(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/SI94/00010

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) O P IS P A T E N T O W Y (19) P L (11) ( 2 1 ) N u m e r z g ł o s z e n ia : (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/SI94/00010 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO94/29292, PCT Gazette nr 28/94 (13) B1 (51) IntCl6: C07D 309/30 A61K 31/365 (54) Sposób izolowania lowastatyny (30) Pierwszeństwo: , SI.P (73) Uprawniony z patentu: KRKA tovarna zdravil, p.o., Novo mesto, SI (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 06/96 (72) Twórcy wynalazku: Pavica Hajko, Novo mesto, SI Tanja Vesel, Novo mesto, SI Ivan Radez, Novo mesto, SI Miroslav Pokorny, Novo mesto, SI (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/00 (74) Pełnomocnik: Dehnel Zofia, POLSERVICE PL B1 (57) 1. Sposób izolowania lowastatyny, znamienny tym, że lowastatynę ekstrahuje się z pożywki fermentacyjnej, grzybni lub przesączu drobnoustroju zdolnego do wytwarzania lowastatyny, za pomocą octanu butylowego, uzyskany roztwór lowastatyny w octanie butylowym zagęszcza się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze powyżej 40 C i pozostawia do krystalizacji. Zw iązek I Zw iązek I I

2 Sposób izolowania lowastatyny Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób izolowania lowastatyny, znamienny tym, że lowastatynę ekstrahuje się z pożywki fermentacyjnej, grzybni lub przesączu drobnoustroju zdolnego do wytwarzania lowastatyny, za pomocą octanu butylowego, uzyskany roztwór lowastatyny w octanie butylowym zagęszcza się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze powyżej 40 C i pozostawia do krystalizacji. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że drobnoustrój zdolny do wytwarzania lowastatyny stanowi grzyb. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że grzyb należy do rodzaju Aspergillus. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że grzyb należy do rodzaju Aspergillus terreus lub Aspergillus oryzae. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że grzyb stanowi Aspergillus terreus (ATCC 20542) lub Aspergillus oryzae(atcc 74135). * * * Wynalazek należy do dziedziny biotechnologii; przedmiotem jego jest sposób izolowania lowastatyny, substancji obniżającej poziom lipidów w surowicy krwi, z pożywki fermentacyjnej. Lowastatynę wytwarza się jako metabolit wtórny grzyba Aspergillus terreus (US ), zdeponowanego w Amerykańskim Zbiorze Typów Hodowli pod numerami ATCC 20541, ATCC 20542, i Monascus ruber, zdeponowanego w Agencji Nauki i Technologii Przemysłowej Instytutu Badań nad Fermentacją Ministerstwa Handlu Zagranicznego i Przemysłu, Japonia (DE Al), pod numerem Ferm Znane są również inne rodzaje drobnoustrojów wytwarzających lowastatynę, np. mutant drobnoustroju Aspergillus terreus i Aspergillus oryzae, oznaczony jako ATCC Lowastatyna chemicznie stanowi 5-lakton kwasu 1', 2',6', 7', 8a'-sześciowodoro-3,5-dwuhydroksy-2', 6'-dwumetylo-8'-2"-metylo-1"-oksobutoksy)-1-naftalenoheptanowego (Stubbs i wsp., 1986), o wzorze (EP A1) Związek I Czynną postacią lowastatyny jest również kwas, który chemicznie stanowi kwas 1,2,6,8,8a-sześciowodoro- β,δ-dwuhydroksy-1-naftalenoheptanowy (Alberts i wsp., 1980) o wzorze (EP A1)

3 Laktanową postać lowastatyny stosuje się jako środek obniżający poziom cholesterolu we krwi (Scott M.G. i Vega G.L., 1985). Hamuje on biosyntezę kwasu mewalonowego poprzez hamowanie reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzymu A (reduktazy HMG-CoA, E.C ) (Zubay i wsp., 1984). Po zakończeniu fermentacji, w pożywce znajduje się lowastatyna w postaci laktonu (związek I) i w postaci kwasu (związek II). W procesie izolacji, opisanym w EP A2, lowastatynę ekstrahuje się z pożywki, stosując octan etylowy. Wyciąg zagęszcza się poprzez destylację próżniową. Ponieważ lowastatyna jest obecna zarówno w postaci laktonu, jak i w postaci kwasu, a tylko lakton nadaje się do zastosowania handlowego, postać kwasu należy przeprowadzić w lakton. Laktonizację prowadzi się stosując powrót koncentratu w toluenie w temperaturze 106 C przez 2 godziny. Po zakończeniu laktonizacji roztwór zagęszcza się do niewielkiej objętości. Substancję chemiczną otrzymuje się, oczyszczając koncentrat na kolumnach wypełnionych silikażelem, w obecności rozpuszczalników, takich jak octan etylowy lub n-heksan. Uzyskane frakcje zagęszcza się ponownie w próżni, po czym czysta lowastatyna krystalizuje w postaci laktonu. Z powodu znacznego stopnia komplikacji tego wieloetapowego procesu i konieczności zachowania rygorystycznych warunków w czasie izolowania, wydajność wytwarzania lowastatyny jest na ogół niewielka. Stosuje się różne rozpuszczalniki, takie jak benzen, toluen, acetonitryl lub octan etylowy, z których niektóre wykazują toksyczność; tak więc praca z tymi rozpuszczalnikami jest szkodliwa dla zdrowia personelu, jak również dla środowiska. Celem niniejszego wynalazku jest uniknięcie powyższych ograniczeń, znanych ze stanu techniki, i opracowanie skutecznego i opłacalnego sposobu izolowania lowastatyny. Ponadto należy podkreślić znaczenie ochrony zdrowia personelu i ochrony środowiska. W wyniku intensywnych badań autorzy niniejszego wynalazku stwierdzili, że lowastatynę można łatwo izolować, ekstrahując lowastatynę z próbki z zastosowaniem octanu butylowego, zagęszczając roztwór i przeprowadzając krystalizację. W korzystnym wykonaniu, zagęszczanie roztworu przeprowadza się pod zmniejszonym ciśnieniem. W innym korzystnym wykonaniu, zagęszczanie przeprowadza się w temperaturze powyżej 40 C pod ciśnieniem zmniejszonym lub też pod ciśnieniem normalnym. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, próbka lowastatyny pochodzi z drobnoustrojów, korzystnie, z grzyba zdolnego do wytwarzania lowastatyny. W tym przypadku próbkę może stanowić pożywka fermentacyjna, w której wzrasta, odpowiednio, drobnoustrój lub grzyb, grzybnia grzyba lub przesącz. Można stosować bez ograniczeń dowolny grzyb zdolny do wytwarzania lowastatyny, przy czym korzystne są grzyby należące do rodzaju Aspergillus, korzystnie, Aspergillus oryzae lub Aspergillus terreus.

4 W innym korzystnym wykonaniu grzyb stanowi Aspergillus terreus (ATCC 20542) lub Aspergillus oryzae (ATCC 74135). Zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku, lowastatynę otrzymuje się wyłącznie w postaci laktonu. Stwierdzono, że stosowany rozpuszczalnik, to znaczy octan butylowy, wykazuje cechy umożliwiające osiągnięcie tego celu. A mianowicie, w procesie laktonizacji następuje wydzielenie wody, którą należy usunąć ze środowiska reakcji. Ponieważ octan butylowy ma wyższą temperaturę wrzenia i w zasadzie nie tworzy mieszanin azeotropowych z wodą w danych warunkach, możliwe jest usunięcie w zasadzie całej objętości wody powstałej w procesie laktonizacji. Zastosowanie sposobu według niniejszego wynalazku umożliwia istotne skrócenie czasu izolowania lowastatyny. Jako że octan butylowy stosuje się do ekstrahowania lowastatyny z próbki, a jednocześnie do przeprowadzania laktonizacji, unika się toksycznego wpływu innych rozpuszczalników. Sposób ten można stosować w przemyśle, osiągając końcową całkowitą wydajność wynoszącą około 60%, niezależnie od tego, czy lowastatyna wytwarzana jest przez drobnoustroje wewnątrz-, czy zewnątrzkomórkowo, w postaci laktonu czy w postaci kwasu. Wyizolowana substancja jest identyczna z substancją wyizolowaną w procesach znanych ze stanu techniki. Jej strukturę potwierdzono poprzez spektroskopię w podczerwieni (fig. 1), spektroskopię masową (fig. 2), NMR (fig. 3) oraz spektroskopię w ultrafiolecie (fig. 4). Wynalazek zilustrowano następującymi, nie ograniczającymi przykładami. Przykład 1. Pożywkę fermentacyjną(1 000 ml) uzyskaną poprzez fermentację Aspergillus terreus (ATCC 20542) lub Aspergillus oryzae (ATCC 74135), o wartości ph równej 4,8, wieku 120 godzin i zawartości lowastatyny wynoszącej 300 μg/ml (lakton + kwas) zakwaszono HCl (36%) aż do uzyskania wartości ph wynoszącej 3-5. Pożywkę fermentacyjną schłodzono następnie do temperatury poniżej 20 C, dodano octan butylowy (500 ml) i mieszaninę ekstrahowano w tej temperaturze przez 4 godziny. Po zakończeniu ekstrakcji mieszaninę odwirowano i oddzielono fazę wodną i organiczną. Grzybnie i fazę wodną odrzucono, a fazę organiczną poddano dalszym procesom. Zagęszczono ją poprzez destylację próżniową w temperaturze powyżej 40 C do objętości 50 ml. Równolegle z zagęszczaniem zachodził proces laktonizacji. Koncentrat schłodzono następnie do temperatury poniżej 20 C i pozostawiono na kilka godzin, tak że doszło do krystalizacji lowastatyny. Otrzymany produkt surowy poddano powtórnej krystalizacji. Uzyskano lowastatynę (170 mg) w postaci laktonu, przy czym czystość produktu wynosiła powyżej 90%. Przykład 2. Pożywkę fermentacyjną(1 000 ml) uzyskaną poprzez fermentację Aspergillus terreus (ATCC 20542) lub Aspergillus oryzae (ATCC 74135), o wartości ph równej 4,73, wieku 120 godzin i zawartości lowastatyny wynoszącej 190 (μg/ml (lakton + kwas) w przesączu i 15 μg/ml w grzybni, zakwaszono HCl (36%) aż do uzyskania wartości ph wynoszącej 3-5. Pożywkę przefiltrowano na filtrze Oliver. Grzybnię odrzucono, przesącz schłodzono do temperatury poniżej 20 C i dodano połowę objętości octanu butylowego. Ekstrakcję prowadzono przez 1 godzinę, po czym postępowano jak w przykładzie 1. Uzyskano lowastatynę (79 mg) w postaci laktonu, przy czym czystość produktu wynosiła powyżej 90%. Przykład3. Pożywkę fermentacyjną (1000 ml) uzyskaną poprzez fermentację Aspergillus terreus (ATCC 20542) lub Aspergillus oryzae (ATCC 74135), o wartości ph równej 4,78, wieku 120 godzin i zawartości lowastatyny wynoszącej 5 μg/ml (lakton + kwas) w przesączu i 300 μg/ml w grzybni, zakwaszono HCl (36%) aż do uzyskania wartości ph wynoszącej 3-5 i odwirowano. Przesącz odrzucono, do grzybni dodano 4-krotną objętość octanu butylowego i mieszaninę schłodzono do temperatury poniżej 20 C. Ekstrakcję prowadzono przez 4 godziny. Po ekstrakcji przeprowadzono odwirowanie, grzybnię odrzucono, a przesącz poddano dalszym procesom, jak w przykładzie 1. Uzyskano lowastatynę (90 mg) w postaci laktonu, przy czym czystość produktu wynosiła powyżej 90%.

5 FIG. 1

6 FIG. 2

7 Fig. 3

8 Fig. 4 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 2,00 zł.