Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

Transkrypt

1 Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

2 Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich (lub prawie wszystkich) białek komórkowych Zalety analizy proteomu np. w porównaniu z analizą trankryptomu: analiza transkryptomu komórki identyfikacja mrna nie oznacza jeszcze że będziemy wiedzieć jakie białko pojawi się w komórce badając proteom analizujemy ostateczne elementy strukturalne i funkcjonalne komórki

3 Etapy klasycznej analizy proteomu komórki dwukierunkowa elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym identyfikacja poszczególnych białek poprzez spektrometrię mas np. typu MALDI-TOF

4

5 Proteomika funkcjonalna- zadania : Identyfikacja i charakterystyka białek uczestniczących w złożonych procesach biochemicznych Analiza oddziaływań białek z innymi białkami, kwasami nukleinowymi, ligandami niskocząsteczkowymi Określanie składu i funkcji kompleksów makromolekularnych Badanie powiązań pomiędzy kaskadami przemian biochemicznych Poznanie mechanizmów ich regulacji

6 Oddziaływanie typu DNA-białko Technika opóźnienia (reterdacji) migracji fragmentów DNA w żelu poliakrylamidowym EMSA (ang. electrophoretic mobility shift assay albo ang. gel shift assay) Technika badania odcisku stopy ang. footprinting Przykładowe zastosowania: Badanie oddziaływań czynników transkrypcyjnych wiążących się z operatorami, enhacerami, silencerami Badanie oddziaływań białek strukturalnych z DNA Wiele innych

7 EMSA- Gel Shift Assay Opóźnione DNA (związane z białkiem) Wolne DNA UWAGA: w eksperymentach typu EMSA czy foortprinting najczęściej używa się białek rekombinowanych nadprodukowanych w układach heterologicznych

8 Technika badania odcisku stopy footprinting pozwala precyzyjne określić miejsce wiązania się białka do DNA Wyznakować jeden koniec badanego odcinka DNA np. izotopowo Poddać trawieniu DNA za pomocą DNazy I, która trawi DNA przypadkowo (UWAGA!!! Należy zastosować łagodne warunki trawienia, tak aby każda cząsteczka została przecięta tylko raz) Reakcję trawienia fragmentu DNA przeprowadza się w dwu powtórzeniach: do jednego dodaje się białko, które z tym fragmentem DNA oddziałuje Uzyskujemy mieszankę wyznakowanych fragmentów DNA, różniących się od siebie długością o 1 nt, które rozdziela się na żelu poliakrylamidowym Związanie białka do DNA zapobiega trawieniu kwasu nukleinowego przez DNazę I w miejscu związania W efekcie pewne fragmenty nie powstają widoczna jest przerwa w prążkach tzw. odcisk stopy footprint, który powstał w miejscu związania z białkiem.

9 Badany fragment DNA używany w doświadczeniu footprinting jest równocześnie poddawany sekwencjonowaniu produkty wszystkich trzech reakcji (trawienia wolnego fragmentu DNA, trawienia fragmentu DNA+białko, sekwencjonowania) rozdziela na jednym żelu poliakrylamidowym porównanie drogi migracji fragmentów trawionej próbki DNA bez białka z rozdziałem produktów sekwencjonowania pozwala dokładnie określić sekwencję miejsca DNA, w którym doszło do związania białka + A T G C G C T G A T G G C C

10 System dwuhybrydowy pozwala zbadać oddziaływanie typu białko-białko W systemie dwuhybrydowym potwierdzamy interakcję dwóch znanych białek ( znanych tzn. musimy znać geny, które te białka kodują). Możemy także dość precyzyjnie zmapować miejsca takich interakcji w białku (np. wykazać, że dwa białka oddziałują ze sobą swoimi N-końcami) podobnie jak w -komplementacji w systemie dwuhybrydyowym występuje łączeniu dwóch polipeptydów w jedno funkcjonalne białko w tym systemie wykorzystujemy geny reporterowe tworzymy tzw. fuzje genowe, czyli łączymy sekwencje kodujące (geny) w taki sposób, żeby ich fazy odczytów były zgodne

11 System dwuhybrydowy został opracowany w drożdżach, gdzie zidentyfikowano czynnik transkrypcyjny, składający się z dwóch domen: wiążącej i aktywującej transkrypcję Funkcjonalny czynnik transkrypcyjny może powstać pośrednio (podobnie jak aktywna β-galaktozydaza w -komplementacji) przez interakcję innych oddziałujących ze sobą białek dołączonych do każdej z tych dwóch domen czynnika Bezpośrednie oddziaływanie dwóch białek możemy pokazać przez pośrednie połączenie dwóch domen czynnika transkrypcyjnego

12 Wykorzystując to zjawisko skonstruowano sztuczny układ, w którym czynnik transkrypcyjny uruchamia transkrypcję genu reporterowego, co pozwala śledzić oddziaływanie dwóch znanych białek Funkcjonalny czynnik transkrypcyjny złożony z domeny wiążącej się z DNA i aktywującej transkrypcję, który powstaje w wyniku bezpośredniego oddziaływania dwóch białek uruchamia transkrypcję genu reporterowego, co z kolei możemy łatwo zaobserwować komórkach białka fuzyjne połączenie genów X/Y z genami kodującymi domeny wiążącą DNA i aktywującą czynnika transkrypcyjnego w zgodnych fazach odczytu kodonów (fuzje genowa) Do konstrukcji fuzji genowych potrzebne jest klonowanie molekularne

13 przynęta zdobycz Wektory plazmidowe muszą mieć zgodne miejsca startu replikacji

14 Macierze peptydowe (ang. peptide arrays) Bezkomórkowe układy peptydów (zwykle syntetyzowanych sztucznie na podstawie znanych sekwencji genów) stanowiących reprezentację wszystkich lub prawie wszystkich białek danego organizmu przeznaczone do równoczesnych analiz (badania odziaływania z innymi białkami, interakcji z DNA, aktywności enzymatycznych itp.)

15 Pomiędzy peptydem a podłożem znajduje się tzw. grupa dystansowa (ang. spacer), element chemiczny który zapewnia większą swobodę konformacyjną (pozwala peptydowi sfałdować się w określony sposób) i ułatwia dostęp składników badanej próbki do immobilizowanych peptydów grupa dystansowa (spacer) W przeciwieństwie do kwasów nukleinowych, białka stanowią populację bardzo heterogennych cząsteczek pod względem stabilności i własności fizykochemicznych. Macierz białkowa jest nietrwała - utrzymanie poprawnie zwiniętych i funkcjonalnych peptydów na macierzy jest trudne, ale dzięki bezkomórkowym systemom ich otrzymywania powielanie macierzy peptydowych jest dość łatwe i nie ma potrzeby długiego przechowywania gotowych macierzy

16 Przykładowe zastosowania: Badanie specyficzności substratowej enzymów proteolitycznych Mapowanie epitopów Badanie oddziaływań fragmentów białek z innymi białkami i DNA