(12) OPIS PATENTOWY (19) PL

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US92/07711 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO93/05158, PCT Gazette nr 08/93 (11) (13) B1 (51) IntCl6: C12P 35/00 C12N 1/15 Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Nowy p roces biologiczny wytwarzania kwasu 7-am inodezacetoksycefalosporanowego (kwasu 7-ADC) (30) Pierwszeństwo: ,US, (73) Uprawniony z patentu: Gist-brocades B.W., Delft, NL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 22/94 (72) Twórcy wynalazku: Michael J. Conder, Harrisonburg, US Lorilee Crawford, Bothel, US Phyllis C. McAda, Woodinvilie, US John A. Rambosek, Seattle, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 10/98 (74) Pełnomocnik: Kossowska Janina, PATPOL Spółka z o.o. PL B1 (57) 1. Nowy proces biologiczny wytwarzania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (kwasu 7-ADC), znamienny tym, że: (1) hoduje się w pożywce zdolnej do podtrzymywania wzrostu szczep Penicillium chrysogenum produkujący izopenicylinę N i do tej pożywki hodowlanej dodaje się związek adypinowy, którym jest kwas adypinowy lub jedna albo więcej jego soli i estrów, które to związki są przyswajalne i wykorzystywane przez powyższy szczep Penicillium chrysogenum do wytwarzania kwasu adypoilo-6-aminopenicylanowego (kwasu adypoilo-6-ap); przy czym powyższy szczep Penicillium chrysogenum został poddany transformacji za pomocą DNA kodującego aktywność enzymu ekspandazy zdolnej do akceptowania powyższego kwasu adypoilo-6-ap jako substratu, a w rezultacie ekspresji tego enzymu powyższy adypoilo-6-ap wytwarzany przez powyższy szczep jest także następnie in situ powiększany w pierścieniu, tworząc kwas adypolilo-7-adc; oraz (2) powyższy adypoilo-7adc kontaktuje się z acylazą adypoilową, w wyniku czego usuwany jest adypoilowy łańcuch i izoluje się wytworzony kwas 7-ADC.

2 Nowy proces biologiczny wytwarzania 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (kwasu 7-ADC) Zastrzeżenia patentowe 1. Nowy proces biologiczny wytwarzania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (kwasu 7-ADC), znamienny tym, że: (1) hoduje się w pożywce zdolnej do podtrzymywania wzrostu szczep Penicillium chrysogenum produkujący izopenicylinę N i do tej pożywki hodowlanej dodaje się związek adypinowy, którym jest kwas adypinowy lub jedna albo więcej jego soli i estrów, które to związki są przyswajalne i wykorzystywane przez powyższy szczep Penicillium chrysogenum do wytwarzania kwasu adypoilo-6-aminopenicylanowego (kwasu adypoilo-6-ap); przy czym powyższy szczep Penicillium chrysogenum został poddany transformacji za pomocą DNA kodującego aktywność enzymu ekspandazy zdolnej do akceptowania powyższego kwasu adypoilo-6-ap jako substratu, a w rezultacie ekspresji tego enzymu powyższy adypoilo-6-ap wytwarzany przez powyższy szczep jest także następnie in situ powiększany w pierścieniu, tworząc kwas adypolilo-7-adc; oraz (2) powyższy adypoilo-7adc kontaktuje się z acylazą adypoilową, w wyniku czego usuwany jest adypoilowy łańcuch i izoluje się wytworzony kwas 7-ADC. 2. Proces według zastrz. 1, znamienny tym, że związkiem adypinowym jest adypinian disodowy. 3. Proces według zastrz. 1, znamienny tym, że DNA kodujący aktywność enzymu ekspandazy jest otrzymywany ze Streptomyces clavuligerus ATCC Proces według zastrz. 1, znamienny tym, że acylaza adypoilowa jest otrzymywana z Pseudomonas species. 5. Metoda, w której komórkę gospodarza zrekombinowanego Penicillium chrysogenum PC 100, ATCC 74182, hoduje się w warunkach odpowiednich dla ekspresji genu, przy czym powyższa komórka zrekombinowanego gospodarza zawiera zrekombinowany wektor ekspresji DNA, plazmid ppenftso, włączony do chromosomalnego DNA powyższej komórki gospodarza i obejmujący DNA kodujący aktywność enzymu ekspandazy pochodzący ze Streptomyces clavuligerus ATCC oraz promotor wywołujący ekspresję powyższego DNA kodującego aktywność ekspandazy, którym jest promotor genu IPNS Penicillium chrysogenum. * * * Nowy proces biologiczny wytwarzania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (kwasu 7-ADC). Wynalazek dotyczy dziedziny syntetycznych metod wytwarzania handlowych antybiotyków cefalosporynowych. Znana jest obecnie wielka ilość cefalosporyn i te środki terapeutyczne mają już swoją czwartą generację. Wielka różnorodność łańcuchów bocznych obecnych w handlowych cefalosporynach oraz duże znaczenie ekonomiczne cefalosporyn wzmagają potrzebę uzyskiwania bardziej ekonomicznych i wydajnych metod wytwarzania kluczowych półproduktów umożliwiających syntezę różnych cefalosporyn. Jednym z takich kluczowych półproduktów jest kwas 7-aminodezacetoksycefalosporanowy (kwas 7-ADC), związek o następującym wzorze:

3 Kwas 7-ADC jest obecnie wytwarzany z penicyliny G w cztero- lub pięcioetapowym procesie chemicznym powiększania 5-członowego pierścienia penicyliny do 6-członowego pierścienia charakteryzującego cefalosporyny. Jak to typowo bywa w przypadku całkowitych syntez chemicznych, proces powyższy charakteryzuje się poważnymi niedogodnościami. Należą do nich takie jak konieczność wykorzystywania wielostopniowego złożonego procesu, powstawanie produktów ubocznych i konieczność ich przerobu oraz potrzeba oczyszczania wysoko zanieczyszczonego surowca wyjściowego przed jego przeróbką chemiczną. Wynikiem tego jest poszukiwanie metody enzymatycznej lub fermentacyjnej umożliwiającej enzymatyczne powiększanie pierścienia i odszczepianie łańcucha bocznego w celu otrzymania kwasu 7-ACD w sposób bardziej ekonomiczny niż to ma miejsce w stosowanym obecnie procesie chemicznym. Przedmiotem wynalazku jest więc sposób wytwarzania półproduktu dla otrzymywania cefalosporyn - kwasu 7-ADC, a dokładniej biologiczny proces wytwarzania kwasu 7-ADC. Jak dotychczas, poszukiwania biologicznego procesu wytwarzania kwasu 7-ADC były w większości nieudane, w szczególności w odniesieniu do skali przemysłowej. Np., chociaż jest możliwe otrzymywanie kwasu 6-aminopenicylanowego (kwasu 6-AP) drogą bezpośredniej fermentacji lub/i drogą enzymatycznego rozszczepienia penicyliny G, to dla otrzymywania kwasu 7-ADC pozostaje tylko powiększanie pierścienia. Stwierdzono, że enzymy wytwarzane przez Cephalosporium lub Streptomyces, które powiększają pierścień w normalnym szlaku metabolicznym tych drobnoustrojów nie akceptują niestety kwasu 6-AP jako substratu. Te enzymy, określane zbiorczo jako DAOCS lub enzym ekspandaza, są zdefiniowane jako enzymy, które katalizują powiększanie układów pierścieniowych penamu obecnych w cząsteczkach typu penicylin w pierścienie cefemowe-3, obecne w cefalosporynach. Powyższe enzymy będą w niniejszym opisie określane jako enzym ekspandaza. Substratem dla ekspandazy jest penicylina N, z której po powiększeniu pierścienia powstaje dezacetoksycefalosporyna C (DAOC). Niezbędne jest tylko odszczepienie (D)-α-aminoadypoilowego łańcucha bocznego dla otrzymania kwasu 7-ADC, ale stwierdzono, że ten łańcuch boczny jest uporczywie oporny na enzymatyczne odszczepianie, które daje tylko nie do zaakceptowania niskie wydajności. Zgodnie ze sposobem według wynalazku, możliwe jest uzyskanie wydajnego procesu biologicznego, w którym związek penicylinowy (zawierający adypoilowy łańcuch boczny) jest wytwarzany za pomocą procesu fermentacji z wysoką wydajnością. Powyższa penicylina jest akceptowanym substratem dla układu enzymu ekspandazy, produkowanego in situ przez ten sam drobnoustrój, który wytwarza penicylinę i który jest transformowany dla uzyskania ekspresji ekspandazy. Ekspandaza następnie dokonuje powiększenia pierścienia w penicylinie przekształcając j ą z wysoką wydajnością w cefalosporynę. Następnie, co jest ważne, w drugim krytycznym etapie łańcuch boczny penicyliny, przekształconej już w cefalosporynę, daje się usuwać przez inny układ enzymatyczny z zaskakująco wysokimi wydajnościami. Nieoczekiwanym rezultatem tego unikalnego procesu biologicznego, bedącego przedmiotem wynalazku, jest wytwarzanie kwasu 7-ADC z niespodziewanie wysoką wydajnością. Cantwelliwsp. wcurr.genet. (1990), 17:213:221 zaproponowali biologiczny proces wytwarzania kwasu 7-ADC drogą przekształcania pierścienia penicyliny V i następnie enzymatycznej hydrolizy otrzymanej dezacetoksycefalosporyny V. Ta propozycja jest oparta na istnieniu dostępnego klonowanego genu ekspandazy penicyliny N (cefe) z S.clavuligerus [Kovacevic i wsp., J. Bacteriol., (1989), 171: i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr ]. Ponieważ jednak ekspandaza działa na penicylinę N, jej naturalny substrat, a nie na penicylinę V, metoda ta wymaga inżynierii genetycznej dla wytwarzania zmodyfikowanego genu ekspandazy, która może powiększać pierścień penicyliny V. Pożądana modyfikacja nie została jednak osiągnięta przez Cantwella i wsp. Udała się im jedynie transformacja Penicillium chrysogenum za pomocą genu cef E z Streptomyces clavuligerus i uzyskanie na niskim poziomie ekspresji enzymu DAOCS (ekspandazy). Ekspandaza była szczegółowo studiowana zarówno w odniesieniu do jej aktywności jak i sekwencji genetycznej. Np., Wolfe w opisach patentowych Sianów Zjednoczonych Ameryki

4 nr i opisał oddzielną izolację cyklazy, epimerazy i enzymów powiększających pierścień z wolnego od komórek ekstraktu z prokariotycznych drobnoustrojów (w tym Streptomyces clavuligerus) wytwarzającyh β-laktamy jako metodę otrzymywania stabilnych enzymów. W europejskim opisie patentowym nr A-O opisano izolowanie i oczyszczanie ekspandazy z S. clavuligerus, jej charakterystykę, w tym resztę terminalną i skład aminokwasowy oraz podano, że ciężar cząsteczkowy enzymu wynosi około daltonów. Odbiega to jednak od ciężaru cząsteczkowego wynoszącego podanego dla tego samego, jak się wydaje, enzymu opisanego w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr W europejskim opisie patentowym nr A-O ujawniono izolowanie i endonukleazową mapę restrykcyjną dla ekspandazy otrzymanej z transformacji S. clavuligerus i ekspresji przez gospodarza tego enzymu, a także opisano powiększanie pierścienia penicyliny N przez zastosowanie tego enzymu. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr przedstawiono sekwencję DNA kodującego ekspandazę otrzymywaną z S. clavuligerus oraz transformację szczepu P. chrysogenum wektorem ekspresyjnym zawierającym powyższą sekwencję DNA, w wyniku czego uzyskano ekspresję ekspandazy. Chociaż sugeruje się, że ten enzym jest użyteczny dla powiększania substratów innych niż penicylina N, to nie przedstawiono dowodu takiego powiększania. Przedstawiona powyżej praca jest skierowana na ekspandazę pochodzącą z prokariotycznego S. clavuligerus. Taki sam enzym albo co najmniej enzym wykazujący wyraźną aktywność powiększającą pierścień jest także wytwarzany przez szczep eukariotycznego Cephalosporium acremonium (określany także jako Acremonium chrysogenum). W takich jednak szczepach aktywność ekspandazowa jest produktem ekspresji dwufunkcyjnego genu, (cefef). który także ma zdolność ekspresji do enzymu DACS (hydroksylazy), którego naturalną funkcją jest przekształcanie kwasu dezacetoksycefalosporanowego (DAOC), produktu operowania enzymu ekspandazy, w dezacetylocefalosporynę C (DAC). Wynikiem jest otrzymywanie pojedynczego ale dwufunkcyjnego enzymu ekspandazy/hydroksylazy. Chociaż czynione były usiłowania rozdzielenia aktywności tych dwóch produktów genu, to nie zakończyły się one powodzeniem. Np., w europejskim opisie patentowym nr A-O opisano izolację i identyfikację sekwencji DNA genu DAOCS/DACS otrzymanego z C. acremonium ATCC a także odpowiednie sekwencje aminokwasowe enzymów. Transformowany Penicillium wykazuje ekspresję enzymów ale nigdy nie opisano prób przekształcenia penicylin G i V w odpowiednie cefalosporyny. Ponadto, pomimo sugestii, że techniki inżynierii genetycznej są prostymi środkami służącymi do rozdziału informacji genetycznej kodującej DAOCS i DACS i ich oddzielnej ekspresji, nie wykazano dotychczas, że taki rozdział został wykonany. Enzym DAOCS/DACS (ekspandaza/hydroksylaza) z C. acremonium był także szczegółowo badany, zarówno pod względem jego aktywności jak i charakterystyki i sekwencji genetycznej. Np., Demaifl w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr , i opisuje traktowanie różnych wyjściowych związków typu penicyliny wolnym od komórek ekstraktem z C. acremonium, co prowadzi do epimeryzacji i powiększania pierścienia i otrzymywania antybiotyków cefalosporynowych. Wu-Kuang Yeh opisał w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr enzym z C. acremonium podając jego punkt izoelektryczny, ciężary cząsteczkowe, reszty aminokwasowe, stosunek hydroksylazy do ekspandazy i fragmenty peptydowe. Omawiany powyżej stan dotychczasowy dotyczy tylko jednego aspektu niniejszego wynalazku, to znaczy transformacji szczepu P. chrysogenum za pomocą genu ulegającego ekspresji do enzymu ekspandazy i uzyskania ekspresji genu do tego enzymu. Jak dotychczas jednak uzyskany w wyniku ekspresji enzym stosowano do powiększania pierścienia penicyliny N a nie penicylin G i V. Nawet jednak w tym przypadku, ponieważ penicylina N zawiera w pozycji 7 łańcuch boczny nie dający się usuwać enzymatycznie, nie można otrzymywać kwasu 7-ADC jak w metodzie według wynalazku. Wynalazek opiera się na zaskakującym odkryciu, że adypoilowy łańcuch boczny może być wprowadzany przez szczep P. chrysogenum, że uzyskany drogą ekspresji in situ enzym ekspandaza może wykorzystywać ten związek jako substrat w procesie powiększania

5 pierścienia do adypoilowanego kwasu 7-ADC, i że adypoilowy łańcuch boczny może być efektywnie usuwany przez jeszcze inny enzym, w wyniku czego otrzymuje się kwas 7-ADC. Chociaż różne izolowane fragmenty sposobu według wynalazku można znaleźć w już opisanych pracach, to nigdzie nie sugeruje się łącznego ich wykorzystania i uzyskania nieoczekiwanych wyników, jak to ma miejsce w sposobie według wynalazku. Np., znane jest wytwarzanie kwasu 6-adypoilopenicylanowego [A. Balio i wsp., Naturę (1960), 185,97-99]. Enzymatyczne powiększanie pierścienia kwasu 6-adypoilopenicylanowego in vitro jest również znane; patrz Baldwin i wsp., Tetrahedron (1987), 43, oraz europejski opis patentowy Nr A-O Enzymatyczne odszczepianie adypoilowych łańcuchów bocznych jest także znane i opisali je np. Matsuda i wsp., w J. Bact., ((1987) 169, Adypoilowy łańcuch boczny ma budowę określoną wzorem COOH-(CH2)4 -CO- natomiast glutarylowy łańcuch boczny o blisko pokrewnej strukturze opisany jest wzorem CO-OH-(CH2)3-CO-. Enzymatyczne odszczepianie glutarylowego łańcucha bocznego jest znane i opisali je np. Shibuya i wsp. w Agric. Biol. Chem. (1981) 45, ; Matsuda i Komatsu wj.bact. (1985) 163, ; Matsuda i wsp. w J. Bact. (1987) 169, ; oraz zostało opisane w japońskim opisie patentowym nr (1978, Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.) i w japońskim opisie patentowym nr (1977, Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.). W europejskim opisie patentowym nr A-O opisano metody zwiększania aktywności odszczepiającej resztę kwasu adypinowego acylazy glutarylowej wytwarzanej przez Pseudomonas SY Po podstawieniu różnych aminokwasów w pewnych miejscach w obrębie podjednostki a obserwowano wyższy trzy do pięciu razy stopień odszczepienia reszty adypoilowej (z adypoiloseryny). Należy zauważyć, że chociaż w powyższym europejskim opisie patentowym przedstawia się acylazę o zwiększonej aktywności wobec adypoilowych łańcuchów bocznych, to nie jest opisana żadna metoda (zarówno chemiczna jak i biologiczna, w jakikolwiek sposób analogiczna do tutaj opisanej), pozwalająca na otrzymywanie przede wszystkim adypoilocefalosporyny. Wiadomo jest z dotychczasowych danych, że w przypadku (D)-α-aminoadypoilowego łańcucha bocznego najpierw enzymatycznie usuwa się grupę aminową i skraca łańcuch boczny za pomocą oksydazy (D)-aminokwasowej, w wyniku czego pozostaje glutarylowy (GL-7) łańcuch boczny, który usuwa się za pomocą drugiego enzymu (acylazy glutarylowej). Takie dwustopniowe odszczepianie opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr (Matsuda); europejskim opisie patentowym nr A-O ;japońskim opisie patentowym nr ( Komatsu, Asahi Chemical Industry Co): światowym opisie patentowym WO 90/12110 ( Wong, Biopure Corp.); i w Bio/technology (1991) 9, (Isogai i wsp.). Odniesienie do równoległego zgłoszenia Równoległe zgłoszenie nr P przedstawia biologiczny proces wytwarzania 7-ACA, który polega na ekspresji enzymu ekspandazy w stransformowanym P. chrysogenum w taki sam sposób, jak w opisanym tutaj biologicznym procesie wytwarzania kwasu 7-ADC. W powyższym biologicznym procesie wytwarzania kwasu 7-ACA potrzebne są jednak dodatkowe transformacje dla uzyskania ekspresji dodatkowego enzymu, w celu uzyskania całkowitego różnego szlaku metabolicznego rekombinanta prowadzącego do innego produktu końcowego. Niczego takie nie sugeruje się w niniejszym opisie. Dla ułatwienia lepszego zrozumienia sposobu według wynalazku i dyskutowanych odniesień do stanu dotychczasowego przedstawiono poniżej schemat obrazujący różne stadia szlaku metabolicznego prowadzącego do penicyliny G i cefalosporyny C, produkty przejściowe i enzymy biorące udział w opisywanych transformacjach.

6 Przedmiotem wynalazku jest nowy biologiczny proces wytwarzania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (kwasu 7-ADC) polegający na tym, że: ( 1 ) hoduje się w pożywce zdolnej do podtrzymywania wzrostu szczep Penicillium chrysogenum wytwarzający izopemcylinę N, dodając tej pożywki hodowlanej związek adypinowy w postaci kwasu adypinowego lub jednej albo więcej jego soli lub estrów, które to związki są asymilowane i wykorzystywane przez powyższy szczep Penicillium chrysogenum do wytwarzania kwasu adypoilo-6-aminopenicylanowego (kwasu adypoilo-6-ap); przy czym powyższy szczep Penicillium chrysogenum został poddany transformacji za pomocą DNA kodującego enzym ekspandazę zdolną do akceptowania powyższego kwasu adypoilo-6-ap jako substratu i w wyniku

7 jego ekspresji powyższy kwas adypoilo-6-ap wytwarzany przez powyższy szczep jest także in situ powiększany w pierścieniu i przekształcany w kwas adypoilo-7-adc; oraz (2) powyższy kwas adypoilo-7-adc poddaje się działaniu acylazy adypoilowej, w wyniku czego usuwany jest adypoilowy łańcuch boczny i powstaje kwas 7-ADC, który izoluje się z mieszaniny reakcyjnej. Stosowane w niniejszym opisie określenia mają następujące znaczenie: określenie kwas adypoilo-6-ap oznacza kwas [2S-(2α, 5α, 6β)]-3,3-dimetylo-7-okso- -6-[(heksano-1,6-dioilo)amino]-4-tia-1-azabicyklo[3.2.0]heptano-2-karboksylowy; określenie kwas adypoilo-7-adc oznacza kwas 7 [(heksano-1,6-dioilo)amino]-3-metylo-8-okso-5-tia-1-azabicyklo[4.2.0]ok-2-eno-2-karboksylowy. W szczególności, wynalazek dotyczy nowego biologicznego procesu wytwarzania omówionego powyżej kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (kwas 7ADC), w którym to procesie jako związek adypinowy stosuje się adypinian dwusodowy; DNA kodujący enzym ekspandazę pochodzi z Streptomyces clavuligerus ATCC 27064; oraz acylaza adypoilowa pochodzi z Pseudomonas species. Wynalazek dalej dotyczy metody hodowania komórek gospodarza rekombinowanego Penicillium chrysogenum PC 100, ATCC 74182, w warunkach odpowiednich dla ekspresji genu, przy czym powyższa komórka zrekombinowanego gospodarza zawiera zrekombinowany wektor ekspresji DNA, plazmid ppenftso, włączony do chromosomalnego DNA powyższej komórki gospodarza i obejmujący DNA kodujący aktywność enzymu ekspandazy pochodzący ze Streptomyces clavuligerus ATCC oraz promotor wywołujący ekspresję powyższego DNA kodującego aktywność ekspandazy, którym jest promotor genu LPNS Penicillium chrysogenum. Przedmiotem wynalazku w pierwszym aspekcie jest nowy biologiczny proces wytwarzania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (kwasu 7-ADC), kluczowego półproduktu do otrzymywania handlowych syntetycznych cefalosporyn, o następującym wzorze: Poza podstawowym szkieletem cefalosporynowym wyróżniającymi grupami w kwasie 7-ADC są grupa 7-aminowa i grupa 3-metylowa. Grupę 7-aminową można przekształcać w dowolną ilość łańcuchów bocznych i tworzyć podstawę do syntetyzowania różnych handlowych cefalosporyn. Grupa 3-metylowa musi być zwykle, ale niezawsze,jak w przypadku cefaleksyny przekształcana w procesie syntezy handlowych cefalosporyn w inny łańcuch boczny. Innym kluczowym półproduktem cefalosporynowym, poza kwasem 7-ADC wytwarzanym sposobem według wynalazku, jest cefalosporyna C reprezentowana następującym wzorem: Obecny w tym półprodukcie 3-acetylooksymetylowy łańcuch boczny może być akceptowany w handlowych cefalosporynach. Natomiast 7-(D)-α-aminoadypoilowy łańcuch boczny nie jest akceptowany do dalszego syntetycznego przerobu i musi być odszczepiany w celu uzyskania pożądanej grupy 7-ammowej. Niestety, 7-(D)-α-aminoadypoilowy łańcuch boczny jest,

8 jak to stwierdzono, zawsze trudny do usunięcia metodami zarówno chem icznym i jak biochemicznymi. Definicje Stosowane w niniejszym opisie a w szczególności w sekcji zatytułowanej Opis korzystnych odmian wynalazku określenia mają następujące znaczenie: kwas 7-ADC - kwas 7-aminodezacetoksycefalosporanowy kwas 6-AP - kwas 6-aminopenicylanowy DAOC - kwas dezacetoksycefalosporanowy DAOCS - syntetaza DAOC DAC - dezacetylocefalosporyna C DACS - syntaza DAC IPNS - syntetaza izopenicy linowa N Tris - Tris[hydroksymetylo]aminometan EDTA - kwas etylenodiaminotetraoctowy DEPC - pirokarbonian dietylu TE - bufor Tris/EDTA SSC - bufor chlorek sodowy/cytrynian sodowy SDS - dodecylosiarczan sodowy PEG - glikol polietylenowy Hodowla Penicillium chrysogenum Pierwszym etapem w sposobie według wynalazku jest etap hodowania w pożywcze zdolnej do podtrzymywania wzrostu szczepu Penicillium chrysogenum wytwarzającego izopenicy linę N, podczas którego to hodowania dodaje się związek adypinowy, taki jak kwas adypinowy lub jego sole i estry. Związek adypinowy można dodawać do hodowli po zaszczepieniu P. chrysogenum, ale korzystnie powinien być on obecny w hodowli podczas zaszczepienia. Kwas adypinowy lub jego sole i estry są tego rodzaju, że są przyswajane i wykorzystywane przez powyższy szczep P. chrysogenum do wytwarzania kwasu adypoilo-6-ap. Omawiany szczep P. chrysogenum został poddany transformacji za pomocą DNA kodującego enzym ekspandazę i w wyniku ekspresji tego enzymu kwas adypoilo-6-ap jest in situ powiększany w pierścieniu i tworzy się kwas adypoilo-7-adc. Inne gatunki, poza chrysogenum, z rodzaju Penicillium produkują izopenicylinę N. Historycznie jednak wszystkie najbardziej wydajne szczepy produkujące izopenicylinę N zostały uzyskane za pomocą dobrze znanych technik ulepszenia szczepów z gatunku chrysogenum. Ze względów praktycznych wynalazek został ograniczony do szczepów Penicillium chrysogenum, chociaż możliwość jego stosowania do innych gatunków jest oczywista. Każdy złożony do depozytu szczep Penicillium chrysogenum lub inny z dostępnego publicznie źródła szczep jest odpowiedni jako materiał wyjściowy do realizacji sposobu według wynalazku. Pożywka hodowlana odpowiednia dla uzyskiwania wzrostu szczepu Penicillium chrysogenum wytwarzającego izopenicylinę N jest pożywką dobrze znaną specjalistom z elementarną wiedzą w tej dziedzinie. Np., hodowlę można prowadzić metodą podpowierzchniowej fermentacji z napowietrzaniem, stosując pożywkę wybraną z wielu odpowiednich dostępnych pożywek. Typowe pożywki zawierają źródła węgla, takie jak sacharoza, glukoza i skrobia; źródła azotu, takie jak mąka i kasza sojowa, olej z nasion bawełny, mąka arachidowa i różne aminokwasy i ich mieszaniny oraz peptony. Wymagania produkcyjne kładą nacisk na wydajność i łatwość izolacji i stąd korzystnym źródłem węgla mogą być melasy a korzystnymi źródłami azotu mąka sojowa i aminokwasy. Do pożywki hodowlanej są zwykle dodawane odżywcze sole nieorganiczne. Należą do nich sole dostarczające następujące jony: sodowy, potasowy, amoniowy, wapniowy, fosforanowy, siarczanowy, chlorkowy, bromkowy, azotanowy, węglanowy, żelazowy, żelazawy, magnezowy, manganowy, itd. Pierwiastki śladowe są zwykle również niezbędne dla wzrostu i

9 metabolizmu Penicillium chrysogenum. Mogą być one dodawane bezpośrednio do hodowli lub są obecne jako zanieczyszczenia innych składników pożywki hodowlanej. Szczepy Penicillium chrysogenum mogą być hodowane w małej objętości, np. w kolbach trzęsawkowych o pojemności 1 litr, gdy potrzebne jest otrzymywanie małych ilości kwasu 7-ADC. Natomiast gdy potrzebne są większe ilości kwasu adypoilo-7adc stosuje się fermentory o dużej pojemności do fermentacji podpowierzchniowej z napowietrzaniem. W procesie wytwarzania kwasu adypoilo-7adc w dużej skali, zarodniki Penicillium chrysogenum są utrzymywane na skokach agarowych. Zarodniki ze skosów są wykorzystywane do zaszczepiania małej objętości pożywki wegetatywnej. Pożywkę wegetatywną inkubuje się dla otrzymania świeżej aktywnej hodowli wzrostowej drobnoustroju. Taką hodowlę wegetatywną stosuje się następnie jako inokulum do zaszczepiania pożywki w fermentacji w dużej skali. W niektórych przypadkach może być pożądane otrzymywanie jeszcze dalszej hodowli wegetatywnej jako inokulum dla fermentacji. Takie wegetatywne hodowle z drugiego stadium są zwykle stosowane w przypadkach gdy objętość pożywki fermentacyjnej jest znacznie większa niż objętość pierwszej hodowli wegetatywnej. W ten sposób, zarodniki drobnoustroju są hodowane najpierw w malej objętości pożywki wegetatywnej dla otrzymania inokulum dla pożywki wegetatywnej o większej objętości. Większa hodowla wegetatywna dostarcza drobnoustrój w stężeniu wystarczającym do szybkiego zapoczątkowania fermentacji w dużym fermentorze. Pożywka wegetatywna może mieć taki sam skład jak pożywka fermentacyjna lub może zawierać dodatkowe składniki przyspieszające wzrost i rozwój drobnoustroju w małej skali. Szczepy Penicillium chrysogenum stosowane w sposobie według wynalazku są najbardziej efektywnie hodowane w temperaturze około od 20 C do 30 C, ale optymalną wydajność otrzymuje się gdy temperatura wynosi około od 22 C do 28 C, korzystnie około 25 C. Maksymalne wytwarzanie kwasu adypoilo-7-adc uzyskuje się gdy szczep Penicillium chrysogenum jest hodowany w dużych fermentorach w ciągu około od 10 do 30 dni, korzystnie 15 do 25 dni. Natomiast, podczas fermentacji w małej skali, np. w kolbach trzęsawkowych o objętości 250 ml, wzrost drobnoustroju jest szybszy i kwas adypoilo-7-adc jest wytwarzany np dniach, często po 5-7 dniach. Przy końcu fermentacji w dużych fermentorach ph osiąga wartość 8,0 lub wyższą, co może wpływać szkodliwie na wydajność kwasu adypoilo-7-adc. W takich sytuacjach pożądane jest monitorowanie ph pożywki podczas fermentacji. Jeśli można się spodziewać, że ph osiągnie taki poziom przed czasem maksymalnego wytwarzania kwasu adypoilo-7-adc, wówczas ph można obniżać dodając do pożywki fermentacji odpowiedni kwas lub środek buforujący. Wytwarzanie kwasu adypoilo-7-adc można kontrolować badając chromatograficznie próbki brzeczki fermentacyjnej. Jak w większości hodowli głębinowych z napowietrzaniem, przez pożywkę hodowlaną jest przepuszczane jałowe powietrze dla uzyskania lepszego wzrostu szczepu Penicillium chrysogenum i zwiększenia wytwarzania kwasu adypoilo-7-adc. Ilość powietrza przepuszczanego przez pożywkę wynosi zwykle co najmniej 0,2 objętości na minutę na objętość pożywki. Zwiększenie ilości powietrza może jednak często wywierać korzystny wpływ na wytwarzanie kwasu adypoilo-7-adc. Szczep Penicillium chrysogenum produkuje na ogół, poza kwasem adypoilo-7-adc, wiele produktów ubocznych i metabolitów. Ponieważ wiele z nich jest nietrwałych w środowisku kwaśnym, pożądane jest aby w procesie izolacji kwasu adypoilo-7-adc potraktować całą brzeczkę fermentacyjną kwasem i utrzymywać przez krótki okres kwaśne ph, w celu rozłożenia niektórych tych zanieczyszczeń. Otrzymany jako produkt fermentacji kwas adypoilo-7-adc wyodrębnia się z przesączonej brzeczki fermentacyjnej za pomocą chromatografii na żywicy jonowymiennej. Można go w razie potrzeby dalej oczyszczać chromatograficznie przed odszczepianiem adypoilowego łańcucha bocznego w następnym etapie. Możliwe jest również prowadzenie takiego rozdziału za pomocą chromatografii jonowymiennej po odszczepieniu łańcucha bocznego. Jednym z głównych produktów ubocznych, który stwarza problemy z rozdziałem jest kwas adypoilo-6-ap. Możliwe jest poddawanie go degradacji chemicznej lub

10 enzymatycznej dla ułatwienia rozdziału. Najpierw, przesączoną brzeczkę fermentacyjną poddaje się wstępnemu oczyszczaniu, do którego należy ekstrakcja nie mieszającym się z wodą rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak n-butanol lub octan amylu, dla usunięcia zanieczyszczeń. Brzeczkę po ekstrakcj i można wtedy dalej oczyszczać w omówiony uprzednio sposób za pomocą chromatografii na węglu aktywnym. Dodawanie związku adypinowego Korzystnie, po przygotowaniu hodowli fermentacyjnej dla Penicillium chrysogenum, jak to opisano uprzednio, to znaczy przed zaszczepieniem, dodaje się związek adypinowy do innych składników pożywki dla fermentacji. Ewentualnie, związek adypinowy może być dodawany po pewnym czasie od zaszczepienia, np. w 1,2 i/lub w 3 dniu po zaszczepieniu. Związkiem adypinowym jest kwas adypinowy lub jedna albo więcej soli lub estrów kwasu adypinowego, które to związki są przyswajane i wykorzystywane przez szczep Penicillium chrysogenum hodowany dla wytwarzania kwasu adypoilo-6-ap. Kwas adypinowy, jego sole i estry mogą być stosowane pojedynczo lub w dowolnej kombinacji. Korzystna jest sól dwusodowa, chociaż sól potasowa lub jej mieszanina z solą sodową mogą być także odpowiednie. Można stosować ester metylowy ale ester etylowy jest nierozpuszczalny w wodzie. Sól lub ester kwasu adypinowego muszą być przyswajalne i wykorzystywane przez szczep Penicillium chrysogenum do wytwarzania kwasu adypoilo-6-ap. Np., sam kwas adypinowy może być odpowiedni chociaż nie rozpuszcza się w wodzie, jeśli w odpowiednich warunkach ph tworzy się jego przyswajalna sól. Odpowiednie ekspandazy Szczep Penicillium chrysogenum, który jest hodowany w obecności związku adypinowego, jak opisano uprzednio, w takich warunkach, że wytwarza kwas adypoilo-6-ap, jest także szczepem który został poddany transformacji za pomocą DNA kodującego enzym ekspandazę. W wyniku ekspresji tego genu powyższy kwas adypoilo-6-ac jest in situ powiększany w pierścieniu tworząc kwas adypoilo-7-adc. Kwas adypoilo-6-a jest wytwarzany wewnątrz komórek przez hodowany w obecności związku adypinowego Penicillium chrysogenum. W tym wewnątrzkomórkowym środowisku, to znaczy in situ, transformowany Penicillium chrysogenum także wykazuje ekspreję DNA kodującego ekspandazę który to enzym operuje na kwasie adypoilo-6-ap jako substracie, powiększając jego pierścień i wytwarzając kwas adypoilo-7-adc. W zakres nowego biologicznego procesu według wynalazku wchodzi transformacja szczepu Penicillium chrysogenum typu opisanego powyżej za pomocą DNA kodującego aktywność enzymu ekspandazy i w wyniku jego ekspresji kwas adypoilo-6-ap jest in situ powiększany w pierścieniu z wytworzeniem kwasu adypoilo-7-adc. Tak więc, DNA za pomocą którego transformowany jest Penicillium chrysogenum musi wykazywać ekspresję enzymu posiadającego nie tylko aktywność jako ekspandaza, w pojęciu przyjętym w tej dziedzinie, to znaczy zdolność powiększania pierścienia izopenicyliny N do DAOC, ale także zdolność powiększania pierścienia kwasu adypoilo-6-ap do adypoilo-7-adc. Można jednak sądzić, na podstawie podobieństwa łańcucha, że każdy enzym ekspandaza będzie przydatny w nowym procesie biologicznym według wynalazku. W części opisującej stan dotychczasowy podano, że enzym ekspandaza otrzymany z Streptomyces clayuligerus ATCC został poddany pełnej analizie sekwencyjnej jak również scharakteryzowany endonukleazową mapą restrykcyjną. Natomiast, o takim samym jak się wydaje enzymie, pochodzącym od S. clavuligerus NRRL 3585, doniesiono, że ma inny ciężar cząsteczkowy, ale nie poddano go sekwencjonowaniu. Znane dotychczas enzymy ekspandazy są użyteczne w nowym procesie biologicznym według wynalazku. Inne ekspandazy jeszcze niezidentyfikowane, pochodzące od różnych szczepów S. clavuligerus, lub nawet od drobnoustrojów z innych rodzajów, mogą także okazać się odpowiednie do wykorzystania w nowym procesie biologicznym według wynalazku. Procedury identyfikacyjne takich nowych szczepów i rodzaje użytecznych drobnoustrojów oraz izolowanie

11 próbek enzymów ekspandaz i ustalenie czy są one przydatne w sposobie według wynalazku, jest rzeczą prostą i dostępną dla specjalistów. Skrining wolnych od komórek ekstraktów z hodowli badanych nowych szczepów i rodzajów użytecznych drobnoustrojów może być wykonywany w wiarygodny i powtarzalny sposób przez dodawanie powyższych ekstraktów do adypoilo-6-ap jako substratu w obecności znanych ko-faktorów DAOCS, do których należą jony żelazawe (Fe2+), askorbinian, α-ketoglutaran i trifosforan adenozyny (ATP). Kwas adypoilo-6-ap (substrat) może być wytwarzany w dostatecznych ilościach przez dodawanie związku adypinowego do nietransformowanego Penicillium chrysogenum w sposób analogiczny do opisanego szczegółowo poniżej. Obecny jest pożądany enzym ekspandaza jeśli tworzy się kwas adypoilo-7- -ADC, obecność którego można wykrywać chromatograficznie. Jest także możliwe, przez zastosowanie dobrze znanych technik rekombinacji, otrzymywanie próbek DNA bazując na sekwencjonowaniu ekspandazy z S. clavuligerus i C. acremonium, np. przez badanie zawartego w kandynującym organizmie DNA na zdolność wytwarzania ekspandazy odpowiedniej do stosowania w sposobie według wynalazku. Potencjonalne źródła enzymów ekspandaz Enzymy ekspandazy są, jak to już podano, enzymami, które katalizują powiększanie pierścienia penamowego (obecnego w cząsteczkach typu penicyliny) do pierścieni cefemowych-3 (obecnych w cefalosporynach). Każdy organizm wytwarzający metabolity, które zawierają pierścień cefemowy jest więc potencjalnym źródłem DNA kodującego ekspandazę. Przykłady takich organizmów są zestawione poniżej, ale zestawienie to jest tylko przykładowym i nie należy je uważać za wyczerpujące. Grzyby Cephalosporium acremonium Cephalosporium sp. Emericellopsis Paecilomyces Scopulariopsis Diheterospora Spiroidium Anoxiopsis Promieniowce Streptomyces clavuligerus S. lipmanii S. wadayamensis S. todorominensis S. filipinensis cephamycini S. heteromorphus S. panayensis S. griseus S. cattleya Nocardia lactamdurans Inne bakterie Flavobakterium sp. Alcaligenes denitrificans Mycoplana bullata Providencia rettgeri Lysobacter lactamgenus

12 Ekspandazy z organizmów wymienionych powyżej są jedynie kandydatami do dalszego badania i może się okazać, że nie wszystkie z nich będą odpowiednie dla nowego procesu według wynalazku. Np., zastosowanie enzymów, które wykazują aktywność zarówno jako ekspandazy jak i hydrosylazy, takich jak z C. acremonium, może prowadzić do syntezy hydroksylowanego kwasu adypoilo-7-adc, to jest DAC z adypoilowym łańcuchem bocznym. Izolowanie fragmentów DNA kodujących aktywność ekspandazową Po wykryciu w sposób opisany uprzednio obecności pożądanego enzymu ekspandazy można izolować DNA kodujący ten enzym w sposób prosty i dobrze znany w tej dziedzinie. W oparciu o znane sekwencje i częściowe sekwencje genów kodujących enzymy ekspandazy, konstruuje się sondy DNA, które hybrydyzują w żądanym DNA kodującym enzym, który ma być wyizolowany. Konstruowanie takich sond jest oparte na wiedzy o sekwencji aminokwasowej i zasad nukleotydowych kodujących enzym ekspandazę, jak również na preferencjach poszczególnych drobnoustrojów w odniesieniu do kodonów. Szczegółowy opis typowych procedur tego typu stosowanych do genomowego DNA Streptomyces clavuligerus ATCC przedstawiony został poniżej. Izolację DNA kodującego aktywność enzymu ekspandazy przeprowadza się stosując metody restrykcji i ligacji dobrze znane w technologii rekombinacji DNA. Niezbędnym jest również posiadanie endonukleazowej mapy restrykcyjnej genomu stosowanego drobnoustroju, aby można było wytwarzać i izolować właściwy fragment restrykcyjny. Mapy restrykcyjne dla S, clavuligerus i C, acremonium są obecnie dostępne, więc dla pierwszego z tych drobnoustrojów są stosowane enzymy restrykcyjne Bam HI i Sall, a elektroforeza pozwala na otrzymanie pożądanych fragmentów o 1,8 do 2,2 kb. Transformacja szczepu Penicillium chrysogenum Po otrzymaniu fragmentów DNA kodującego aktywność ekspandazy można je wbudowywać (ligować) do plazmidu lub innego wektora ekspresyjnego, razem z fragmentami DNA zawierającymi promotory, sekwencje aktywujące translację, markery oporności, sekwencje regulatorowe, sekwencje tworzące kosmidy oraz różne inne sekwencje DNA umożliwiające lub promujące transformację, kierujące ekspresją genu do produktu i ułatwiające izolowanie transformatorów. Skonstruowany wektor ekspresji jest następnie stosowany do przeprowadzenia transformacji Penicillium chrysogenum i wewnątrzkomórkowej ekspresji aktywności enzymu ekspandazy. Techniki stosowane do przeprowadzenia transformacji i uzyskiwania ekspresji są dobrze znane a szczegółowy opis takich procedur jest przedstawiony w dalszej części opisu. Jak to szczegółowo opisano uprzednio, transformowany szczep Penicillium chrysogenum wykazuje ekspresję aktywności genu ekspandazy wewnątrz komórki, który to enzym działa następnie in situ na kwas adypoilo-6-ap jako substrat, powiększając jego pierścień z wytworzeniem kwasu adypoilo-7-adc. Nowy transformant Specyficzny transformant Penicillium chrysogenum wykazujący ekspresję aktywności genu ekspandazy, który stanowi korzystny aspekt wynalazku, jest nowy w porównaniu ze znanymi dotychczas konstrukcjami, opisanymi np. przez Cantwella i wsp. w Current Genetic, 17, , (1990). W obu konstrukcjach stosowana jest mutageneza in vitro dla przyłączenia promotora do genu ekspandazy. W konstrukcji Cantwella wprowadzane jest miejsce Ndel przy ATG genu ekspandazy, który jest ligowany do miejsca XbaI w końcu 3' promotora IPNS przez linker XbaI/NdeI. W konstrukcji według wynalazku, jest tworzone miejsce NCoI przy ATG genu ekspandazy i ligowane do miejsca NcoI w końcu 3' linkera IPNS. Tworzy to następujące sekwencje wokół połączeń promotor-gen w tych konstrukcjach.

13 XbaI NcoI Promotor IPNS 5' TCTAGACACCATGG 3' SEQ ID NO: 1 Strep ekspandaza 5' GTGAGAGTTGATGGAC 3' SEQ ID NO: 2 Cantwell 5' TCTAGACACTATGGAC 3' SEQ ID NO: 3 Według wynalazku 5' TCTAGACACCATGGAC 3' SEQ ID NO: 4 W konstrukcji Cantwella C jest zastępowane przez T, natomiast w konstrukcji według wynalazku C jest zatrzymywane, dlatego sekwencja promotora IPNS bezpośrednio sąsiadująca z kodonem start ATG dokładnie odpowiada sekwencji znalezionej w naturalnie występującym genie IPNS. Jest możliwe, że znany dotychczas promotor, chociaż różni się tylko jedną zasadą nukleotydu, może dawać mniejszą wydajność translacji i w konsekwencji niższy poziom ekspresji genu ekspandazy. Inne różnice występują w regionach promotora lub genu wstawianego w konstrukcje. Konstrukcja Cantwella zawiera region 5' BamHI do XbaI 3' promotora IPNS, podczas gdyby wektor według wynalazku zawiera region 5' NcoI do XbaI 3' promotora [Diez i wsp., (1990), J. Biol. Chem., 265, ]. Daje to dodatkowo około 250 par zasad na końcu 5'promotora IPNS w konstrukcji Cantwella. Jednak region ten znajduje się w otwartej ramce odczytu genu syntetazy ACV w górę od genu IPNS. Konstrukcja Cantwella zawiera także gen Streptomyces od ATG do miejsca BamHI, podczas gdy wektor według wynalazku zawiera ATG do miejsca Sali 3' genu [Kovacevic i wsp., (1989), J. Bacteriol., 171, ]. Daje to około 1000 par zasad dodatkowej sekwencji końcowej 3' w konstrukcie Cantwella. Konstrukt według wynalazku ciągle jednak zawiera region w górę od genu ekspandazy do miejsca BamHI 5' ATG, ale jest on oddzielony od ramki odczytu genu ekspandazy przez promotor IPNS. Inna różnica pomiędzy konstruktem według wynalazku i znanymi dotychczas konstruktami odnosi się do stosowanego markera. Zastosowanie fuzji promotor IPNS Penicillium: gen fleomycyny w konstrukcie według wynalazku preferuje integrację licznych kopii lub integrację w loci, co pozwala na uzyskiwanie wysokiego poziomu ekspresji i potencjalnie może dawać większy procent transformantów wykazujących ekspresję genu ekspandazy na wysokim poziomie. Nowym transformantem typu opisanego powyżej jest Penicillium chrysogenum określonym jako PC100. Do jego cech taksonomicznych typowo należą takie jak wytwarzanie szeroko rozpościerających się kolonii o barwie niebieskozielonej do zielonej, gładkich z żółtymi kropkami; żółty spód dyfundujący w agar; główki konidiów rozgałęzione ze wszystkimi częściami gładkimi; konidia eliptyczne do kulistych o długości 3-4 mm. Akceptowane warunki hodowli dla P. chrysogenum to stała pożywka zawierająca 1,5% (waga na objętość) monohydratu laktozy, 0,5% (objętość na objętość) wyciągu namokowego kukurydzy, 0,5% (waga na objętość) peptonu, 0,4% (waga na objętość) NaCl, 0,05% (waga na objętość) MgSO4-7H2O, 0,06% (waga na objętość) KH2PO4, 0,0005% (waga na objętość) FeCl3 6H2O, 0,0002% (waga na objętość) CuSO4-5H2O, 3,0% (waga na objętość) agaru; w 1 litrze destylowanej wody; ph 4,8. Opisany P. chrysogenum, oznaczony jako PC 100, został zdeponowany w American Type Culture Collection (ATCC), Parklaw Drive, Rockville, Maryland 20852, pod numerem ATCC (data zdeponowania: otrzymano 21 sierpnia 1992, potwierdzono żywotność 27 sierpnia 1992). Odszczepianie adypoilowego łańcucha bocznego Następnym etapem w biologicznym procesie według wynalazku jest odszczepianie adypoilowego łańcucha bocznego z kwasu adypoilo-7-adc. Etap ten wymaga podziałania na produkt z poprzedniego etapu acylazą adypoilową. Jak już wspomniano uprzednio, jednym ze znaczących osiągnięć w sposobie według wynalazku jest możliwość prowadzenia wszystkich etapów prowadzących do wytworzenia kwasu adypoilo-7-adc w jednej hodowli fermentacyjnej. To osiągnięcie pozwala na wyjątkowe ulepszenie procesu, ze względu na zaniechanie izolowania i częściowego oczyszczania przejściowych produktów przy przechodzeniu z etapu na etap procesu. Natomiast w niniejszym ostatnim etapie, enzym acylaza adypoilowa nie jest obecna, to znaczy nie jest generowana in situ w pierwotnej hodowli fermentacyjnej.

14 Jeśli nowy proces biologiczny według wynalazku jest prowadzony w sposób periodyczny, to zachodzi konieczność izolowania i częściowego oczyszczania produktu z pierwszego etapu. Sposoby postępowania w tym przypadku opisane zostały uprzednio. Sposób według wynalazku może być jednak prowadzony dowolną drogą, która skutecznie pozwala na kontakt acylazy adypoilowej z kwasem adypoilo-7-adc tak aby mogła zajść enzymatyczna konwersja tego związku w kwas 7-ADC. Tak należy rozumieć określenia kontaktowanie w jego najszerszym kontekście. Możliwe jest stosowanie wolnej od komórek brzeczki zawierającej surowy kwas adypoilo-7-adc jako materiał wyjściowy i traktowanie porcjami brzeczki zawierającej surową acylazę adypoilową. Takie podejście daje pewne korzyści, gdyż nie wymaga praktycznie wstępnego oczyszczania reaktantów. Możliwe są oczywiście modyfikacje tej metody. Np., reaktanty mogą być w dowolnym pożądanym stopniu oczyszczane przed skontaktowaniem ze sobą. Możliwe jest także prowadzenie procesu w sposób ciągły zamiast periodycznego. Kontaktowanie reaktantów ze sobą może być rozmaicie modyfikowane dla uzyskania postępu w technologii procesu. Można więc stosować immobilizowany enzym, np. w postaci kolumny zawierającej acylazę adypoilową, przez którą to kolumnę jest przepuszczany kwas adypoilo-7adc. Immobilizowany enzym można także dodawać do roztworu kwasu adypoilo-7-adc. Takie układy zawierające immobilizowany enzym mają tę zaletę, że pozwaląją na łatwe odzyskiwanie i wielokrotne stosowanie enzymu. Innym przykładem technologii procesu jest wykorzystywanie reaktorów membranowych. Korzystnym sposobem kontaktowania reaktantów jest jednak kolumna zawierająca immobilizowany enzym. Acylazy adypoilowe użyteczne w etapie odszczepiania Istnieje szereg enzymów o znanej specyficzności względem adypoilowych łańcuchów bocznych. Wyniki uzyskane przy zastosowaniu acylazy adypoilowej dostępnej handlowo z firmy RAEV Corp. są szczegółowo omówione w przedstawionych poniżej roboczych przykładach. Z literatury jest znanych siedem innych enzymów usuwających adypoilowe łańcuchy boczne z cząsteczek typu cefalosporyny. Sześć z tych enzymów pochodzi od Pseudomonas species a siódmy od Bacillus species. Występują pewne podobieństwa pomiędzy niektórymi enzymami z Pseudomonas, ale wszystkie siedem różnią się od siebie do pewnego stopnia pod względem ich właściwości fizycznych i chemicznych. Niektóre właściwości są podane poniżej. Enzym (szczepy Pseudomonas i Bacillus) Odnośnik Przybliżony ciężar cząsteczkowy (podjednostka) P. SY-77-1 Shibuya i wsp. Pozornie taki sam (Toyo-Jozo) (1981) ja k GK 16 poniżej P. GK16 Matsuda, Komatsu (Asahi) (1985) P. SE83 (acyl) Matsuda i wsp (Asahi) (1987) P. SE83 (acyii) Matsuda i wsp (Asahi) (1987) P. diminuta N176 Aramori i wsp (Fujisawa) (1991a)* P. diminuta V22 Aramori i wsp.? (Fujisawa) (199 1a)*? Bacillus laterosporus J1 Aramon i wsp (1991b)** (monomer) Pseudomonas sp (RAEV Corp.) * Aramon i wsp., J. Ferment. Bioeng. (1991) 72: ** Aramori i wsp., J. Bactenol. (1991) 173:

15 Wszystkie powyższe acylazy adypoilowe są użyteczne w nowym biologicznym procesie według wynalazku. Inne acylazy adypoilowe użyteczne w metodzie według wynalazku mogą być łatwo odkryte za pomocą testowania kandydujących enzymów wobec kwasu adypoilo-7- -ADC, substratu który jest przez nie wykorzystywany. Pozytywny wynik daje wiarygodną i powtarzalną metodę stwierdzenia, że kandydujący enzym jest rzeczywiście użyteczny w sposobie według wynalazku. Substrat można otrzymywać bezpośrednio w reakcji bezwodnika adypinowego z kwasem 7-ADC, stosując modyfikację metody opisanej przez Szewczuka i Wellman- Bednawską w Clin. Chim. Acto (1978) 84, Bezwodnik adypinowy można otrzymywać metodą opisaną przez Albertsona i Lundmarka w J. Macromol. Sci. Chem., (1990) A27, Kwas 7-ADC jest dostępny w handlu np. w firmach E. R. Squibb & Sons, Ltd., NJ, oraz Interchem Corp., NJ. Jeśli jest pożądane prowadzenie wstępnego skriningu sprawdzanych enzymów za pomocą szybkiej metody kolorymetrycznej, to zamiast substratu kwasu adypoilo-7-adc można stosować substrat kolorymetryczny taki jak adypoilo-paba (kwas p-aminobenzoesowy) lub adypoilo-pna (p-nitroanilina). Odszczepienie łańcucha bocznego daje barwny związek, którego obecność i stężenie jest łatwo oznaczane kolorymetrycznie. Bardziej szczegółowe informacje dotyczące tych i innych odpowiednich metod kolomerycznych podali: L. P. Marelli (1968), J. Pharma. Sci., 57: ; G. Szasz (1969), Clin. Chem., 15: ; A. Szewczuk i wsp., (1980) Anal. Biochem., 103: ; oraz F. Reyes i wsp., (1989), J. Pharm. Pharmacol., 41: Dokonano porównania sekwencji N-terminalnych aminokwasów enzymu RAEV z dużymi podjednostkami enzymów acyii i GK16 podanych w powyżej przedstawionej tabeli. Wyniki porównania pokazano poniżej (dane w nawiasach wskazują na mniej niż pewne ustalenia): RAEV - SEQ ID NO:5 SN (S) (G) AYAPGKTANGNAL (L) LQN (P) GK16 - SEQ ID NO:6 SN S WAVAPGKTANGNAL L LQN P acyii - SEQ ID NO:7 SN N WAVAPGRTATGRPI L AGD P Z przedstawionych sekwencji jest oczywiste, że te wszystkie trzy peptydy są spokrewnione. Jednak, białka o sekwencji N-terminalnej podobnej do podanej powyżej niekoniecznie wykazują aktywność acylazy adypoilowej, jak to ma miejsce w przypadku acylazy penicylinowej G wytwarzanej przez szczep Arthrobacter. Z drugiej strony, istnieją acylazy adypoilowe użyteczne w sposobie według wynalazku, które nie są znacząco homologiczne z powyższą N-terminalną sekwencją. Np., enzym acyi (Asahi) i acylaza B. laterosporus J1 (Fujisawa), wymienione powyżej w tabeli, które wykazują pewną aktywność jako acylazy kwasu adypoilo-7-adc, nie mają w żadnym stopniu homologicznej sekwencji z innymi, omówionymi powyżej enzymami. W związku z tym, zakres wynalazku w odniesieniu do acylaz adypoilowych użytecznych w drugim etapie nowego procesu biologicznego jest wyznaczany przez fakt czy badany enzym jest zdolny czy nie do odszczepiania adypoilowego łańcucha bocznego z kwasu adypoilo-7-adc, co można łatwo i wiarygodnie ocenić opisanymi powyżej szczegółowo metodami. Możliwe są również inne podejścia do poszukiwania odpowiednich acylaz adypoilowych. Np., w europej skim opisie patentowym nr A-O przedstawiono metody zwiększania aktywności odszczepiającej resztę adypoilową acylazy glutarylowej wytwarzanej przez Pseudomonas SY Przez zastąpienie różnych aminokwasów w pewnych położeniach α-podjednostkami uzyskano 3 do 5 razy wyższy stopień odszczepiania reszty adypoilowej z adypoilo-seryny. Takie ulepszone enzymy mogą być także odpowiednie do stosowania w sposobie według wynalazku. Należy tu zauważyć, że chociaż w europejskim opisie patentowym nr A-O opisano acylazę o zdecydowanie poprawionej aktywności wobec adypoilowych łańcuchów bocznych, to jednak nie przedstawiono żadnych sposobów (ani chemicznych ani biologicznych w jakikolwiek

16 sposób analogicznych do tutaj opisanych), dzięki którym mogłaby być tworzona w pierwszym rzędzie adypoilocefalosporyna. Poniżej przedstawiono szczegółowy opis niektórych korzystnych odmian sposobu według wynalazku, pomyślanych jedynie jako ilustracja i nie ograniczających w żaden sposób wynalazku. Przykład I. Warunki hodowli Penicillium chrysogenum. Szczep Penicillium chrysogenum stosowany w opisywanych procedurach jest przetrzymywany na płytkach zawierających pożywkę LCSB, w skład której wchodzą: 1,5% (waga na objętość) monohydratu laktozy; 0,5% (objętość na objętość) namokowego wyciągu kukurydzy; 0,5% (waga na objętość) peptonu; 0,4% (waga na objętość) NaCl; 0,05% (waga na objętość) MgSO4 7H2O; 0,06% (waga na objętość) KH2PO4; 0,0005% (waga na objętość) FeCl3 6H2O; 0,0002% (waga na objętość) CuSO4 5 H2O; 3,0% (waga na objętość) agaru;wszystko to w 1 litrze wody; ph 4,8. Po 12 dniach przetrzymywania w temperaturze 25 C przy 65% względnej wilgotności, pojedyncze kolonie usunięto i dodano do 2 ml jałowej wody w zamykanej probówce zawierającej szklane kulki. Po macerowaniu hodowli za pomocą mieszania wirowego zawiesinę stosowano do zaszczepiania kolb z ryżem. Kolby o pojemności 250 ml zawierały po 25 g ryżu marki Uncle Ben o naturalnej długości ziaren. Ryż ten płukano 3-4 objętościami destylowanej wody w ciągu siedmiu minut, mieszano co 30 sekund i odcedzano do zawartości wody około 25%. Po 12 dniach inkubowania w temperaturze 25 C przy wilgotności względnej 65% zarodniki spłukano z ryżu 50 ml jałowej wody. Zawiesinę zarodników używano do zaszczepiania ciekłych pożywek oraz do sporządzania liofilizatorów hodowli do przechowywania w temperaturze 4 C. Zarodniki dodawano do równej objętości 5% zbieranego mleka i liofilizowano w wysterylizowanych ampułkach. Stosowano dwustadiową fermentację szczepu w kolbach trzęsawkowych w procesie wytwarzania penicylin lub dla wyprodukowania grzybni jako źródła RNA lub DNA. Stadium posiewowe zapoczątkowywano dodając 1 x 108 zarodników do 500 ml kolby zawierającej 50 ml pożywki o następującym składzie: 3,0% (waga na objętość) glukozy, 1,0% (waga na objętość) preparatu pharmamedia, 3,0% (objętość na objętość) wyciągu namokowego kukurydzy, 0,2% (waga na objętość) siarczanu amonowego, 0,5% (waga na objętość) CaCO3, 0,05% (waga na objętość) bezwodnego fosforanu monopotasowego, 1,0% (waga na objętość) laktozy, 1% (waga na objętość) suszonych drożdży, oraz 1 litr destylowanej wody. Inkubowano w temperaturze 25 C, przy wilgotności względnej 65%, na trzęsawce obrotowej, przy 220 obrotach/minutę i średnicy amplitudy 70 mm. Po 48 godzinach inkubowania rozpoczynano stadium produkcyjne przenosząc 2 ml wegetatywnej hodowli posiewowej do 500 ml kolb zawierających po 35 ml pożywki o następującym składzie: 0,05% (waga na objętość) KH2P4O, 0,5% (waga na objętość) K2SO4, 1,0% (waga na objętość) (NH4)2SO4, 12,0% (waga na objętość) laktozy, 2,75% (waga na objętość) preparatu pharmamedia, 1,0% (waga na objętość) CaCO3 strącanego, 1,0% (objętość na objętość) smalcu wieprzowego, oraz 1 litr destylowanej wody; ph 6,6. Po autoklawowaniu ale przed zaszczepieniem dodano jałowy 25% roztwór adypinianu sodowego do końcowego stężenia 2,5%. Po zaszczepieniu prowadzono inkubowanie w takich samych warunkach jak dla stadium posiewowego, w ciągu 5 do 7 dni. Gdy potrzebna była grzybnia otrzymywania protoplastów do transformacji lub jako źródło DNA, szczep hodowano w 250 ml kolbach zawierających po 50 ml kompletnej pożywki (CM) o następującym składzie: 50 ml soli 20X Clutterbucka(120 g NaNO3, 10,4 g KCl, 10,4 MgSO4 7H2O 30,4 KH2PO4), 2,0 ml mieszaniny pierwiastków śladowych Vogel a (0,3M kwasu cytrynowego, 0,2M ZnSO4, 25 mm Fe(NH4)2(SO4)2 6H2O, 10 mm CuSO4, 3 mm MnSO4, 8 mm kwasu borowego, 2 mm Na2MoO4 2H2O), 5 g tryptonu, 5 g wyciągu drożdżowego, 10 g glukozy; wszystko w jednym litrze destylowanej wody. Inkubowano w temperaturze 25 C na trzęsawce obrotowej przy 220 obrotach/minutę. Przykład II. Izolacja genomowego DNA i całkowitego RNA z Penicillium. Grzybnię wegetatywną z 48 godzinnej hodowli, otrzymaną jak opisano powyżej, odsączono przez tkaninę filtracyjną zamrożono w ciekłym azocie i liofilizowano przez noc. Suchą grzy-

17 bnię rozdrobniono z piaskiem w moździerzu i zawieszono w 25 ml roztworu zawierającego 100 mm LiCl, 50 mmedta, 10 mm Tris o ph 8,0 i 4% SDS. Zawiesinę ogrzano do temperatury 50-55% w łaźni wodnej o temperaturze 60 C i ekstrahowano najpierw fenolem wysyconym 1M Tris (ph 8), później mieszaniną 1:1 (objętość na objętość) Tris wysyconego fenolem i chloroformu i następnie chloroformem. RNA wytrącano z fazy wodnej dodatkiem równej objętości zimnego 6M roztworu LiCl i pozostawiano mieszaninę w temperaturze -20 C w ciągu dwóch do trzech godzin. Mieszaninę wirowano a przy g w ciągu 20 minut w temperaturze 4 C, do supernatanta dodano etanol do stężenia 66% (objętość na objętość) i oziębiano w temperaturze -20 C w ciągu 15 minut, powodując wytrącenie się DNA. Po wirowaniu jak opisano powyżej, pastylki DNA przemyto 70% etanolem, suszono i zawieszono w buforze TE (10 mm Tris-HCl, ph 7,5, 1 mmedta). Stężenie DNA oznaczano przez porównanie do znanych standardów DNA metodą elektroforezy na żelu agarozowym z barwieniem bromkiem etydyny. Hodowle Penicilium chrysogenum, jak opisano uprzednio w przykładzie 1, hodowano w ciągu 96 godzin w 35 ml pożywki fermentacyjnej (warunki fermentacji opisano uprzednio), w temperaturze 25 C, na trzęsawce obrotowej, przy 220 obrotach/minutę. Grzybnię odsączono przez filtr Whatman #1 pod zmniejszonym ciśnieniem i przemyto około 50 ml wody. Grzybnię natychmiast zdrapano z filtra, zawieszono w 5 ml buforu rozrywającego (50 mm Tris-HCl ph 7,4,150 mm NaCl, 5 mm EDTA ph 8,0,5% SDS), zamrożono w ciekłym azocie i liofilizowano. Po całonocnej liofilizacji dodano 5 ml wody zawierającej 0,1% DEPC i 5 ml 1M Tris (ph 8) wysyconego mieszaniną fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego (50:50:1), a następnie mieszaninę pozostawiono wstrząsając do odmrożenia w temperaturze 37 C w ciągu 20 minut. Mieszaninę wirowano w ciągu 10 minut w temperaturze 4 C przy g, po czym ekstrahowano najpierw mieszaniną 1M Tris (ph 8) wysyconego fenolem), chloroformu, i alkoholu izoamylowego (50:50:1), po czym 1M (ph 8) Tris wysyconym fenolem, i w końcu chloroformem. Do końcowej warstwy wodnej dodano równą objętość 6M roztworu LiCl i roztwór pozostawiono w temperaturze -20 C w ciągu minimum czterech godzin. Całość wirowano w ciągu 20 minut w temperaturze 4 C, przy g. Otrzymaną pastylkę RNA rozpuszczono w 0,3 ml buforu TE zawierającego 0,03 ml 3M roztworu octanu etylu i dodano 2,5 objętości etanolu dla wytrącenia RNA. Końcową pastylkę rozpuszczono w 0,1 ml buforu TE i stężenie RNA oznaczano spektrofotometrycznie mierząc absorbancję przy 260 nm. Przykład III. Warunki hodowli Streptomyces clavuligerus. Stosowanym w tej procedurze szczepem Streptomyces clavuligerus był ATCC Szczep utrzymywano na płytkach zawierających podłoże o następującym składzie: 4 g wyciągu drożdżowego, 10 g wyciągu słodowego, 4 g glukozy, 20 g agaru; wszystko w jednym litrze destylowanej wody; ph 7,2. Po 5 dniach wzrostu w temperaturze 30 C do płytek dodano 2 ml wody i hodowlę zdrapano z powierzchni agaru. Otrzymaną zawiesinę przeniesiono jałowej probówki z zakrętką zawierającej szklane kulki. Po maceracji hodowli za pomocą mieszania wirowego zawiesinę używano do zaszczepiania ciekłych pożywek. Zawiesinę także użyto do przechowywania szczepu w temperaturze -70 C z dodatkiem 15% gliceryny. Gdy potrzebna była grzybnia do otrzymywania prostoplastów do transformacji lub jako źródło DNA, szczepy hodowano w 1 litrowej kolbie zawierającej 200 ml pożywki YEME o składzie: 3 g wyciągu drożdżowego, 5 g peptonu, 3 g wyciągu słodowego, 10 g glukozy, 340 g sacharozy, 1,02 g MgCl2 6H2O, 5 g glicyny, 18 g agaru; wszystko w 1 litrze destylowanej wody. Inkubowanie prowadzono w temperaturze 28 C na trząsawce obrotowej przy 220 obrotach/minutę: Przykład IV. Izolacja genomowego DNA w Streptomyces. Wegetatywną hodowlę z 48-godzinnego inkubowania, prowadzonego jak opisano uprzednio, zebrano za pomocą wirowania w ciągu 10 minut przy g. Komórki zawieszono w 10 ml buforu TE, dodano 10 mg lizozymu i mieszaninę inkubowano w ciągu 15 minut w temperaturze 30 C. Następnie dodano 1 ml 20% SDS i natychmiast po tym 10 ml TE (ph 8) wysyconego fenolem oraz 1,5 ml 5M NaCl, po czym mieszaninę łagodnie inwertowano w ciągu 20 minut. Fazy rozdzielono wirując w ciągu 10 minut przy g a następnie usunięto warstwę wodną i przeniesiono do innej probówki. Dodano równą objętość chloroformu i mieszaninę łagodnie inwerto--

18 wano w ciągu 10 minut. Fazy znów rozdzielono wirując w ciągu 10 minut przy g, warstwę wodną usunięto i przeniesiono do nowej probówki. Ostrożnie dodano dwie objętości izopropanolu i wytrącony DNA zebrano i rozpuszczono w minimalnej ilości buforu TE, po czym dodano RNA-zy A do końcowego stężenia 20 mg/ml i roztwór inkubowano w ciągu jednej godziny w temperaturze 50 C. Następnie dodano proteazy K do końcowego stężenia 100 mg/ml razem z 100 mm NaCl i 0,4% SDS i mieszaninę inkubowano w ciągu jednej godziny w temperaturze 37 C. Roztwór ekstrahowano równą objętością TE (ph 8) wysyconego fenolem, po czym ekstrahowano chloroformem. DNA z ostatniej ekstrakcji zebrano po dodaniu dwóch objętości izopropanolu i stężenie oznaczano spektrofotometrycznie mierząc absorbancję przy 260 nm. Przyklad V. Konstrukcja biblioteki genów i izolacja fragmentu DNA zawierającego gen ekspandazy Streptomyces clavuligures Genomowy DNA Streptomyces clavuligerus otrzymany jak opisano uprzednio trawiono enzymami restrykcyjnymi Bam HI i Sal I. Trawiony DNA poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym i eluowano fragmenty zawierające 1,8 do 2,2 kb i poddano ligacji z puc18 DNA uprzednio trawionym Bam HI Sal I. Rozcieńczenia mieszaniny po ligacji stosowano do transformacji kompetentnych komórek JM109 stosując elektroporację (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA). Preparowanie kompetentnych komórek i warunki elektroporacji były zgodne z zaleceniami producentów. Transformowaną mieszaninę umieszczono na płytkach LB zawierających 100 mg/ml ampicyliny i 75 ml 2% X-Gal. Po całonocnym inkubowaniu w 37 C kolonie rekombinanta indentyfikowano, wykorzystując brak ich zabarwienia, co jest spowodowane inaktywację aktywności wektora plazmidowego genu beta-galaktozydazy. Bezbarwne kolonie naniesiono na świeżą płytkę z LB zawierającą 100 mg/ml ampicyliny. Po hodowaniu w ciągu nocy w temperaturze 37 C kolonie przeniesiono na nitrocelulozę i hybrydyzowano z sondą wytwarzaną w reakcji łańcuchowej polimerazy, która odpowiada sekwencji zasad ekspandazy genu Streptomyces clavuligerus, opisanej przez Kovacevica i wsp. J. Bacteriol., 171, (1989) i w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr Znakowanie produktu reakcji łańcuchowej polimerazy prowadzono w reakcji losowego wydłużania primerem za pomocą (32P) dctp i zestawu Oligolabelling Kit, stosując się do instrukcji producenta (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Reakcję hybrydazacji prowadzono w obecności 106 CPM znakowanej próbki, 30% formamidu, 5X SSC (0,15M NaCl), 0,015 M cytrynianu sodowego ph 7), 0,1% SDS, preparatu 5X Denhardsa (5 g fikolu, 5 g poliwinylopirolidonu i 5 g BSA w 500 ml 50X), oraz 100 mg/ml DNA grasicy cielęcej, przez noc w temperaturze 37 C. Kilka transformatorów uległo silnej hybrydyzacji z sondą. Potwierdzono metodą analizy restrykcyjnej za pomocą enzymów, że jedna kolonia zawiera wektor niosący gen ekspandazy i ten plazmid oznaczono jako pftso-1. Przykład VI. Izolacja plazmidu DNA. Szczepy E. coli zawierające plazmid hodowano w 500 ml pożywki LB (20 g/litr LB Broth Base; Gibco, Paisley, Szkocja) z 15 μg/ml tetracykliny, na trzęsawce obrotowej przy 220 obrotach/minutę, w ciągu godzin w temperaturze 37 C. Komórki odwirowano przy 4000 g w ciągu 10 minut, w temperaturze 4 C. Pastylkę komórek zawieszono w 18 ml buforu glukozowego (50 mm glukozy, 25 mm Tris ph 8,10 mm EDTA) i dodano 2 ml 40 mg/ml lizozymu (Sigma, St. Louis, MO) w buforze glukozowym. Mieszaninę inkubowano w pokojowej temperaturze w ciągu 15 minut, po czym dodano 40 ml świeżo przygotowanego 1 % roztworu SDS w 0,2N NaOH i następnie mieszaninę łagodnie wymieszano i przetrzymywano na lodzie w ciągu dziesięciu minut. Następnie dodano 30 ml 5M roztworu octanu potasowego o ph 4,8, dobrze wymieszano i otrzymaną mieszaninę pozostawiono na lodzie w ciągu następnych 10 minut Produkt rozpadu tabletek pastylkowano drogą wirowania w ciągu dziesięciu minut przy 4000 g, w temperaturze 4 C i supernatant przesączono przez tkaninę filtracyjną do sera. Do klarownego supernatanta dodano 0,6 objętości izopropanolu dla wytrącenia DNA plazmidu. Osad tworzył się podczas inkubowania w pokojowej temperaturze w ciągu 20 minut Plazmidowy DNA pastylkowano wirując przy 4000 g w ciągu 20 minut, w temperaturze 4%, po czym przemyto 70% etanolem i krótko suszono. Pastylkę zawieszono w 9 ml buforu TE, po czym dodano 10 g CsCl i 0,387 ml roztworu

19 mg/ml bromku etydyny. Roztwór wirowano w ciągu 24 godzin przy g. Otrzymane pasmo plazmidu w gradiencie chlorku cezowego wykrywano za pomocą światło ultrafioletowego, izolowano i usuwano bromek etydyny drogą ekstrakcji wodą wysyconą butanolem. Chlorek cezowy obecny w preparacie plazmidu usuwano drogą dializy wobec buforu TE i na końcu DNA zatężano stosując PEG (ciężar cząsteczkowy 8000). Stężenie DNA oznaczano spektrofotometrycznie mierząc absorbancję przy 260 nm. Przykład VII. Konstruowanie wektora transformacji Penicillium ppenftso. Wektor transformacji Penicillium konstruowano stosując gen oporności na fleomycynę jako główny wyróżniający marker. Uzyskano to izolując najpierw fragment o długości 600 par zasad, zawierający gen oporności na fleomycynę (gen białka wiążącego fleomycynę ze Streptoalloteichus hindustanus) sprzęgnięty także z terminatorem cytochromu C1 drożdży z trawienia za pomocą Bam HI/Bg1 plazmidu put713 (CAYLA, Toulouse, Cedex, Francja), metodą elektroforezy, a następnie elucji z żelów agarozowych. Izolowany fragment ligowano do miejsca Bam HI wektora pselect* (Promega Corporation) i orientację genu oznaczano za pomocą enzymatycznej analizy restrykcyjnej. Następnie wstawiono fragment Pst I o 550 parach zasad, zawierający miejsce lambda cos, co umożliwiło zastosowanie wektora do tworzenia kosmidu przy pomocy wstawek o odpowiedniej wielkości. Następnie izolowano fragment Nco I/BamHI o wielkości 1,5 kb zawierający region promotora genu syntetazy izopemcylinowej N (IPNS) z Penicillium chrysogenum (za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych i elucji z nich), z produktu trawienia za pomocą Nco I/Bam HI genomowego klonu zawierającego gen IPNS. Izolowany fragment IPNS-promotor ligowano do wektora trawionego Bam HI/Nco I. Miejsce Nco I znajduje się w kodonie start genu oporności na fleomycynę. Wektor ten oznaczono jako putz-2. Fragment o wielkości 1,645 kb, zawierający gen ekspandazy ze Streptomyces clavuligerus oczyszczano od produktów trawienia enzymami Bam HI i Sal I pftso-1 (wektor opisany uprzednio) za pomocą elektroforezy na 0,8% żelu agarozowym i elucji z tego żelu. Izolowany fragment ligowano do wektora pselect (Promega Corporation) także trawionego enzymami Bam HI i Sal I. Wektor ten oznaczono jako pftso-8. Utworzono nowe miejsce Nco I przy kodonie start ATG genu ekspandazy drogą ukierunkowanej mutagenazy pftso-8. Utworzono nowe miejsce Nco I przy kodonie start ATG genu ekspandazy drogą ukierunkowanej mutagenezy pftso-8 stosując Altered Sites in vitro Mutagenesis System (PromegaCorporation). Mutagenezę prowadzono zgodnie z instrukcją producenta. Skonstruowano oligonukleotyd komplementarny do regionu DNA sekwencj i kodującej przy kodonie ATG start na podstawie opublikowanej sekwencji genu ekspandazy Streptomyces (Kovacevic i wsp., (1990), Journal of Bacteriology, 171, ]. Oligonukleotyd syntetyzowano stosując metodę wykorzystującą cyjanoetyloaminofosfinę (aparatura firmy Pharmacia Gene Assembler). Sekwencja oligonukleotydu była następująca: SEQ ID NO 8: 3' CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 5' Mutagenezę potwierdzono za pomocą enzymatycznej analizy restrykcyjnej. Następnie izolowano fragment Nco I o długości 1,2 kb, zawierający region promotora genu syntetazy izopenicylinowej N z Penicillim chrysogenum (za pomocą elektroforezy na żelach agarowych i elucji z tych żelów) z produktów trawienia za pomocą Nco I klonu genomowego zawierającego gen IPSN. Region promotora IPNS ligowano do wektora pftso-8 w nowym miejscu Nco I utworzonym drogą mutagenezy przy ATG kodonu start genu ekspandazy. Orientację promotora w stosunku do genu ekspandazy ustalono za pomocą enzymatycznej analizy restrykcyjnej. Tę kasetę zawierającą promotor IPNS: gen ekspandazy przeniesiono następnie jako fragment Bam Hi/Sal I do ciętego za pomocą Bam HI/SA I wektora transformacji Penicillium putz-2 opisanego uprzednio. Ostateczną konstrukcję oznaczono jako ppenftso. Przykład VIII. Klonowanie promotora β-tubuliny Penicillium. Gen β-tubuliny Penicillium klonowano z biblioteki genów lambda Penicillium stosując gen β-tubuliny z Aspergillus niger jako sondę hybrydyzacyjną. Sekwencjonowanie tego klonu i

20 porównanie go ze znaną sekwencją aminokwasów kodowaną przez gen ß-tubuliny z Aspergillus niger pozwoliło na identyfikację regionu 91% homologicznego poczynając od kodonu inicjującego ATG. Sekwencje zawierające funkcjonalny promotor izolowano z miejsca pomiędzy kodonem inicjującym i miejscem rozpoznawczym przez Bam HI o 1,4 kb wyżej. Konstruowanie wektora transformacji zawierającego promotor ß-tubuliny z Penicillium Fragment o wielkości 2,0 kb rozpoznawany przez Xba/Hinc III, zawierający promotor ß-tubuliny z Penicillium ligowano do wektora pselect (Promega Corporation) także trawionego Xbal/Hind III. Utworzono nowe miejsce Nco I przy ATG kodonu start za pomocą ukierunkowanej mutagenezy, stosując Altered Sites in vitro Mutagenesis System (Promega Corporation). Mutagenezę prowadzono zgodnie z instrukcją producenta. Skonstruowano oligonukleoyd komplementarny do ATG w regionie miejsca start, który jednak zawierał kilka zmian w celu utworzenia miejsca Nco I, i stosowano go do mutagenezy. Oligonukleotyd syntetyzowano stosując metodą wykorzystującą cyjanoetyloaminofosfinę (urządzenie firmy Pharmacia Gene Assembler). Sekwencja oligonukleotydu była następująca: Seq. ID NO: 9 5' ATCTCTTTTCTAATACCTTCACCATGGGTGAGATTGTACGTGATCCC 3' Mutagenezę potwierdzono za pomocą enzymatycznej analizy restrykcyjnej. Następnie, fragment o wielkości 1,4 kb rozpoznawany przez Bam HI/Nco I, zawierający promotor ß-tubuliny z Penicillium przyłączano do utworzonego miejsca Nco I przy ATG genu ekspandazy ze Streptomyces w trawionym Bam HI/Nco I wektorze pftso- 8 (wektor opisany w przykładzie 7). Wektor ten oznaczono jako btftso-8. Fragment o wielkości 1,4 kb rozpoznawany przez Bam HI/Nco I, zawierający promotor ß-tubuliny także ligowano do trawionego za pomocą Bam HI/Nco I wektora putz-2 (wektor opisany w przykładzie 7). Ta ligacja umiejscowiła promotor ß-tubuliny bezpośrednio przed genem oporności na fleomycynę. Ten wektor oznaczono jako pcl-6. Następnie fragment Bam HI/Hind III o wielkości 2,4 kb z wektora btftso-8, który zawierał kasetę promotor ß-tubuliny: gen ekspandazy, ligowano do trawionego za pomocą Bam HI/Hind III wektora pci- 6 i otrzymano ostatecznie wektor transformacji Penicillium, w którym zachodziła ekspresja genu ekspandazy ze Streptomyces i markera oporności na fleomycynę pod kontrolą promotora ß-tubuliny. Ten wektor oznaczono jak pts-2. Przykład IX. Klonowanie promotora GAP z Penicillium. Gen dehydrogenazy gliceroaldehydo-3-fosforanowej z Penicillium klonowano z biblioteki genomowej lambda Penicillium, stosując gen GAP z Aspergillus niger jako sondę hybrydyzacyjną. Cztery potencjalnie obiecujące produkty sprawdzano dalej za pomocą produktu PCR utworzonego ze starterów dla regionu 5' genu GAP z Cephalosporium [H. Kimura i wsp. (1991), J. Ferm. i Bioeng., 71, ]. Oligonukleotydy stosowane dla starterów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) syntetyzowano metodą wykorzystującą cyjanoetyloaminofosfinę (urządzenie firmy Pharmacia Gene Assembler). Sekwencja oligonukleotydu była następująca: Seq. ID NO: 10 5' CGCGGATCCCGGCATCAACGGCTTCGGTCGTAT 3' Seq. ID NO: 11: 5' CGCGGATCCGGGCACGCGCATGGACATGCCAGTG 3' Jeden z czterech produktów oceonionych jako pozytywne hybrydyzował z produktem PCR. Fragment o wielkości 4 kb rozpoznawany przez Bam HI z tego klonu genomowego ligowano do trawionego za pomocą Bam HI wektora pselect (Promega Corporation) w celu sekwencjonowania. Ten wektor oznaczono jako pts-o. Sekwencjonowanie tego fragmentu pozwoliło na identyfikację kodonu inicjującego ATG przez porównanie ze znaczną sekwencją genu GAP z Cephalosporium. Konstruowanie wektora transformacji zawierającego promotor GAP z Penicillium W celu skonstruowania promotora GAP z Penicillium z genem ekspandazy ze Streptomyces utworzono nowe miejsce Nco I przy ATG genu GAP Penicillium, stosując ukierunkowaną mutagenezę in vitro wykorzystującą wektor pts-o. Mutagenezę prowadzono zgodnie z in-

21 strukcją producenta. Skonstruowano oligonukleotyd komplementarny do sekwencji kodującej regionu DNA przy kodonie start ATG genu GAP, ale wstawiono zasadę w celu utworzenia miejsca rozpoznawanego przez Nco I. Oligonukleotyd syntetyzowano metodą wykorzystującą cyjanoetyloaminofosfinę (urządzenie Pharmacia Gene Assembler). Sekwencja oligonukleotydu była następująca: Seq. ID NO: 12 5' CAGTAAACGCAACCATGGTTGTCCAG 3' Mutagenezę potwierdzono za pomocą enzymatycznej analizy restrykcyjnej. Następnie, fragment o wielkości 1,9 kb Nco I/Bam HI z pts-o, który zawierał promotor GAP, przyłączano do trawionego za pomocą Ncol/Bam HI wektora pft-so- 8 (wektor opisany w przykładzie 7) w celu umiejscowienia promotora GAP w genie ekspandazy ze Streptomyces. Te wektor oznaczono jako pts-o-1. Następnie fragment z wektora pts-o-1 o wielkości 3,0 kb rozpoznawany przez Bam HI/Hind III zawierający kasetę promotora GAP: gen ekspandazy, przyłączano do trawionego za pomocą Bam HI/Hind III wektora pcl - 6 (wektor opisany w przykładzie 8): Otrzymano końcowy wektor psd-1 do transformacji Penicillium, w którym następowała ekspresja genu ekspandazy ze Streptomyces pod kontrolą promotora GAP. Przykład X. Transformacja Penicillium chrysogenum. Protoplasty ze szczepu Penicillium chrysogenum, opisane uprzednio, otrzymywano zaszczepiając 50 ml pożywki CM 1 x 107 zarodnikami i hodując w ciągu 67 godzin w temperaturze 25 C na wytrząsarce obrotowej przy 220 obrotach/minutę. Grzybnię odsączono przez chustę serowarską, przeniesiono do kolb 500 ml i zawieszono w 25 ml KMP (0,7 M KCl, 0,8M mannitolu, 0,02M KPO4, ph 6,3) zawierającej 100 mg preparatu Novozyme 234 (Novo BioLabs, Bagsvaerd. Dania) i inkubowano w temperaturze 30 C przy 100 obrotach/minutę. Sferoplasty odsączono przez filtr składający się z chusty serowarskiej i wełny szklanej i uzyskano osad za pomocą odwirowywania w ciągu 10 minut przy 350 g. Sferoplasty przemyto następnie trzy razy 10 ml buforu KMP, po czym zawieszono w KPMC (KMP z dodatkiem 50 mm CaCl2 w gęstości 5 x 107 komórek/ml i pozostawiono w ciągu 20 minut w pokojowej temperaturze. Dla uzyskania transformacji Penicillium, 200 ml zawiesiny sferoplastów dodano do DNA (5 mg DNA wektora w 6,2 ml KMPC z 5 mg/ml heparyny) razem z 50 ml PPC (40% PEG o ciężarze cząsteczkowym 3500, 20 mm KPO4 ph 6,3 i 5% CaCl2 dodanego tuż przed użyciem) i mieszaninę transformacyjną inkubowano na lodzie w ciągu 30 minut. Następnie dodano 1 ml świeżo przygotowanego PPC i mieszaninę przeniesiono do 50 ml stopionego (50 C) regeneracyjnego agaru (CM z dodatkiem 1,3 M mannitolu i 3 % agaru). Mieszaninę transformacyjną rozlano na pięć płytek Petri ego, regenerowano w ciągu 24 godzin w temperaturze 25 C i płytki pokryto warstwą OL (1% pepton w 1% agarze) zawierającego 100 mg OL/50 mg fleomycyny. Ilość warstwy pokrywającej była równa ilości regeneracyjnej agaru. Płytki inkubowano w ciągu 7-14 dni w temperaturze 25 C i obserwowano na pojawienie się kolonii transformanta. Przykład XI. Badanie za pomocą HPLC produktów fermentacji, kwasu adypoilo-6 -AP i kwasu adypoilo-7-adc. Do badania wytwarzania kwasu adypoilo-6 -AP przez nietransformowany szczep P. chrysogenum i kwasu adypoilo-7-adc przez transformowany szczep P. chrysogenum stosowano wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC). Analizę wykonywano w aparacie firmy Waters, stosując system 625 podawania rozpuszczalnika, detektor 490E o zmiennej długości fali ustawiony na 220 nm i 254 nm, system przetwarzania danych 825 Maxima i kolumnę Novo-C18 jako fazę stacjonarną. Fazą ruchomą(szybkość przepływu 1 ml/minutę) była w ciągu 5 minut izokratyczna mieszanina 2% metanolu/98% 0,010 M KH2PO4 o ph 7,0 i w ciągu 15 minut mieszanina tychże składników w liniowym gradiencie metanolu od 2 do 40% o ph 7,0. Oznaczenie ilościowe kwasu adypoilo-6 -AP wykonywano stosując standardową krzywą penicyliny N, przy 220 nm, zaś do oznaczenia ilościowego kwasu adypoilo-7-adc standardową krzywą wzorca dezacetoksycefalosporyny C przy 254 nm. Badania wrażliwości kwasu adypoilo-7-adc na penicylinazę prowadzono dodając 1 jednostkę/ml penicylinazy I lub penicylinazy III do przesączów i inkubując w pokojowej temperatu-

22 rze w ciągu minut. Próbki badano za pomocą HPLC w warunkach identycznych jak opisane powyżej. Analizę spektralną w UV kwasu adypoilo-6 -AP i adypoilo-7-adc wykonywano stosując aparat firmy Waters, układ podawania rozpuszczalnika 510, fotodiodę 990 jako detektor, system przetwarzania danych 990 i kolumnę Novo-C 18 jako fazę stacjonarną. Faza ruchoma i stosowane warunki były takie same jak opisano powyżej. Izolację w dużej skali kwasu adypoilo-7-adc całej brzeczki fermentacyjnej wykonywano stosując aparat firmy Waters, układ podawania rozpuszczalnika 510, fotodiodę 990 jako detektor, system przetwarzania danych 990 i kolumnę preparatywną mbondapak C18 jako fazę stacjonarną. Fazę ruchomą (szybkość przepływu 5 ml/minutę) był izokratyczny 0,010 M roztwór KH2PO4 o ph 7,0, w ciągu 35 minut. Eluaty o absorpcji odpowiadającej czasowi retencji dla kwasu adypoilo-7-adc zbierano stosując kolektor frakcji. Przykład XII. Badania bioaktywności. Do oznaczania aktywności antybiotycznej izolowanego metodą HPLC kwasu adypoilo-6 - -AP i kwasu adypoilo-7-adc stosowano badanie biologiczne metodą dyfuzji w agarze. Dwadzieścia ml wyizolowanego produktu nakładano na 5 mm krążek na płytce z agarem LB (20 g/litr podstawowej pożywki LB z 3% agaru; Gibco, Paisley, Szkocja) zaszczepiano Bacillus subtilus ATCC lub E. coli szczep Super Sensitive (otrzymany od prof. Arnolda L. Demaina). Bacillus subtilus stosowano jak szczep wskaźnikowy dla kwasu adypoilo-6 -AP a E. coli szczep Super Sensitive jako szczep wskaźnikowy do badania kwasu adypoilo-7-adc. Po 15 godzinach inkubowania w temperaturze 37 C obrączka zahamowanego wzrostu wskaźnikowej bakterii wskazuje, że produkty wykazują bioaktywność. W próbach kontrolnych w tych badaniach stosowano dezacetoksyfalosporynę C, cefalosporyn C, penicylinę V i agar zawierający i nie zawierający penicylinazy, dla potwierdzenia struktury β-laktamowej. Przykład XIII. Badania enzymu RAEV. Oczyszczony kwas adypoilo-7-adc z całej brzeczki fermentacyjnej stosowano jako substrat do oznaczania aktywności właściwej enzymu RAEV (dostępny w firmie RAEV Corp.). Mieszaninę reakcyjną zawierającą 10 mm substratu, 1 μg enzymu RAEV i 5% gliceryny w 0,16 M KH2PO4 (całkowita objętość 50 ml) inkubowano w temperaturze 37 C. Pobierano próbki po 5 ml na starcie i po 1, 3, 5, 10, 20 i 30 minutach. Próbki te rozcieńczano 35 ml 0,010 M KH2PO4, zamrażano w temperaturze -70 C i analizowano za pomocą HPLC, stosując warunki opisane uprzednio. Aktywność enzymu RAEV wobec kwasu adypoilo-p-aminobenzoesowego, kolorymetrycznego substratu, badano stosując 5 mm substratu, 8,25 μg enzymu RAEV i 10% gliceryny w 0,065 M KH2PO4 o ph 7,0 (całkowita objętość 50 ml) i inkubując w ciągu 30 minut w temperaturze 37 C. Reakcję prowadzono w 96-otworowej płytce do mikromiareczkowania. Pięćdziesiąt ml rozcieńczenia 1/100 1M roztworu NaNO2 w 0,25 M kwasie octowym dodawano dla zakończenia reakcji i pozostawiono w pokojowej temperaturze w ciągu 3 minut. Sto ml rozcieńczenia 1/100 roztworu 10 mg/ml hydratu soli monosodowej kwasu 4-amino-5-hydroksy-2,7-naftalenodwusulfonowego w wodzie dodano do 0,5 M NaHCO3 i barwę oznaczano natychmiast przy 515 nm stosując EL 312 Bio-kinetics Plate Raeder (BioTek Instruments). Przykład XIV. Oznaczanie za pomocą HPLC produktu reakcji z enzymem RAEV. Wszystkie badania reakcji enzymu RAEV (dostępnego w formie RAEV Corp.) z kwasem adypoilo-7-adc jako substratem prowadzono za pomocą HPLC, stosując aparat firmy Waters, układ dostarczania rozpuszczalnika 625, detektor 490E o zmiennej długości fali ustawiony na 203 i 254 nm, system przetwarzania danych 825 Maxima i kolumnę Novo-C18 jako fazę stacjonarną. Fazą ruchomą (szybkość przepływu 1 ml/minutę) była w ciągu 5 minut izokratyczna mieszanina 2% metanolu i 98% 0,010 M KH2PO4 o ph 3,5 i w ciągu 15 minut mieszanina tychże rozpuszczalników w liniowym gradiencie stężenia metanolu od 2 do 40% o ph 3,5. Standard kwasu 7-ADC stosowano jako wzorzec czasu retencji produktu reakcji. Ilościowe oznaczenie wykonywano stosując standardową krzywą wzorca kwasu 7-ADC przy 254 nm.

23 Przykład XV. Analiza 13C-NMR produktu fermentacji kwasu adypoilo-7-adc. Widma 13C-NMR (szerokie pasma protonów rozprzęgano) wykonywano przy 75,4 MHz (7,1T), stosując spektrometr 1BM-AF-350 i transformacje Fouriera. Próbki zawierały 50 mg produktu z brzeczki fermentacji, kwasu adypoilo-7-adc, w 0,5 ml D2O (99,8% D, Aldrich) lub 0,5 ml DMSO-d6 99,0% D, Aldrich), w 5 mm rurkach przy 350 K. Dane NMR potwierdziły, że produkt był kwasem adypoilo-7-adc. Przykład XVI. Badanie alternatywnych enzymów acylaz adypoilowych. Poza badaniami wykorzystującymi enzym RAEV, wykazano, że adypoilowy łańcuch boczny może być usuwany z kwasu adypoilo-7-adc (i innych związków adypoilowych) przez enzymy wytwarzane przez różne drobnoustroje. W początkowym badaniu, Pseudomonas sp., szczepy SE-83 i SE-495 (zdeponowane w Fermentation Research Institute odpowiednio pod nr FERM BP-817 i FERM BP-818) oraz Pseudomonas, szczep SY-77-1 (zdeponowany w Northem Regional Research Laboratory pod numerem NNRL B-8070), hodowano w ciągu 72 godzin w pożywce zawierającej 2,0% (waga na objętość) HyCase SF, 0,5% (waga na objętość) glutaminianu monosodowego, 0,5% (waga na objętość) wyciągu drożdżowego, 0,2% (waga na objętość) sproszkowanego wyciągu kukurydzy, 0,5% (waga na objętość) oleju z nasion bawełny) i 0,1% (waga na objętość) kwasu glutarowego. Komórki odwirowano, przemyto 50 mm buforem fosforanowym o ph 8,0, zawieszono w buforze i spowodowano przepuszczalność zewnętrznych membran dodając małą ilość chloroformu. Porcje zawiesiny komórek mieszano z adypoilo-p-nitroaniliną(ad-pna) i inkubowano w temperaturze 30 C w ciągu 2 do 18 godzin. Po zakończeniu inkubacji mieszaniny zakwaszono 10% kwasem octowym. Uwolnioną p-nitroanilinę wykrywano kolorymetrycznie po jej przekształceniu w związek diazowy, stosując do tego celu zestawu odczynników wytwarzany przez Sigma Chemical Company do badań nad gammaglutamylotransferazą (Produkt firmy Sigma nr 545-A). Względne aktywności trzech szczepów wynosiły odpowiednio 100%, 85,5% i 48% dla SE-495, SE-83 i SY Stosując metody podobne do opisanych powyżej dla enzymu RAEV, wykazano także aktywność enzymów SE-83 i SE-495 wobec kwasu adypoilo-7-adc. Wytwarzanie beta-laktamazy przez SY-77-1 uniemożliwiło wykazanie aktywności dezacylującej tego szczepu wobec kwasu adypoilo-7-adc. W podobny sposób wykazano wytwarzanie acylazy adypoilowej przez dwa szczepy grzybów (Altemaria sp. MA-133, ATCC No i Aspergillus sp MA-13, ATCC No ; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki , Meiji Seika Kaisha Ltd.) oraz trzy dodatkowe szczepy bakteryjne (Brevibacterium ATCC No ; Achromobacterium, ATCC No oraz Flavobacterium, ATCC No ), które zostały opisane jako producenci acylazy cefalosporynowej C (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr ; Merck & Co., Inc).