RZECZPOSPOLITA POLSKA (1 2 ) OPIS PATENTOWY ( 1 9 ) PL (1 1 ) 177676 (1 3 ) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 308427 (22) Data zgłoszenia: 29.04.1995 ( 5 1 ) IntCl6: C07C 401/00 A61K 31/59 A 6 1 K 7/40 Nowe analogi witamin D, (54) sposób ich wytwarzania i zawierające je środki farmaceutyczne i kosmetyczne ( 7 3 ) Uprawniony z patentu: Instytut Farmaceutyczny, Warszawa, PL ( 4 3 ) Zgłoszenie ogłoszono: 12.11.1996 BUP 23/96 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.12.1999 WUP 12/99 (72) Twórcy wynalazku: Andrzej Kutner, Warszawa, PL Wanda Wojciechowska, Warszawa, PL Johannes Sebastian Halkes, Amerfort, NL Jan-Paul Van de Velde, Hoofdorp, NL (74) Pełnomocnik: Krzywdzińska Ewa, Instytut Farmaceutyczny PL 177676 B1 1. Nowe analogi witamin D o wzorze ogólnym 1, w którym ( 57) R1oznacza grupę hydroksylową, R2 oznacza atom wodoru, R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-G4, A i B tworzą razem grupę metylenową, X oznacza grupę -CH2-, a n jest równe 2. 4. Sposób wytwarzania nowych analogów witamin D o wzorze ogólnym 1, w którym R 1 oznacza grapę hydroksylową, R 2 oznacza atom wodoru, R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-C4, A i B tworzą razem grupę metylenową, X oznacza grapę -CH2-, a n jest równe 2, znamienny tym, że pochodną estrową o wzorze ogólnym 2, w którym R 1' i R4 oznacza gru p ę... 5. Nowe analogi witamin D o wzorze ogólnym 2, w którym R 1' i R4 oznacza grupę eterosililową, R2 oznacza atom wodoru, R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-C4, A i B tworzą razem grapę metylenową, X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, a R5 oznacza grupę alkilową C1-C6. 6. Sposób otrzymywania związku o wzorze ogólnym 2, w którym R1' i R4 oznacza grupę eterosililową, alkoksylową, R2 oznacza atom wodoru, A i B tworzą razem grupę metylenową, X oznacza grupę -CH2, n jest równe 2, a R5 oznacza grupę alkilową C1-C6, znamienny tym, że związek o wzorz e ogólnym 10, w którym R1' i R4 oznacza... 7. Środek farmaceutyczny, zawierajmy znane, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako składnik czynny zawiera analog witamin D... 8. Środek kosmetyczny, zawierający znane nośniki i substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako składnik... Wzór 1 Wzór 2 Wzór 11 Wzór 10 Wzór 13
Nowe analogi witamin D, sposób ich wytwarzania i zawierające je środki farmaceutyczne i kosmetyczne Zastrzeżenia patentowe 1. Nowe analogi witamin D o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza grupę hydroksylową, R 2 oznacza atom wodoru, R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-C4, A i B tworzą razem grupę metylenową, X oznacza grupę -CH2-, a n jest równe 2. 2. Nowe analogi witamin D o wzorze ogólnym 1 według zastrz. 1, w którym R1oznacza grupę hydroksylową, R2 oznacza wodór, R3 oznacza grupę metylową, etylową lub izopropylową, X oznacza -CH2-, A i B tworzą razem grupę metylenową, a n jest równe 2. 3. Nowy analog witamin D według zastrz. 2, w którym we wzorze ogólnym 1 R 1 oznacza grupę hydroksylową, R2 oznacza atom wodoru, R3 oznacza grupę metylową, X oznacza -CH2-, A i B tworzą razem grupę metylenową, a n jest równe 2, to jest (5Z, 7E)-(1S, 3R)-9,10-seko-24a,24b-dihomo-(24aE)-dehydro-5,7,10(19),24a-cholestatetraen-1,3,25-triol. 4. Sposób wytwarzania nowych analogów witamin D o wzorze ogólnym 1, w którym R 1 oznacza grupę hydroksylową R2 oznacza atom wodoru, R 3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C 1-C4, A i B tworzą razem grupę metylenową X oznacza grupę -CH2-, a n jest równe 2, znam ienny tym, że pochodną estrową o wzorze ogólnym 2, w którym R 1 i R4 oznacza grupę eterosililową alkoksylową R2 oznacza atom wodoru, R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-C4, A i B tworzą razem grupę metylenową X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, a R5 oznacza grupę alkilową C 1-C6, poddaje się reakcji ze związkiem metaloorganicznym o wzorze ogólnym R 3 M(X)p, w którym R 3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-C4, X oznacza Cl, Br lub I, M oznacza metal wybrany z Li i Mg, a p zależnie od wartościowości M jest równe 0 lub 1, po czym odbezpiecza się grupy hydroksylowe. 5. Nowe analogi witamin D o wzorze ogólnym 2, w którym R 1 i R 4 oznacza grupę eterosililową R2 oznacza atom wodoru, R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-C4, A i B tworzą razem grupę metylenową, X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, a R 5 oznacza grupę alkilową C 1-C6. 6. Sposób otrzymywania związku o wzorze ogólnym 2, w którym R 1i R4 oznacza grupę eterosililową alkoksylową R2 oznacza atom wodoru, A i B tworzą razem grupę metylenową X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, a R5 oznacza grupę alkilową C1-C6, znam ienny tym, że związek o wzorze ogólnym 1 0, w którym R 1i R4 oznacza grupę eterosililową, alkoksylową lub eteroalicykliczną A i B tworzą razem grupę metylenową X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, a R 5 oznacza grupę alkilową C1-C6 poddaje się reakcji ze środkiem redukującym, po czym tak otrzymany związek o wzorze ogólnym 11, w którym R 1i R 4 oznacza grupę eterosililow ą alkoksylową A i B tworzą razem grupę metylenową X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze ogólnym 13, w którym R 5 oznacza grupę alkilową C1-C6 7. Środek farmaceutyczny, zawierający znane, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i substancje pomocnicze, znam ienny tym, że jako składnik czynny zawiera analog witamin D o wzorze ogólnym 1, w którym R1oznacza grupę hydroksylową R2 oznacza atom wodoru, R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C 1-C4, A i B tworzą razem grupę metylenow ą X oznacza grupę -CH2-, a n jest równy 2. 8. Środek kosmetyczny, zawierający znane nośniki i substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako składnik czynny zawiera analog witamin D o wzorze ogólnym 1, w którym R 1 oznacza grupę hydroksylową R2 oznacza atom wodoru, R3 oznacza rozgałęzioną lub
177 676 3 prostą grupę alkilową C1-C4, A i B tworzą razem grupę metylenową, X oznacza grupę -CH2-, a n jest równe 2. * * * Przedmiotem wynalazku są nowe analogi witamin D, sposób wytwarzania nowych analogów witamin D oraz zawierające je środki farmaceutyczne i kosmetyczne. Nowe związki według wynalazku posiadają zdolność wiązania się z receptorem 1,25(OH)2D3 (VDR) i w związku z tym działają antyproliferacyjnie i m ogą znaleźć zastosowanie w leczeniu nowotworów złośliwych i innych stanów zaburzeń wzrostu komórek, takich jak na przykład łuszczyca. Wiadomo jest, że aktywne formy (metabolity) witaminy D3, w tym 1,25-dihydro-ksycholekalcyferol (calcitriol) pobudzają różnicowanie komórek oraz ham ują proliferację komórkową in vitro. Wywierają one również wpływ na komórkową transkrypcję onkogenu oraz na ekspresję receptora czynnika wzrostu in vivo i w ten sposób mogą oddziaływać na komórki nowotworowe. Tak więc ich rola w leczeniu nowotworów polega na stymulowaniu przekształcania komórek zmienionych nowotworowo w komórki zdrowotne, a nie na niszczeniu, jak jest w przypadku innych związków o działaniu przeciwnowotworowym, na przykład cytostatyków. Wiadomo jest również, że aktywność tych związków związana jest z ich oddziaływaniem z receptorem VDR obecnym, w większości guzów nowotworowych sutka. Odkrycia te dały asumpt do podejmowania poszukiwań nowych analogów i metabolitów witaminy D 3 oraz badań nad ich rolą i efektywnością w leczeniu nowotworów złośliwych oraz w innych stanach zaburzenia wzrostu komórek, takich jak łuszczyca. Zarówno 1,25-dihydroksycholekalcyferol jak i jego analogi oprócz czynności antyproliferacyjnej posiadają również wpływ na metabolizm wapnia w ustroju. W związku z tym podawanie tych związków w ilościach leczących choroby proliferacyjne może prowadzić do zaburzeń metabolizmu wapnia i hiperkalcemii. Ponadto biodostępność znanych analogów 1,25-dihydroksycholekalcyferolu jest słaba, co ogranicza ich stosowanie w terapii systemicznej. istnieje zatem potrzeba poszukiwania nowych analogów 1,25-dihydroksycholekalcyferolu, charakteryzujących się co najmniej równie wysoką, a korzystnie znacznie w yższą aktywnością antyproliferacyjną co 1,25-dihydroksycholekalcyferol, ale mających niższą toksyczność i słabsze oddziaływanie na metabolizm wapnia, co pozwoliłoby na uniknięcie poważnych działań ubocznych i umożliwiłoby zastosowanie ich w leczeniu. Pożądane z punktu widzenia możliwości zastosowania w terapii jest także, aby nowe analogi charakteryzowały się wysoką biodostępnością. Ze stanu techniki znane są związki-analogi witamin D o przedłużonym łańcuchu bocznym (związki homo). I tak na przykład z polskiego opisu patentowego nr 162 542 znane są nowe analogi 1,25-dihydroksycholekalcyferolu: (24E)-24-dehydro-24,24-dihomo-1,25-dihydroksycholekalcyferol oraz (24S)- i (24R)-20,20-dihomo-l,25-dihydroksyergocholekalcyferol o przewidywanej aktywności antyproliferacyjnej, mające wiązanie podwójne przesunięte z naturalnej pozycji C-22 do pozycji C-24. Jednakże nie uzyskano w ten sposób oczekiwanej selektywności działania. Celem wynalazku jest uzyskanie nowej klasy analogów witamin D o selektywnym działaniu antyproliferacyjnym, które ponadto mogą być łatwo otrzymywane z powszechnie dostępnych materiałów wyjściowych. Obecnie okazało się, że aktywnością biologiczną charakteryzują się nowe analogi witamin D według wynalazku, posiadające przesunięte w stosunku do analogów znanych z polskiego opisu patentowego nr 162 542 wiązanie podwójne w łańcuchu bocznym cząsteczki i zmodyfikowany łańcuch boczny.
4 177 676 Istotą wynalazku są nowe analogi witamin D o wzorze ogólnym 1, w którym oznacza grupę hydroksylową, R 2 oznacza atom wodoru, R 3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C 1-C4 A i B tworzą razem grupę metylenową, X oznacza grupę -CH2-, a n jest równe 2. W korzystnej postaci nowe analogi witamin D są przedstawione wzorem ogólnym 1, w którym R1 oznacza grupę hydroksylową R2 oznacza wodór, R3 oznacza grupę metylową, etylową lub izopropylową, X oznacza -CH2-, A i B tworzą razem grupę metylową a n jest równe 2. Szczególnie korzystnym analogiem witamin D jest związek o wzorze ogólnym 1, w którym R 1 oznacza grupę hydroksylową, R2 oznacza atom wodoru, R 3 oznacza grupę metylową, X oznacza -CH2, A i B tw orzą razem grupę metylową, a n jest równe 2, to jest (5Z, 7E)-(1S, 3R)-9,10-seko-24a,24b-dihomo-(24aE)-dehydro-5,7,10(19),24a-cholestatetraen-1,3,25-triol. Również korzystnym analogiem witamin D jest związek o wzorze ogólnym 1, w którym R 1oznacza grupę hydroksylową R 2 oznacza atom wodoru, R 3 oznacza grupę etylową X oznacza -CH2-, A i B tworzą razem grupę metylenową, a n jest równe 2, to jest (5Z, 7E)-(1 S,3R)-9,10-seko-24a,24b,26,27-tetrahom o-(24ae)-dehydro-5,7,10( 19),24a-cholestatetraen-1,3,25-triol. Jak wykazały badania biologiczne, nowe związki według wynalazku posiadają zdolność wiązania się z receptorem VDR i związaną z tym czynność antyproliferacyjną. W porównaniu z pochodnymi (24E)-24,24a-dehydro-24,24-dihomo, znanymi z polskiego opisu patentowego nr 162 542 mają znacznie silniejsze działanie biologiczne. Mogą znaleźć zastosowanie jako substancje czynne leków przeznaczonych do leczenia nowotworów, w szczególności nowotworów złośliwych, takich jak na przykład przerzutowy rak sutka lub białaczki, oraz leczenia chorób skóry związanych z nienormalną proliferacją i/lub różnicowaniem, takich jak pewne postacie łuszczycy, keratozy i podobne. M ogą być także zastosowane w leczeniu chorób kości, takich jak osteoporoza, chorób autoimmunologicznych, trądzika, łysienia, starzenia skóry, chorób zapalnych takich jak artretyzm reumatoidalny i astma. Ponadto nowe analogi witamin D według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie do leczenia ran oraz jako składniki kompozycji kosmetycznych, takich jak kremy, maści, toniki i podobne, do konserwacji, kondycjonowania i/lub zabezpieczania skóry oraz do ulepszania pewnych stanów skóry takich jak zmarszczki, suchość skóry, wiotczenie skóry i niedostateczna sekrecja łoju. Szczególną cechą związków według wynalazku jest możliwość otrzymywania ich z łatwo dostępnych związków wyjściowych. W szczególności stwierdzono, że przyłączenie odpowiedniego podstawnika do C-25 można łatwo osiągnąć wychodząc z łatwo dostępnego związku estrowego. Wynalazek dotyczy zatem sposobu wytwarzania nowych analogów witamin D o wzorze ogólnym 1, w którym R1oznacza grupę hydroksylową, R 2 oznacza atom wodoru, R 3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-C4, A i B tworzą razem grupę metylenową, X oznacza grupę -CH2-, a n jest równe 2, polegającego na tym, że pochodną estrową o wzorze ogólnym 2, w którym R 1i R 4oznacza grupę eterosililową, alkoksylową R2 oznacza atom wodoru, R 3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-C4, A i B tworzą razem grupę metylenową, X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, a R 5 oznacza grupę alkilową C1-C6, poddaje się reakcji ze związkiem metaloorganicznym o wzorze ogólnym R 3 M(X)p, w którym R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-C4, X oznacza Cl, Br lub I, M oznacza metal wybrany z Li i Mg, a p zależnie od wartościowości M jest równe 0 lub 1, po czym odbezpiecza się grupy hydroksylowe. Przykładem odpowiednich związków metaloorganicznych o powyższym wzorze R 3 M(X) są związki litu, takie jak izopropylolit, cyklopropylolit i etylolit oraz reagenty Grignarda, takie jak chlorek izopropylomagnezowy, chlorek cyklopropylomagnezowy i chlorek metylomagnezowy, jak również odpowiadające bromki i jodki.
177 676 5 Analogi witamin D według wynalazku m ogą być także otrzymane wychodząc z ugrupowania pierścienia CD z gotowym łańcuchem bocznym przy C-17, a następnie sprzężenie z pierścieniem A w taki sposób, że tworzy się pożądany układ dienowy lub trienowy. Sposób wytwarzania nowych analogów witamin D o wzorze ogólnym 1, w którym R 1 oznacza grupę hydroksylową, R2 oznacza atom wodoru, R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-C4, A i B tworzą razem grupę metylenową, X oznacza grupę -CH2-, a n jest równe 2, polega na tym, że pochodną estrową o wzorze ogólnym 3, w którym R 2 oznacza atom wodoru, X oznacza grupę -CH2- i n jest równe 2, R 4 oznacza grupę eterosililową alkoksylową lub eteroalicykliczną, a R 5 oznacza grupę alkilową C1-C6, poddaje się reakcji ze związkiem metaloorganicznym o wzorze ogólnym R 3 M (X )p, w którym R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-C4, X oznacza Cl, Br lub I, M oznacza metal wybrany z Li i Mg, a p zależnie od wartości M jest równe 0 lub 1, po czym otrzymany związek hydrindanowy i wzorze ogólnym 4, w którym R 2 oznacza atom wodoru, X oznacza grupę -CH2- i n jest równe 2, R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C 1-C4, R 4 oznacza grupę eterosililową, alkoksylową, R 5 oznacza grupę alkilową C1-C6, odbezpiecza się, jeśli R 4 jest zabezpieczoną grupą hydroksylową, a następnie utlenia się do odpowiadającej pochodnej hydrindan-4-onu o wzorze ogólnym 5, w którym R2 oznacza atom wodoru, X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, R 3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-C4, który po zabezpieczeniu w razie potrzeby grupy hydroksylowej poddaje się reakcji albo z reagentem Wittiga o wzorze ogólnym 6, w którym R1oznacza atom wodoru, A i B razem stanowią grupę metylenową, R 4 oznacza grupę hydroksylową, albo po enolizacji i derywatyzacji enolowej grupy hydroksylowej reakcji ze związkiem enylowym o wzorze ogólnym 7, w którym R 4 oznacza grupę hydroksylową, R 1 oznacza atom wodoru, po czym uwodornia się i izomeryzuje, otrzymując związek o wzorze 1, w którym A i B tworzą razem grupę metylenową, a następnie odbezpiecza się. Grupy hydroksylowe w związkach wyjściowych lub reagentach m ogą być zabezpieczone przez reakcję z odpowiednim czynnikiem estryfikującym lub eteryfikującym. Jako grupy zabezpieczające stosuje się typowe eterowe grupy zabezpieczające, jak grupy sililowe, alkilowe lub alicykliczne. W celu zabezpieczenia przeprowadza się eteryfikację grupy hydroksylowej za pomocą odczynników eteryfikujących, którymi mogą być na przykład halogenki trialkilosililowe, halogenki difenyloalkilosililowe, trifluorometanosulfoniany trialkilosililowe, trifluorometanosulfoniany difenyloalkilosililowe, trialkilosililoimidazol i podobne, typowo stosowane w chemii witamin D. Szczególnie korzystnie jako grupę zabezpieczającą stosuje się grupę tert-butylodimetylosililową, którą wprowadza się przez eteryfikację chlorkiem tert-butylodimetylosililowym, trifluorometanosulfonianem tert-butylodimetylosililowym lub trimetylosililoimidazolem. Odpowiednim czynnikiem estryfikującym jest na przykład chlorowęglan alkilu, mający od 2 do 5 atomów węgla, lub kwas karboksylowy aromatyczny lub nasycony alifatyczny mający 1 do 4 atomów węgla, na przykład kwas benzoesowy, lub pochodna takiego kwasu odpowiednia do reakcji estryfikacji. Enolową grupę hydroksylową w enolizowanym związku o wzorze 5 korzystnie derywatyzuje się przez reakcję z N-fenylotriflimidem z wytworzeniem triflatu (trifuorometanosulfonianu). Pochodną hydrindan-4-onu o wzorze 5 otrzymuje się przez utlenianie związku hydrindanowego o wzorze 4 za pomocą czynnika utleniającego, korzystnie wybranego z utleniaczy zawierających chrom, takich jak chlorochromian pirydyniowy lub dichromian pirydyniowy oraz tetratlenku rutenu. Wynalazek obejmuje także analogi witamin D o wzorze ogólnym 2, w którym R 1 i R4 oznacza grupę eterosililową, R2 oznacza atom wodoru, A i B tworzą razem grupę metylenową, X oznacza grupę -CH2-, a n jest równe 2, a R 5 oznacza grupę alkilową C 1-C6, które są także związkami nowymi, będące związkami pośrednimi do wytwarzania związków o wzorze 1.
6 177 676 Wynalazek dotyczy zatem także sposobu otrzymywania nowych związków o wzorze 2. Zgodnie z pierwszym sposobem według wynalazku związek o wzorze ogólnym 2, w którym R1i R4 oznacza grupę eterosililową, alkoksylową, R2 oznacza atom wodoru, A i B razem tworzą grupę metylenową, X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, a R 5 oznacza grupę alkilową C 1-C6, otrzymuje się przez reakcję związku estrowego o wzorze ogólnym 8, w którym R2 oznacza atom wodoru, X oznacza grupę -CH2- i n jest równe 2, R2 oznacza wodór, R5 oznacza grupę alkilową C1-C6, a R 6 oznacza derywatyzowaną grupę hydroksylową ze związkiem enynowym o wzorze ogólnym 7, w którym R 4 i R 1 oznacza grupę eterosililową alkoksylową a następnie uwodornienie i izomeryzację. Reakcję korzystnie prowadzi się dwuetapowo, to jest najpierw poddając reakcji oba reagenty w obecności zasady organicznej, takiej jak trietyloamina, w obecności katalizatora palladowego takiego jak (PPh3 )2 PdCl2, a następnie poddając otrzymany produkt uwodornieniu wodorem wobec odpowiedniego katalizatora, takiego jak katalizator Lindlara (PdO na CaCO3, z domieszką rtęci), po czym prowadzi izomeryzację otrzymanej struktury prewitaminowej do struktury wiaminowej o wzorze ogólnym 2. Alternatywnie analog witamin D o wzorze ogólnym 2, w którym R1 i R 4 oznacza grupę eterosililową alkoksylową R2 oznacza atom wodoru, A i B razem tworzą grupę metylenową, X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, a R 5 oznacza grupę alkilową C1-C6, otrzymuje się przez reakcję zmodyfikowanego ketonu Windausa-Grundmana o wzorze ogólnym 9, w którym R2 oznacza atom wodoru, X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, a R 5 oznacza grupę alkilową C 1-C6, z reagentem Wittiga o wzorze ogólnym 6, w którym R 1 i R 4 oznacza grupę eterosililową alkoksylową lub eteroalicykliczną a A i B tworzą razem grupę metylenową. Również alternatywnie analog witamin D o wzorze ogólnym 2, w którym R 1 i R4 oznacza grupę eterosililową alkoksylową R2 oznacza atom wodoru, A i B razem tworzą grupę metylenową X oznacza grupę -CH2- i n jest równe 2, a R 5 oznacza grupę alkilową C 1-C6, otrzymuje się przez reakcję związku o wzorze ogólnym 10, w którym R 1 i R 4 oznacza grupę eterosililową alkoksylową R2 oznacza atom wodoru, A i B razem tworzą grupę metylenową X oznacza grupę -CH2-, i n jest równe 2, a R 5 oznacza grupę alkilową C1-C6, ze środkiem redukującym, po czym tak otrzymany związek o wzorze ogólnym 1 1, w którym R 1oznacza grupę eterosililową, alkoksylową R2 oznacza atom wodoru, A i B razem tworzą grupę metylenową X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, R4 oznacza grupę hydroksylową a R 5 oznacza grupę alkilową C 1-C6, poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze ogólnym 12, w którym R 2 oznacza atom wodoru i R 5 oznacza grupę alkilową C 1-C6, podstawnik R 7 jest wybrany z grupy składającej się z rozgałęzionej lub prostej grupy C1-C4 alkoksylowej, fenoksylowej, fenylowej lub di(c1-c4 )alkiloaminowej, q jest równe 0. Redukcję związku o wzorze 10 można prowadzić za pomocą wodorku glinoorganicznego, jak wodorek diizobutyloglinowy. Związki wyjściowe o wzorze 10 m ogą być dogodnie otrzymane z łatwo dostępnych substancji. Na przykład w przypadku syntezy analogu witamin D o wzorze 1, w którym X=CH2, n=2 a A i B tworzą razem grupę metylenową wychodzi się z łatwo dostępnego odpowiedniego estru kwasu 1-hydroksy-6-metoksy-3,5-cyklo-9,10-seko-25-homo-7,10(19)-choladienowego, prowadząc cyklorewersję katalizowaną kwasem octowym i następnie fotoizomeryzację w sposób opisany przez T. Ryznar w Acta Pol. Pharm. 1988, 45(3), 214-18 oraz w patencie USA nr 4260549. Również alternatywnie związek o wzorze ogólnym 2, w którym R 1 i R 4 oznacza grupę eterosililową alkoksylową R2 oznacza atom wodoru, A i B razem tworzą grupę metylenową X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, a R 5 oznacza grupę alkilową C 1-C6, otrzymuje się przez reakcję związku o wzorze ogólnym 10, w którym R 1i R4 oznacza grupę eterosililową alkoksylową A i B razem tworzą grupę metylenową X oznacza grupę -CH2-, n jest równe 2, a R5 oznacza grupę alkilową C 1-C6, ze środkiem redukującym, po czym tak otrzymany związek o wzorze ogólnym 11, w którym R 1 i R4 oznacza grupę eterosililową alkoksylową A i B razem tworzą grupę metylenową X oznacza grupę -CH2- i n jest równe 2, poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze ogólnym 13, w którym R 5 oznacza grupę alkilow ą C 1-C6.
177 676 7 Reakcję Wittiga związku o wzorze 11, w której następuje przedłużenie łańcucha węglowodorowego o dwa atomy węgla przeprowadza się w standardowych warunkach reakcji Wittiga, to jest w rozpuszczalniku eterowym, takim jak na przykład tetrahydrofuran, w temperaturze pokojowej. Typowym, reagentem jest etoksykarbonylometylenotrifenylofosforan. Wynalazek obejmuje także środek farmaceutyczny oraz środek kosmetyczny, zawierający znane, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i substancje pomocnicze, który jako składnik czynny zawiera analog witamin D o wzorze ogólnym 1, w którym R 1 oznacza grupę hydroksylową, R2 oznacza atom wodoru, R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę alkilową C1-C4, A i B tworzą razem grupę metylenową, X oznacza grupę -CH2-, a n jest równe 2. Szczególnie korzystnie środek według wynalazku zaw iera jako składnik czynny (5Z,7E)-(1 S,3R)-9,10-seko-24a,24b-dihomo-(24aE)-dehydro-5,7,10(19),24a-cholestatetraen-l,3,25-triol. Również szczególnie korzystnie środek według wynalazku zawiera jako składnik czynny (5Z, 7E)-(1S, 3R)-9,10-seko-24a, 24b,26,27-tetrahomo-(24aE)-dehydro-5,7,10(19),24a-cholestatetraen-1,3,25-triol. Oprócz składnika czynnego środek według wynalazku zawiera znane, dopuszczalne farmaceutycznie lub dopuszczalne kosmetycznie podłoża, nośniki i/lub środki pomocnicze, dobrane zależnie od drogi podawania środka. Środek według wynalazku może być sporządzany w postaci przeznaczonej do podawania doustnego, jak tabletki, kapsułki, tabletki powlekane, tabletki dojelitowe, postaci odpowiedniej do podawania miejscowego, jak kremy, maści, żele, toniki lub postaci odpowiedniej do podawania pozajelitowego. Poniższe przykłady ilustrują wynalazek bez ograniczania go. Przebieg reakcji zilustrowano ponadto na załączonym schemacie. Przykład I. (5Z, 7E)-(1S, 3R)-9,10-seko-24a,24b-dihomo-(24aE)-5,7,10(19), 24acholestatetraen-1,3,25-triol (wzór 20) A) Ester metylowy kwasu (5 Z,7 E )-( 1 S, 3R)-1,3-dihydroksy-9,10-seko- 24a-homo-5,7,10(19)-cholatrien-24-owego (wzór 15). Do roztworu 1,8 g (3,9 mmola) estru metylowego kwasu (5Z, 7E)-(1S, 3R)-l-acetoksy-3-hydroksy-9,10-seko-24a-homo-5,7,10(19)-cholatrien-24-owego (wzór 14, otrzymany sposobem opisanym przez T. Ryznar w Acta Pol Pharm. 1988, 45(3), 214-18) w 108 ml THF dodano 108 ml 0,1 N metanolowego roztworu KOH. Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 3h do całkowitego zaniku substratu. Mieszaninę zobojętniono przez dodanie 10 ml 1N HCl. Po usunięciu rozpuszczalników i ekstrakcji octanem etylu otrzymano 1,57 g (96% wydajności) związku tytułowego w postaci bezbarwnego oleju. IR (CHC13): 3450, 2950, 2 8 9 0, 1705 cm-1; 1H NMR (CDCl3 ) (ppm): 0,54 (3H, s, 18-CH3 ), 3,66 (3H, s, -COOCH3), 4,17 (1H, m, 3-H), 4,40 (1H, m, 1-H), 4,99 (1H, s, 19Z-H), 5,32 (1H, s, 19E-H), 6,04 (br d, J=11Hz, 7-H), 6,35 (br d, J=11Hz, 6 -H). B) Ester metylowy kwasu(5z, 7E)-(1S, 3R)-l,3-bis[(t-butylo-dimetylosililo)oksy]-9,10-seko-24a-hom o-5,7,10( 19)-cholatrien-24-owego (w zór 16). Do roztworu 1,5 g (3,6 mmola) dihydroksyestru otrzymanego w sposób opisany powyżej w 10 ml DMF dodano 1,3 g (22,8 mmola) imidazolu i 1,3 g (8,7 mmola) chlorku t-butylodimetylosililowego. Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 2,5h do zaniku substratu. Po ekstrakcji mieszaniną heksan - octan etylu 4:1 i sączeniu przez żel krzemionkowy otrzymanie 2,15 g (93% wydajności) disililowanego estru tytułowego w postaci bezbarwnego oleju. λmax264,8 nm (heksan); IR (CHCl3): 2950,2860,1705 cm-1; 1H NMR (CDCl3) (ppm): 0,06 (12H, bs, Si-CH3), 0,53 (3H, s, 18-CH3), 0,87 (18H, bs, C-CH3), 3,66 (3H, s, -COOCH3), 4,17 (1H, m, 3-H), 4,4 (1H, m, 1-H), 4,86 (1H, bs,
8 177 676 Jgem= 1,8 Hz, 19Z-H), 5,18 (1H, bs, Jgem= l,8 Hz, 19E-H), 6,02 (br d, J=11Hz, 7-H), 6,35 (br d, J= 11Hz, 6 -H). C) (5Z,7E)-(lS,3R)-l,3-Bis[(t-butylodim etylosililo)oksy]-9,10-seko-24a-homo-5,7,10(19)-cholatrien-24a-al (wzór 17). Do roztworu 500 mg (0,77 mmoli) disililowanego estru otrzymanego jak wyżej w 2,5 ml toluenu, ochłodzonego do -70C, pod argonem, dodano kroplami 7501 1M roztworu wodorku diizobutyloglinowego (0,75 mmola) tak, aby temperatura roztworu nie przekroczyła -60C. Roztwór mieszano w -65 C przez 3h do całkowitego zaniku substratu. Po rozłożeniu mieszaniny reakcyjnej, sączeniu przez celit i chromatografii na żelu krzemionkowym otrzymano 330 mg (69% wydajności) związku tytułowego w postaci bezbarwnego oleju oraz 50 mg (11% wydajności) odpowiednio C-24a-alkoholu, (5Z, 7E)-(1S, 3R)-1,3-bis[(t-butylodimetylosililo)oksy]-9,10-seko-24a-homo-5,7,10(19)-cholatrien-24a-olu jako produktu ubocznego. λmax264,6 nm (heksan); IR (CHC13): 2930,1722,1645 cm-1; 1H NMR (CDCl3) (ppm): 0,049 (12H, bs, Si-CH3), 0,51 (3H, s, 18-CH3), 0,86 (18H, bs, C-CH3), 4,2 (1H, m, 3-H), 4,3 (1H, m, 1-H), 4,84 (1H, bs, Jgem=2,3Hz, 19Z-H), 5,15 (1H, bs, Jgem=2,3Hz, 19E-H), 6,02 (br d, J=11Hz, 7-H), 6,35 (br d, J= llh z, 6 -H), 9,74 (1H, t, J= l,8 Hz, CHO); 13C NMR (CDC13): -5,09, -4,80, -4,69, 11,94, 18,15, 18,22, 18,69, 22,11, 23,36, 25,79. 25,84, 27,68, 28,84, 35,39, 35,97, 40,56, 44,32, 44,78, 45,75, 46,01, 56,19, 56,28, 67,49, 72,04, 77,21,111,22,117,90,123,12,134,99,140,91,148,25, 202,97; EIMS m/z (intensywność względna 614 (M+), 482 (100), 248 (95); obliczono dla C3 7 H6 6 o 3 Si2 614,4546, znaleziono 614,4551. D) Ester etylowy kwasu (5 Z,7 E )-(1 S,3 R )-(2 4 E )-1,3-Bis[(t-butylodime tylosililo)oksy]-9,10-seko-24a,24b,24c-trihomo-5,7,10(19)-cholatetraen-24c- -owego (wzór 18). Do roztworu 70 mg (0,2 mmola) etoksykarbonylometylenotrifenylofosforanu w 2 ml THF dodano w temperaturze pokojowej pod argonem 89 mg (0,145 mmola) aldehydu otrzymanego jak wyżej w 2 ml THF. Roztwór mieszano przez 16h w temperaturze pokojowej. Po chromatografii na żelu krzemionkowym otrzymano 102 mg (91% wydajności) tytułowego estru w postaci bezbarwnego oleju. λmax264,6 nm (heksan); IR (CHCl3): 2951,1708,1652 cm-1; 1H NMR (CDCl3) (ppm): 0,049 (12H, bs, Si-CH3), 0,52 (3H, s, 18-CH3), 0,89 (18H, bs, C-CH3), 1,27 (3H, t, J=7,1Hz, -CH2 CH3), 4,2 (1H, m, 3-H), 4,3 (1H, m, 1-H), 4,84 (1H, bs, Jgem=2,4Hz, 19Z-H), 5,15 (1H, bs, Jgem=2,4Hz, 19E-H), 5,78 (1H, dt, Jtrans=15,7 i 1,4Hz, 24b-H), 6,02 (br d, J=11Hz, 7-H), 6,35 (br d, J=11Hz, 6 -H), 6,90 (1H, dt, Jtrans= 15,8 Hz, Jvic=7,2Hz, 24a-H); 13C NMR (CDCl3): -5,05, -4,77, -4,66, 11,98, 14,27, 18,13, 18,23, 18,79, 22,17, 23,50, 24,76, 25,84, 27,69, 28,89, 32,64, 35,51, 35,98, 40,67, 44,90, 45,81, 46,10, 56,37, 56,52, 60,06, 67,57, 72,11,111,15,117,97, 121,30,123,17,135,06, 140,93,148,44,149,37. E) (5Z,7E )-(1S,3R )-(24E)-l,3-B is[(t-butylodim etylosililo)oksy]-9,10-seko- -24a,24b-dihomo-5,7,10(19), 24a-cholestatetraen-25-ol (wzór 19). Do roztworu bromku metylomagnezowego w eterze etylowym (0,1 ml, 0,3 mmola) rozcieńczonego za pomocą 0,75 ml THF dodano pod argonem, w temperaturze pokojowej, 60 mg (0,088 mmola) estru otrzymanego w sposób opisany powyżej w 1 ml THF. Roztwór mieszano przez 24h w temperaturze pokojowej. Po chromatografii na żelu krzemionkowym otrzymano 31,3 mg (54% wydajności) tytułowego alkoholu w postaci bezbarwnego oleju. F) (5Z, 7E)-(1S, 3R)-9,10-seko-24a,24b-dihomo-(24aE)-5,7, 10(19)-cholestatetraen-1, 3, 25-triol (wzór 20). Do roztworu 315 mg (1 mmol) fluorku tetrabutyloamoniowego w 1 ml THF dodano pod argonem, w temperaturze pokojowej, roztwór 31 mg (0,046 mmola) alkoholu otrzymanego w sposób opisany powyżej w 1 ml THF. Roztwór mieszano przez 16h w temperaturze pokojowej
177 676 9 do całkowitego zaniku substratu. Po ekstrakcji octanem etylu i chromatografii na żelu krzemionkowym otrzymano 19,3 mg (94% wydajności) tytułowego triolu w postaci bezbarwnego oleju. λmax263,8 nm (EtOH); 1H NMR (CDC13) (ppm): 0,54 (6 H, s, 26,27-CH3), 1,31 (6 H, s, 26,27-CH3), 4,2 (1H, m, 3-H), 4,4 (1H, m, 1-H), 5,0 (1H, bs, 19Z-H), 5,3 (1H, t, Jgem= 1,7Hz, 19E-H), 5,85 (1H, d, Jtrans= 16,0Hz, 24b-H), 6,02 (br d, J= llh z, 7-H), 6,35 (br d, J= llh z, 6 -H), 7,1 (1H, m, Jtrans=16Hz, 24b-H); EIMS m/z (intensywność względna) 442 (M+, 39), 424 (M+-H 2 0, 95), 406 (M+-2H 2 0, 93), 388 (M+-3H2 0, 100), 285 (100); obliczono dla C2 9 H460 442,3447, znaleziono 442,3440. Przykład II. Powinowactwo do wewnątrzkomórkowego receptora witaminy D 3 (VDR) Powinowactwo związków według wynalazku do wewnątrzkomórkowego receptora witaminy D3 określano mierząc wypieranie 3 H-1, 25-dihydroksycholekalcyferolu, specyficznie związanego z receptorem z grasicy cielęcej, przez związki badane, rozpuszczone w etanolu w zakresie stężeń od 10-1 3 do 10-7 M. Wyniki pomiarów, w których jako związek porównawczy zastosowano 1,25-dihydroksycholekalcyferol (calcitriol), przedstawiono w tabeli 1. Wielkość powinowactwa podano jako wartość EC50, to jest stężenie związku, przy którym następuje wymiana 50% znakowanego izotopowo calcitriolu na związek badany. W tabeli 1 związek badany oznacza (5Z, 7E)-(1S, 3R)-9,10-seko-24a,24b-dihomo-(24aE)-5,7,10(19), 24a-cholestatetraen-1,3,25-triol. Tabela 1 Wyniki pomiarów powinowactwa do receptora VDR Związek EC50 pec50 Związek badany 1,25 (OH)2D3 4,8 x 10-13± 2,9 4,3 x 10-12± 3,4 12,3 11,4 Jak stwierdzono, związek badany charakteryzuje się bardzo wysokim powinowactwem do receptora VDR, wyższym około 10-krotnie od powinowactwa calcitriolu, związku o najwyższym dotychczas znanym powinowactwie. Przykład III. Powinowactwo do białka wiążącego witaminę D Białko wiążące witaminę D (DBP) jest specyficznym nośnikiem dla witaminy D i jej metabolitów we krwi. Aktywność biologiczna związków z grupy witamin D zależy od ich wiązania z DBP, ponieważ silne wiązanie z DBP zmniejsza wewnątrzkomórkowy dostęp do receptora VDR. Wiązanie do DBP może również wpływać na okres półtrwania pochodnych witamin D we krwi. Substancje o słabym wiązaniu są szybko metabolizowane, co jest korzystne w aspekcie stosowania miejscowego. DBP oczyszczony z pełnej surowicy ludzkiej inkubowano z 3 H-1, 25-DHCC i 1, 25-DHCC lub z badanymi analogami witaminy D. W tym celu związki rozpuszczano w etanolu w stężeniach w zakresie od 10-1 1 do 2,5 x 10-6 M. Następnie obliczano procent związany/niezwiązany 3H-1, 25-DHCC. Stwierdzono, że zarówno (5Z, 7E)-(1S, 3R)-9,10-seko- 24a, 24b-dihomo-(24aE)-5,7,10(19), 24a-cholestatetraen-1,3,25-triol jak i znany (5Z, 7E)-(1S, 3R)-9,10-seko-24,24a-dihomo-(24aE)-5,7,10(19), 24a-cholestatetraen-1,3,25-triol wiążą się znacznie słabiej z DBP niż kalcytriol (odpowiednio 2% i 3%). Przykład IV. Różnicowanie komórek Badane analogi witamin D rozpuszczono w etanolu w stężeniach od 10-1 2 do 10-6M i badano ich zdolność indukowania różnicowania komórek w teście HL-60. W teście tym w celu
10 177 676 ustalenia, czy ma miejsce różnicowanie komórek prowadzono badanie biochemiczne linii ludzkich komórek białaczki HL-60. Różnicowanie wyrażono jako parametr dojrzewania, redukcję błękitu metylenowego tetrazolium (NBT). Po hodowli albo z kalcytriolem albo z badanymi analogami witamin D oznaczano procent komórek zawierających czarne złogi formazanu. Wzrost liczby komórek redukujących NBT wskazuje na wzrost różnicowania komórek. Proliferację i żywotność hodowli komórkowych badano przez zliczanie komórek oraz metodą ekskluzji błękitu trypanowego. Żywotność i proliferacja komórek w hodowlach HL-60 była dobra we wszystkich testach. Kalcytriol oraz (5Z, 7E)-(1S, 3R)-9,10-seko- 24a,24b-dihomo-(24aE)-5,7,10(19), 24a-cholestatetraen-1,3,25-triol są równie aktywne w różnicowaniu i dojrzewaniu komórek HL-60, podczas gdy znany (5Z, 7E)-(1S, 3R)-9,10-seko-24,24a-dihomo-(24aE)-5,7,10(19), 24a-cholestatetraen-1,3,25-triol jest 4 razy mniej aktywny. Optymalny efekt stwierdzono przy stężeniach w zakresie między 10-7 a 10-6M.
177 676 Wzór 1 wzór 2 Wzór 3
177 676 Wzór 4 Wzór 5 Wzór 6 Wzór 7
177 676 Wzór 8 Wzór 9 Wzór 10
177 676 Wzór 11 Wzór 12 Wz ó r 13
177 676 Schemat Wzór 14: R = A c ; R'=H Wzór 15: R = R '=H Wzór 16: R = R '=TBDMS Wzór 17 Wzór 18 Wzór 19 Wzór 20 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.