KLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY

Transkrypt

1 KLONOWANIE DNA Klonowanie DNA jest techniką powielania fragmentów DNA DNA można powielać w komórkach (replikacja in vivo) W probówce (PCR) Do przeniesienia fragmentu DNA do komórek gospodarza potrzebny jest WEKTOR REKOMBINACJA DNA rekombinacja DNA to łączenie ze sobą dowolnych fragmentów DNA z wektorem i wprowadzanie ich do mikroorganizmu, w którym uzyskany hybrydowy/ zrekombinowany DNA będzie się namnażać i/ lub ulegać ekspresji. Fragment DNA, który chcemy sklonować może być produktem reakcji amplifikacji (PCR) lub dowolnym fragmentem o znanej długości np. po trawieniu enzymami restrykcyjnymi. WEKTORY Wektory są to elementy genetyczne, które mają zdolność do namnażania po wprowadzeniu do komórki biorcy (mikroorganizmu), zawierają tzw. markery selekcyjne posiadają unikalne miejsca rozpoznawane przez enzymy selekcyjne w obrębie rejonów, w które można wprowadzić obcy fragment DNA, bez naruszania zdolności wektora do replikacji i możliwości selekcji zrekombinowanych cząsteczek posiadają tzw. mały zakres gospodarza nie posiadają zdolności koniugacyjnych 1

2 WEKTORY Plazmidy-długość insertu do 1Kb Fagi Kosmidy- długość insertu do 45Kb Wektory wahadłowe/czółenkowe (shuttle vectors) plazmid chromosom ETAPY KLONOWANIA LIGACJA TRANSFORMACJA WYSIEW BAKTERII NA PODŁOŻA SELEKCYJNE HODOWLA TRANSFORMANTÓW NA PODŁOŻU PŁYNNYM IZOLACJA WEKTORA Z BAKTERII (MINILIZA) Mieszanina ligacyjna: bufor wektor produkt PCR (insert) ligaza H 2 O LIGACJA proporcje wektor : insert jak 1:3 Inkubacja 1h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 C zrekombinowany wstawka DNA (insert) 2

3 TRANSFORMACJA Wektory przedostają się do wnętrza komórki bakteryjnej przez tzw. strefy adhezji- miejsca, w których błona cytoplazmatyczna zlewa się z błoną zewnętrzną tworząc kanał pobieranie DNA zachodzi w temperaturze ok. 0 C obecność jonów Ca 2+ równoważy ujemne ładunki jonowe fosfolipidów błony zewnętrznej powoduje percypitację DNA na powierzchni komórek bakteryjnych powoduje zmiany w strukturze błony komórkowej szok cieplny (temp C), lub elektryczny wspomaga proces adhezji α-komplementacja gen lacz - koduje β -galaktozydazę, enzym rozkladajacy laktozę do glukozy i galaktozy.transkrypcja genu lacz możliwa jest tylko w obecności laktozy lub jej analogów, które znajdują w pożywce. zmutowany gen lacz wytwarzający nieaktywny N-terminalny fragment β- galaktozytazy (fragment α), niezdolny do rozkładu laktozy zmutowany gen lacz wytwarzający nieaktywny C-terminalny fragment β- galaktozytazy (fragment ω), niezdolny do rozkładu laktozy α plazmid Zmutowany szczep E.coli ω α ω Podłoże zawierające laktozę lub jej analog; X-gal; ampicylina α-komplementacja Włączenie cząsteczki obcego DNA do plazmidu trwale blokuje gen lacz, a więc fragment α nie jest wytwarzany i nie może zajść α-komplementacja. Ponadto do podłoża dodaje się jeszcze chromogen X-gal, który jest rozkładany przez β-galaktozydazę dając niebieskie zabarwienie kolonii. α plazmid Zmutowany szczep E.coli ω insert blokujący gen lacz Podłoże zawierające laktozę lub jej analog; X-gal; ampicylina 3

4 gen oporności na ampicylinę gen lacz synteza β-galaktozydazy, rozkład X-gal do niebieskiego produktu insert brak β-galaktozydazy, X-gal nie rozkłada się Hodowlę bakterii na podłożu stałym prowadzi się przez noc w temperaturze 37 0 C. ROZRÓŻNIANIE TRANSFORMANTÓW RODZAJ KOLONII AMPICYLINA X-GAL Bakterie bez plazmidów - - Bakterie z plazmidami niezrekombinowanymi Bakterie z plazmidami zrekombinowanymi + niebieskie + białe WEKTORY PLAZMIDOWE Skonstruowane są z fragmentów naturalnie występujących plazmidów, odcinków DNA chromosomalnego, fagowego lub syntetycznych oligonukleotydów. Przeciętna wielkość wektora plazmidowego to pz 4

5 WEKTORY PLAZMIDOWE wektory namnażające fragmenty dwuniciowego DNA wektory namnażające mrna (ekspresyjne) wektory namnażające jednoniciowy DNA (poprzez włączenie miejsc ORI z faga M13) liczba kopii na komórkę: pbr322 i pochodne; puc; Oba typy plazmidów mają ten sam replikon i mogą współistnieć w jednej komórce bakteryjnej W obu typach plazmidów w miejscach wiązania insertu włączone zostały fragmenty syntetyczne, rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne- polilinkery WEKTORY PLAZMIDOWE Małe rozmiary wektorów puc sprawiają, że replikują częściej, mają większą pojemność-włączają większe inserty oraz łatwiej transformują komórki biorcy Selekcja zrekombinowanych klonów zachodzi: - poprzez wyprodukowanie β-galaktozydazy (w przypadku, gdy brak jest insertu), - poprzez zahamowanie wzrostu klonów wywołane ekspresja genu letalnego dla komórek gospodarza (w przypadku, gdy brak jest insertu) WEKTORY FAGOWE Bakteriofag λ i pochodne dwuniciowy, zawierający jednoniciowe, kohezyjne fragmenty cos, zmodyfikowany poprzez wprowadzenie: polilinkerów oraz delecji (na obszarze do 25% pierwotnej długości faga), które wypełniane są insertem długość ok 48Kb łączenie z insertem na drodze substytucji- wycięcie enzymem restrykcyjnym miejsc nieistotnych dla funkcji życiowych i wypełnienie insertem Selekcja zrekombinowanych fagów zachodzi w trakcie pakowania DNA faga do kapsydu- w przypadku niewypełnionych delecji fag nie zapełnia kapsydu i ginie 5

6 WEKTORY FAGOWE Bakteriofag M13 i pochodne jednoniciowy, w komórce może występować do 300 kopii po wniknięciu DNA do bakterii następuje synteza drugiej nici i replikacja formy dwuniciowej (kolistej) i w tej formie się powiela końcowa faza infekcji to powstanie jednoniciowego DNA, który w osłonkach białkowych wydostaje się z komórki nie powodując jej lizy długość ok 6,5Kb łączenie z obcym DNA na drodze insercji- nacięcie enzymem restrykcyjnym miejsca z pozostawieniem lepkich końców, w które ligowany będzie insert Seklekcja zrekombinowanych fagów na postawie syntezy β-galaktozydazy WEKTORY KOSMIDOWE Nazwa kosmid pochodzi od wbudowanego do plazmidu fragmentu cos faga λ Wielkość kosmidów waha się między 5 a 9Kb Włączanie kosmidów do bakterii odbywa się na ogół poprzez infekcję fagiem λ (nie przez transformację) w pierwszej fazie fragmenty cos odpowiadają za fragmentację insertu, tak aby zmieścił się on w kapsydzie faga w drugiej fazie (po infekcji) fragmenty cos odpowiadają za cyrkularyzację kosmidu (kohezyjne końce cos łączą się) 6