu i nieco słabsze od działania ekstraktu (I). Najszersze spektrum działania bakteriobójczego i drożdżobójczego wykazał ekstrakt (I) z gałki uzyskany za pomocą L-mleczanu benzalkoniowego. T a b e l a 1 Działanie ekstraktów z gałki muszkatołowej na bakterie ludzkie i Paenibacillus larvae Średnica strefy zahamowania wzrostu [mm] Szczep testowy Badany ekstrakt I II III IV V VI 1. Micrococcus luteus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Moraxella catarhalis Escherichia coli Seratia marcescens 7. Enterococcus faecium Proteus vulgaris 9. Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Paenibacillus larvae brak strefy zahamowania wzrostu

5 PL B1 5 T a b e l a 2 Działanie ekstraktów z gałki muszkatołowej na drożdże Średnica strefy zahamowania wzrostu [mm] Szczep testowy Badany ekstrakt I II III IV V VI 1. Candida albicans Rhodotorula rubra brak strefy zahamowania wzrostu T a b e l a 3 Działanie ekstraktów z gałki muszkatołowej na bakterie roślinne Średnica strefy zahamowania wzrostu [mm] Szczep testowy Badany ekstrakt I II III IV V VI 1. Erwinia carotovora Pseudomonas lachrymans Pseudomonas phaseolicola 15 brak strefy zahamowania wzrostu Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania ekstraktu z Myristica fragrans, w którym nasiona Myristica fragrans traktuje się pierwszym rozpuszczalnikiem, uzyskany ekstrakt oddziela się od stałej pozostałości i przemywa się niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym, który nie miesza się z pierwszym rozpuszczalnikiem, a następnie z roztworu w rozpuszczalniku organicznym rozpuszczalnik usuwa się na drodze destylacji, znamienny tym, że jako pierwszy rozpuszczalnik stosuje się ciecz jonową wybraną spośród: mleczanu benzalkoniowego [BA][C 3 H 5 O 3 ], mleczanu didecylodimetyloamoniowego [DDA][C 3 H 5 O 3 ], azotanu benzalkoniowego [BA][NO 3 ] lub azotanu didecylodimetyloamoniowego [DDA][NO 3 ], a ekstrakcję cieczą jonową prowadzi się w temperaturze od 15 do 30 C, w czasie od 2 do 4 godzin. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ciecz jonową z materiałem roślinnym miesza się w czasie procesu ekstrakcji. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że ekstrakcję cieczą jonową wspomaga się ultradźwiękami. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że ultradźwięki stosuje się w czasie od 10 do 30 minut. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że do procesu ekstrakcji używa się nasion w postaci wysuszonej i sproszkowanej. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się węglowodór lub ester. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako węglowodór stosuje się heksan, heptan, oktan, benzen, toluen.

6 6 PL B1 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako ester stosuje się octan etylu. 9. Zastosowanie ekstraktu z nasion Myristica fragrans uzyskanego na drodze ekstrakcji cieczą jonową sposobem określonym w zastrzeżeniu 1 do wytwarzania środka o działaniu bakteriobójczym i drożdżobójczym. 10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że ekstrakt stosuje się do wytwarzania środka do zwalczania patogenów bakteryjnych wywołujących choroby zwierząt, ludzi, psucie się żywności oraz choroby roślin. 11. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że ekstrakt stosuje się do wytwarzania środka do zwalczania Paenibacillus larvae powodującego zgnilca u pszczół. Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)