PL B1. INSTYTUT PRZEMYSŁU ORGANICZNEGO, Warszawa, PL BUP 23/08

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. A01N 43/78 ( ) A01N 43/72 ( ) A01P 3/00 ( ) (54) Zastosowanie cymiazolu i jego soli do zwalczania grzybów u pszczół (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT PRZEMYSŁU ORGANICZNEGO, Warszawa, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 23/08 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/10 (72) Twórca(y) wynalazku: WIESŁAW LONDZIN, Zabrze, PL ANNA CIENIECKA-ROSŁONKIEWICZ, Warszawa, PL JERZY KAZIMIERCZAK, Warszawa, PL AGNIESZKA SAS, Warszawa, PL ZBIGNIEW GOLUBSKI, Wrocław, PL ZDZISŁAW ZIENIEWICZ, Wrocław, PL BOGUMIŁA HURAS, Warszawa, PL PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie cymiazolu i jego soli do zwalczania grzybów u pszczół, w szczególności wywołujących grzybicę wapienną. Grzybica wapienna pszczół jest chorobą dziesiątkującą te owady. Powoduje ją zakażenie grzybem Ascophaera apis. Choroba osłabia rodziny pszczele, zmniejsza produkcję pasieczną, powoduje zwiększenie podatności zachorowania na inne choroby, np. zwiększenie podatności na warrozę, nosemozę i in. Z kolei wymienione choroby ułatwiają zachorowalność na grzybicę. Chorobie sprzyja zły stan higieny ula wywołany np. słabym instynktem czyszczenia ula, warunki klimatyczne, błędy w hodowli np. późne dokarmianie, które powoduje zwiększenie wilgotności gniazda i in. Do zwalczania grzybicy u pszczół stosowano antybiotyki, takie jak, nystatyna, amfoterycyna B, polifungina, kwasy organiczne np. kwas octowy, kwas mrówkowy, kwas sorbowy, kwas cytrynowy. Znana jest pochodna tiomocznika - cymiazol (2-(2',4'-dimetylofenyloimino)-3-metylotiazolina). Cymiazol uzyskuje się w wyniku syntezy przedstawionej w niemieckim opisie patentowym DE Z opisu patentowego US znane jest zastosowanie cymiazolu i jego soli addycyjnych z kwasami do zwalczania roztoczy, w szczególności Varroa destrucor. Pasożyt ten powoduje chorobę pszczół - warrozę. Pasożyt uszkadza pancerz owada, co powoduje stany zapalne, zakażenia i śmierć pszczoły. Varroa destructor stanowi poważne zagrożenie dla pszczół. Zakażone i nieleczone rodziny pszczele są osłabione, wytwarzają mniej miodu i innych produktów. Często giną całe pasieki, gdyż pasożyt przenosi się do nowych rodzin. W badaniach nad cymiazolem i jego solami prowadzonych przez twórców wynalazku stwierdzono niespodziewanie, że sole cymiazolu wykazują działanie statyczne i bójcze wobec grzybów. Istotą wynalazku jest zastosowanie 2-(2',4'-dimetylofenyloimino)-3-metylotiazoliny (cymiazolu) lub jego soli do zwalczania grzybów u pszczół. Korzystnie jako sole cymiazolu stosuje się sole z kwasem borowym, sole z kwasami karboksylowymi lub sole mieszane z kwasem borowym i kwasami karboksylowymi. Korzystnie jako kwasy karboksylowe stosuje się kwas szczawiowy, kwas cytrynowy, kwas salicylowy. Korzystnie jako sól cymiazolu stosuje się sól mieszaną z kwasem borowym i kwasem szczawiowym. Korzystnie cymiazol lub jego sole podaje się pszczołom w roztworze cukru w czasie dokarmiania. Korzystnie stężenie cymiazolu lub jego soli w roztworze cukru do dokarmiania wynosi od 0,01% do 1,0%. Korzystnie cymiazol lub jego sole stosuje się do zwalczania grzyba Ascophaera apis. W testach in vitro na wyizolowanych z ula szczepach grzyba Ascophaera apis sól cymiazolu z kwasem borowym lub z kwasem szczawiowym wykazuje działanie statyczne, a w przypadku mieszanej soli z kwasem szczawiowym i kwasem borowym działanie bójcze. Wyniki tych badań zestawiono w przykładach. Sole cymiazolu z kwasem borowym i kwasami karboksylowymi charakteryzuje stosunkowo niska toksyczność zapewniającą bezpieczne stosowanie w higienie pasiecznej. Zaletą zastosowania proponowanych soli jest możliwość podawania w czasie tradycyjnego i powszechnego dokarmiania pszczół przy użyciu roztworu cukru. Zabieg leczniczy lub profilaktyczny stosuje się wówczas w czasie dokarmiania. Zważywszy, że cymiazol i jego sole są stosowane w zwalczaniu roztoczy korzystnym efektem wynalazku jest możliwość jednoczesnego zwalczania grzybów i roztoczy i zapobiegania jednocześnie dwóm wymienionym chorobom wyniszczającym pasieki. Metodą wygodną i tanią w czasie jednego zabiegu można stosować ten sam środek leczniczy wykazujący zdolność zwalczania grzybicy i warrozy lub spełniający rolę środka profilaktycznego wobec grzybicy i warrozy. Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach. P r z y k ł a d 1 Przygotowanie roztworu bazowego boranu cymiazolu Przygotowano roztwór bazowy z następujących składników: cymiazol techniczny (o zawartości 95,0%) z własnej syntezy - 0,05 g - 10% roztwór kwasu borowego w glicerynie - 2,5 ml - etanol - 2,5 ml. Roztwór ten dodawano do syropu w ilości 2,2 ml na 1 litr syropu cukru buraczanego (1:1) w celu podawania pszczołom w czasie ich dokarmiania.

3 PL B1 3 W ulach zakażonych grzybem Ascophera Apis po 4 tygodniach stosowania nie obserwowano objawów grzybicy. P r z y k ł a d 2 Badania aktywności przeciwgrzybowej in vitro Badanie wykonano cylinderkową metodą rozcieńczeń w agarze. Oznaczono minimalne stężenie hamujące wzrost grzyba (MIC) oraz minimalne stężenie bójcze (MFC), które ten grzyb zabija. Pożywkę zawierającą określone stężenie badanego związku rozlewa się do płytek Petriego i po zestaleniu wycina się korkoborem otwór o średnicy 5 mm. Kontrole stanowią płytki zawierające samą pożywkę lub pożywkę z dodatkiem rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia związku. Do otworu inkorporuje się cylinderek wycięty korkoborem z homogennej kultury grzyba wyhodowanego na płytce Petriego (inokulum). Wyniki odczytuje się po 6 dniach inkubacji w temperaturze 25 C. Za wartość MIC przyjmuje się stężenie związku ograniczającego wzrost grzyba do 7 mm tj. 2 mm poza średnicę inkorporowanego inolkulum. Inokula grzyba uznane za negatywne (brak wzrostu) w teście MIC inkorporuje się do świeżej pożywki bez dodatku związku i inkubuje się w temperaturze 25 C przez 6 dni. Jako wartość MFC przyjmuje się stężenie związku powodujące całkowity brak wzrostu grzyba. Wyniki badań przedstawiono w tabeli 1. Wyniki badania aktywności przeciwgrzybicznej wobec Ascophaera apis Badany roztwór Średnica koloni grzyba w mm cymiazol 1% 10 cymiazol 0,5% 16 cymiazol 0,25% 32 cymiazol 0,12% 50 cymiazol 0,06% >60 10% kwas borowy - roztwór wodny 21 10% roztwór kwasu borowego w glicerynie 35 etanol 96% 35 Gliceryna >60 Mieszanina: cymiazol (0,05 g), 10% roztwór kwasu borowego w glicerynie (2,5 ml), etanol (2,5 ml) Działanie boranu cymiazolu na Ascophaera apis jest silniejsze od działania cymiazolu. Żaden związek nie zabija grzyba, a jedynie hamuje jego wzrost - działanie statyczne. Wynik > 60 mm średnica grzybni oznacza całkowity brak działania. Roztwór kwasu borowego przyhamowuje wzrost grzybni. Podobne jest działanie etanolu. Gliceryna nie ma wpływu na wzrost grzyba. Najsilniejsze działanie wykazuje mieszanina tworząca boran cymiazolu, grzyb zostaje zabity. Po przełożeniu cylinderków agarowych do świeżej pożywki grzyb nie odrasta. P r z y k ł a d 3 Wytwarzanie szczawianu cymiazolu 75,0 g (0,34 mola) cymiazolu technicznego (o zawartości 95,0% cymiazolu, uzyskanego we własnej syntezy) rozpuszczono w 400 ml acetonu, dodano 42,8 g (0,34 mola) kwasu szczawiowego (Aldrich) i we wrzeniu ogrzewano w czasie 30 minut. Po oziębieniu odsączono osad, który przemywano acetonem. Po wysuszeniu uzyskano 72,1 g osadu o barwie białej i temperaturze topnienia C. Widma IR i NMR potwierdziły budowę soli cymiazolu z kwasem szczawiowym. P r z y k ł a d 4 Przygotowanie roztworu bazowego 10,0 g szczawianu cymiazolu uzyskanego sposobem opisanym w przykładzie 3 rozpuszczono w 100 ml wody uzyskując roztwór bazowy o stężeniu 10% szczawianu cymiazolu. Wartość LD 50 szczawianu cymiazolu, po podaniu drogą pokarmową wynosiła 82,6 μg/pszczołę. 7

4 4 PL B1 P r z y k ł a d 5 Badania aktywności przeciwgrzybowej in vitro Badanie wykonano cylinderkową metodą rozcieńczeń w agarze. Oznaczono minimalne stężenie hamujące wzrost grzyba (MIC) oraz minimalne stężenie bójcze (MFC), które ten grzyb zabija. Pożywkę zawierającą określone stężenie badanego związku rozlewa się do płytek Petriego i po zestaleniu wycina się korborem otwór o średnicy 5 mm. Kontrole stanowią płytki zawierające samą pożywkę lub pożywkę z dodatkiem rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia związku. Do otworu inkorporuje się cylinderek wycięty korkoborem z homogennej kultury grzyba wyhodowanego na płytce Petriego (inokulum). Wyniki odczytuje się po 6 dniach inkubacji w temperaturze 25 C. Za wartość MIC przyjmuje się stężenie związku ograniczającego wzrost grzyba do 7 mm tj. 2 mm poza średnicę inkorporowanego inolkulum. Inokula grzyba uznane za negatywne (brak wzrostu) w teście MIC inkorporuje się do świeżej pożywki bez dodatku związku i inkubuje się w temperaturze 25 C przez 6 dni. Jako wartość MFC przyjmuje się stężenie związku powodujące całkowity brak wzrostu grzyba. Wyniki badań przedstawiono w tabelach 2 i 3. Wyniki badania aktywności przeciwgrzybicznej wobec Ascophaera apis Badany roztwór Średnica koloni grzyba w mm cymiazol 1% 10 cymiazol 0,5% 16 cymiazol 0,25% 32 cymiazol 0,12% 50 cymiazol 0,06% >60 Szczawian cymiazolu 1% 5 Szczawian cymiazolu 0,5% 5 Szczawian cymiazolu 0,25% 6 Szczawian cymiazolu 0,12% 25 Szczawian cymiazolu 0,06% >60 T a b e l a 3 Wartości najmniejszego stężenia hamującego (MIC) i najmniejszego stężenia bójczego (MFC) Związek badany MIC MFC cymiazol >1% >1% szczawian cymiazolu 0,25% >1% Działanie szczawianu cymiazolu na Ascophaera apis jest silniejsze od cymiazolu. Żaden związek nie zabija grzyba, a jedynie hamuje jego wzrost - działanie statyczne. Wynik >60 mm średnica grzybni oznacza całkowity brak działania. P r z y k ł a d 6 Badanie skuteczności przeciwko grzybicy i warrozie 3 ml roztworu bazowego według przykładu 1 dodano do 1,0 litra roztworu cukru odpowiedniego do podawania pszczołom w celu dokarmiania (1:1). Badania prowadzono w dwóch pasiekach. W pierwszej z nich położonej w północno-zachodniej Polsce osypy pasożyta oceniano po każdym z 6 tygodni w trzech ulach (przy średnim porażeniu - osyp pasożytów). W drugiej z nich położonej w południowo-zachodniej Polsce osypy pasożyta oceniano po 6 tygodniach w pięciu ulach (przy bardzo dużym porażeniu - osyp powyżej 2000 pasożytów). Jako preparat odniesienia (skuteczność 100%) zastosowano paski Apifos produkcji Biowet- Puławy zgodnie z instrukcją producenta. We wszystkich ulach podawanych testowi z boranem cymiazolu nie stwierdzono objawów grzybicy po okresie zimowania, pomimo obserwowania takich objawów przed dokarmianiem. Objawy grzybicy pozostały w ulach gdzie zastosowano Apifos. Uzyskane wyniki w postaci średnich wartości przedstawiono w tabeli 4.

5 PL B1 5 Substancja aktywna Szczawian cymiazolu Boran cymiazolu roztwór etanolowo- -glicerynowy Mieszanina szczawianu i boranu cymiazolu -roztwór wodno-glicerynowy T a b e l a 4 Skuteczność soli cymiazolu przeciwko warrozie u pszczół Dawkowanie, na 1 litr roztworu cukru 0,3 g szczawianu cymiazolu 2,2 ml roztworu zawierającego 0,087 g/ 1 ml 3,4 ml roztworu zawierającego 0,0530 g/ 1 ml Ilość cymiazolu / 1 litr roztworu cukru Skuteczność działania [%] 0,189 g 89,1 0,191 g 98,1 0,180 g 98,8 10% roztwór kwasu borowego w glicerynie 3,4 ml 67,6 Apifos kontrola 2 paski /μl 100,0 P r z y k ł a d 7 Badanie toksyczności soli cymiazolu wobec pszczół Porównanie toksyczności ostrej pokarmowej dla pszczół ocenianych preparatów- wartości LD 50 podano w μg/pszczołę. T a b e l a 5 Toksyczność soli cymiazolu Badana substancja/ zawartość cymiazolu w preparacie LD 50 preparatu LD 50 s.b.c. Etanolowo-glicerynowy roztwór boranu cymiazolu - 0,087 g cymiazolu/ 1 ml preparatu > 1015 > 100 Wodno-glicerynowy roztwór mieszaniny boranu i szczawianu cymiazolu (1:1) - - 0,053 g/ 1 ml preparatu > 164,5 > 100 Szczawian cymiazolu 0,63 g/lg preparatu 82,6 130,6 Wodny roztwór cytrynianu cymiazolu, 0,083 g/ Iml preparatu >1045 >100 Etanolowy roztwór salicylanu cymiazolu -0,084g/ 1 ml preparatu >83,9 >100 Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie cymiazolu lub jego soli do zwalczania grzybów u pszczół. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że jako sole cymiazolu stosuje się sole z kwasem borowym, sole z kwasami karboksylowymi lub sole mieszane z kwasem borowym i kwasami karboksylowymi. 3. Zastosowanie według zastrz. 1 lub 2, znamienne tym, że jako kwasy karboksylowe stosuje się kwas szczawiowy, kwas cytrynowy, kwas salicylowy. 4. Zastosowanie według zastrz. 1 lub 2, znamienne tym, że jako sól cymiazolu stosuje się sól mieszaną z kwasem borowym i kwasem szczawiowym. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że cymiazol lub jego sole podaje się pszczołom w roztworze cukru w czasie dokarmiania. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że stężenie cymiazolu lub jego soli w roztworze cukru do dokarmiania wynosi od 0,01% do 1,0%. 7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że cymiazol lub jego sole stosuje się do zwalczania grzyba Ascophaera

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,00 zł.