PL B1. POLITECHNIKA WARSZAWSKA, Warszawa, PL BUP 24/15. JOLANTA MIERZEJEWSKA, Warszawa, PL ALEKSANDRA MULARSKA, Ząbki, PL

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 1/16 ( ) C12N 1/18 ( ) C12R 1/865 ( ) C12P 7/02 ( ) C12P 7/22 ( ) (54) Szczep drożdży Saccharomyces cerevisiae AM1-d, zastosowanie szczepu drożdży Saccharomyces cerevisiae AM1-d do produkcji 2-fenyloetanolu oraz zastosowanie podłoża do produkcji 2-fenyloetanolu przez szczep drożdży Saccharomyces cerevisiae AM1-d (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 24/15 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/17 (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA WARSZAWSKA, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: JOLANTA MIERZEJEWSKA, Warszawa, PL ALEKSANDRA MULARSKA, Ząbki, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Joanna Bocheńska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep drożdży Saccharomyces cerevisiae AM1-d produkujący 2-fenyloetanol z wydajnością 3,4 3,9 g na litr pożywki w warunkach hodowli okresowej w skali laboratoryjnej w 300 ml kolbkach stożkowych Erlenmeyera z wytrząsaniem. 2-fenyloetanol (ang. 2-phenylethanol skrót 2-PE) aromatyczny alkohol o różanym zapachu, który występuje naturalnie w płatkach wielu kwiatów i roślin, znalazł szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym, perfumeryjnym i kosmetycznym. Na skalę przemysłową może być otrzymany poprzez ekstrakcję z płatków róży lub na drodze syntezy chemicznej. Ponieważ ekstrakcja jest bardzo kosztowna, a synteza chemiczna tego związku generuje wiele toksycznych odpadów poszukuje się innych metod produkcji 2-PE. Wzrost wrażliwości społeczeństwa na problemy ekologiczne przyczynia się do wyboru przyjaznych dla środowiska metod produkcji związków zapachowych, co stanowi impuls do rozwoju rynku aromatów pochodzenia biotechnologicznego. W dyrektywie Rady WE (The Council of the European Communities. Council Directive 88/388/EEC of 22 June 1988) określono, że za naturalne substancje aromatyzujące uważa się nie tylko związki wydzielone ze źródeł naturalnych przez zastosowanie procesu fizycznego (np. ekstrakcji), lecz także otrzymane w wyniku biotransformacji przeprowadzonej przy użyciu enzymów lub mikroorganizmów, co znane jest z publikacji J. Krzyczkowska, E. Białecka-Floriańczyk, I. Stolarzewicz, ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2009, 3 (64), 5. Z dotychczas prowadzonych badań wydaje się, że najlepszymi mikroorganizmami produkującymi 2 fenyloetanol są drożdże. Wiele szczepów wykazuje zdolność do produkcji 2-PE de novo lub biokonwersji substratu L-fenyloalaniny, ale znacznie różnią się wydajnością. Klasyczne metody pozwalające na zwiększenie wydajności produkcji 2-PE to selekcja szczepów, optymalizacja składu pożywki i warunków hodowli. Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep drożdżowy Saccharomyces cerevisiae AM1-d, który zdeponowano w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP2055p. Szczep ten stworzono na drodze fuzji laboratoryjnych haploidalnych szczepów S. cerevisiae AT12-1C MATct ade1 i AB1-4A MATa his4. Przeprowadzono optymalizację składu pożywki oraz warunków hodowli w skali laboratoryjnej w 300 ml kolbkach stożkowych Erlenmeyera z wytrząsaniem. W opracowanych warunkach szczep Saccharomyces cerevisiae AM1-d produkował 2-PE w stężeniu ok. 3,4-3,9 g/l. Biorąc pod uwagę dane literaturowe jest to bardzo wysoka wydajność trudna do uzyskania w tego typu hodowlach bez zastosowania ekstrakcji produktu in situ, ponieważ otrzymane stężenie 2-PE w cieczy pohodowlanej jest bliskie granicznej wartości 4 g/l, które jest toksyczne dla komórek drożdży. Ponadto jest to najprawdopodobniej pierwszy szczep S. cerevisiae laboratoryjny uzyskany na drodze fuzji dwóch szczepów laboratoryjnych, który tak wydajnie produkuje 2-PE. Cechy morfologiczne i fenotypowe nowego szczepu Szczep S. cerevisiae AM1-d jest prototroficznym diploidem. Zarówno na pożywce minimalnej WO (o składzie 20 g/l glukozy, 6,7 g/l YNB oraz 20 g/l agaru), jak i pełnej YPD (o składzie 20 g/l glukozy, 20 g/l peptonu mięsnego, 10 g/l ekstraktu drożdżowego oraz 20 g/l agaru) tworzy typowe dla drożdży mleczne kolonie. Rośnie w temperaturach C (tylko w tym zakresie temperatur szczep był testowany). Wyniki badań zostały zilustrowane na wykresach, gdzie fig. 1 pokazuje stężenie 2-PE (w/v) w cieczach pohodowlanych szczepu S. cerevisiae AM1-d rosnącego na podłożu NEO, 2, 3 i YPD, fig. 2 pokazuje krzywą wzrostu S. cerevisiae AM1-d na podłożu 3, a fig. 3 przedstawia stężenie 2-PE wyprodukowanego przez szczep S. cerevisiae AM1-d w pożywce 4 i 8 po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji. Wynalazek ilustrują poniższe przykłady wykonania. P r z y k ł a d I Stworzenie nowego szczepu drożdży S. cerevisiae AM1-d Przetestowano szczepy laboratoryjne drożdży S. cerevisiae, które są w kolekcji szczepów Zakładu Technologii i Biotechnologii Środków Leczniczych Wydziału Chemicznego Politechniki Warszawskiej na zdolność do produkcji 2-PE. Z pośród nich dwa, AT12-1C MATa ade1 i AB1-4A MATa his4, produkowały najwięcej 2-PE w zastosowanych przez nas warunkach, aczkolwiek był to niski poziom produkcji. Na drodze syntezy de novo te dwa szczepy produkowały maksymalnie do 0,1 g 2-PE/l, a w biotransformacji L-fenyloalaniny do 0,9 g/l po 72 h hodowli. Jedną ze standardowych metod modyfikacji szczepów drożdżowych jest koniugacja, a następnie fuzja haploidalnych szczepów i tworzenie diploidów, które będą wykazywały lepsze cechy biotechnologiczne. W celu wyselekcjono-

3 PL B1 3 wania lepszego producenta 2-PE przeprowadzono fuzję auksotroficznych haploidalnych szczepów: S. cerevisiae AT12-1C i S. cerevisiae AB1-4A. Pobrano materiał z pojedynczych kolonii z obydwu szczepów i wymieszano ze sobą, a następnie wysiano na pożywkę minimalną WO. Szalki wstawiono na 3 dni do 30 C. Kolonie, które wyrosły następnie przesiewano na świeże pożywki minimalne WO, aby upewnić się, że są prototroficzne i nie wymagają dodatków pokarmowych, które były potrzebne dla przeżycia wyjściowych auksotroficznych szczepów haploidalnych użytych do koniugacji. P r z y k ł a d II Warunki hodowli szczepu S. cerevisiae AM1-d do produkcji 2-fenyloetanolu Drożdże rozsiewano redukcyjnie na płytkach Petriego ze stałą pożywką YPD i inkubowano 2 dni w temperaturze 30 C. Następnie, zaszczepiano kilkoma pojedynczymi koloniami 80 ml płynnego YPD w kolbie o pojemności 300 ml i hodowano przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem (SI-600R LabCompanion) w temperaturze 30 C i przy stałej prędkości wytrząsania 200 rpm. Po 24 godzinach hodowli zmierzono gęstość optyczną OD600 (ang. optical density) inokulum (spektrofotometr SP- 830 PLUS Metertech) przy długości fali równej 600 nm. Następnie, żwirowano 2 minuty 5000 rpm (Centrifuge 5804R Eppendorf), 20 C, aby oddzielić biomasę od pożywki. Zaszczepiono uzyskaną biomasą 150 ml odpowiedniego podłoża, aby uzyskać hodowlę o początkowej OD600 0,1. Prowadzono hodowlę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 C i prędkością wytrząsania 200 rpm. Po 24, 48 i 72 h pobierano po 40 ml hodowli do falkonów, które wirowano 2 minuty, 6000 rpm, 4 C. Następnie, ciecz pohodowlaną przenoszono do nowych falkonów, aby oznaczyć w niej stężenie 2-PE. Aby sprawdzić wydajność produkcji 2-PE na drodze biotransformacji substratu L-fenyloalaniny wykorzystywano znane pożywki: NEO (ang. nitrogen essentials optima), która zawierała 20 g/l glukozy, 4 g/l L-fenyloalaniny, 4 g/l KH2P04, 0,4 g/l MgSO 4 7 H 2 O, 1 g/l ekstraktu drożdżowego (ph = 5,1) [3][5], podłoże 2 o składzie: 20 g/l glukoza, 2.5 g/l ekstrakt drożdżowy, 1 g/l L-fenyloalanina (ph = 6,1) [7], podłoże 3 o składzie: 22 g/l glukoza, 8 g/l sacharoza, 9 g/l L-fenyloalanina, 0,5 g/l MgSO 4 bezw. cz., 1,7 g /I YNB bez aminokwasów i siarczanu amonu (ph = 4,7) [6], Dla porównania z wydajnością syntezy de novo szczepy hodowano na pożywce pełnej YPD (ph = 6,2). P r z y k ł a d III Oznaczanie stężenia 2-fenyloetanolu w cieczy pohodowlanej Stężenie 2-PE sprawdzano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC Agilient Technologies 1200 series) z detektorem UV-VIS (detektor Spectra System) i kolumną z wypełnieniem C18, 150 x 4,6 mm, ziarno 5 m (kolumna Zorba Eclipse XDB). Krzywą kalibracji, o współczynniku determinacji R2 = 0,999, wykonano odważając określoną ilość 2-PE (ALDRICH) i rozpuszczając ją w odpowiedniej ilości acetonitrylu do HPLC (POCH). Jako eluent wybrano mieszaninę acetonitryl:woda w stosunku 30:70. Mierzono absorbancję przy długościach fal 200 nm, 210 nm, 220 nm. Przed puszczeniem próbek z cieczy pohodowlanych na HPLC rozcieńczano je acetonitrylem w stosunku 1:1. Jeżeli pole powierzchni piku odpowiadającego 2-PE wykraczało poza obszar krzywej kalibracji próbkę dodatkowo rozcieńczano. Na rys.1 pokazano stężenia 2-PE w cieczach pohodowlanych opisanych w przykładzie II. Uzyskane wyniki pokazują, że na podłożu 3 drożdże produkują najwięcej 2-PE, prawie 3,9 g/l po 72 h hodowli. Szczep AM1-d również de novo bez dodatku L-fenyloalaniny jest zdolny do wyprodukowania 0,25 g 2-PE na litr pożywki YPD. Gdy porówna się uzyskane wyniki z dostępnymi danymi dotyczącymi produkcji 2-PE w drożdżach S. cerevisiae w hodowlach okresowych w kolbach, to nowy szczep AM1-d produkuje najwięcej 2-PE. Rys 1. Stężenie 2-PE (w/v) w cieczach pohodowlanych szczepu S. cerevisiae AM1-d rosnącego na podłożu NEO, 2, 3 i YPD. P r z y k ł a d IV Wyznaczenie krzywej wzrostu dla szczepu S. cerevisiae AM1-d na podłożu 3 Po 24 h zmierzono OD600 inokulum przygotowanego jak opisano w przykładzie II. Biomasę z inokulum oddzielono od pożywki namnażającej i zaszczepiono 80 ml pożywki 3 tak, aby uzyskać hodowlę o początkowej OD600 równej 0,1. Powadzono 72-godzinną hodowlę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 C i przy prędkości mieszania 200 rpm. Przez pierwsze 10 godzin, co godzinę mierzono OD600 hodowli, natomiast co dwie godziny wysiewano po 0,1 ml odpowiednich rozcieńczeń na szalki ze stałym podłożem YPD, aby obliczyć jtk (ilość jednostek tworzących kolonie) na

4 4 PL B1 ml. Równocześnie pobierano po 2 ml hodowli, które wirowano 2 minuty, 6000 rpm, 4 C. Następnie, supernatant przenoszono do nowych falkonów i służył on do oznaczania stężenia 2-PE. Kolejne pomiary wykonano w ten sam sposób po 24, 48 i 72 h hodowli. Uzyskane wartości OD600, jak i jtk/ml zostały wykorzystane do wyznaczenia krzywej wzrostu rys. 2, fenyloalanina, 4 g/dm 3 KH 2 PO 4, 0,4 g/dm 3 MgSO 4 7 H 2 O, 1 g/dm 3 ekstrakt drożdżowy (ph = 5,1), rys. 2. Krzywa wzrostu S. cerevisiae AM1-d na podłożu 3. P r z y k ł a d V Optymalizacja składu pożywki do produkcji 2-PE Przygotowano modyfikacje wykorzystywanych pożywek opisanych w przykładzie II odpowiednich do produkcji 2-PE. Z pośród nich dwie pożywki: podłoże 4 o składzie: 10 g/dm 3 glukoza, 10 g/dm 3 sacharoza, 6 g/dm 3 L i podłoże 8 o składzie: 15 g/l glukoza, 8 g/l sacharoza, 5 g/l L-fenyloalanina, 0,5 g/i MgSO 4 bezw. cz., 1,7 g/l YNB bez aminokwasów i siarczanu amonu (ph = 4,6) okazały się być najlepszymi podłożami dla szczepu S. cerevisiae AM1-d. Przygotowano inokulum szczepu S. cerevisiae AM1-d i prowadzono hodowle w podłożach 4 i 8 tak samo jak w przykładzie II. Rys. 3 przedstawia stężenie 2-PE wyprodukowanego przez szczep S. cerevisiae AM1-d w pożywce 4 i 8 po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji. Na podłożu 4 szczep już po 48 h wyprodukował 3,1 g/l, a po 72 h 3,4 g/l. Rys. 3. Stężenie 2-PE (w/v) w cieczach pohodowlanych szczepu S. cerevisiae AM1-d rosnącego na podłożu 4 i 8. Stężenie 5 g/l L-fenyloalaniny w podłożu 8 wystarczyło, aby uzyskać praktycznie takie samo stężenie 2-PE jak na pożywce 3 (około 3,8 g/l), która zawierała aż 9 g/l tego substratu. Uzyskanie z 5 g L-fenyloalaniny (w pożywce 8) 3,838 g/l 2-PE, oznacza, że uzyskano masową wydajność 76,76%. Jest to najprawdopodobniej dotychczas najwyższa wydajność produkcji 2-PE w przeliczeniu na masę substratu, L-fenyloalaniny, uzyskana przy użyciu drożdży. Zastrzeżenia patentowe 1. Szczep drożdży Saccharomyces cerevisiae AM1-d, który zdeponowano w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno- Spożywczego pod numerem KKP2055p. 2. Zastosowanie szczepu drożdży Saccharomyces cerevisiae AM1-d (KKP2055p) do produkcji 2-fenyloetanolu na drodze biotransformacji L-fenyloalaniny. 3. Zastosowanie podłoża 4 o składzie: 10 g/l glukoza, 10 g/l sacharoza, 6 g/l L-fenyloalanina, 4 g/l KH 2 PO 4, 0,4 g/l MgSO 4 7 H 2 O, 1 g/l ekstrakt drożdżowy (ph = 5,1) do produkcji 2-fenyloetanolu przez szczep drożdży Saccharomyces cerevisiae AM1-d. 4. Zastosowanie podłoża 8 o składzie: 15 g/l glukoza, 8 g/l sacharoza, 5 g/l L-fenyloalanina, 0,5 g/l MgSO 4 bezw. cz., 1,7 g/l YNB bez aminokwasów i siarczanu amonu (ph = 4,6) do produkcji 2-fenyloetanolu przez szczep drożdży Saccharomyces cerevisiae AM1-d.

5 PL B1 5 Rysunki

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)