Inżynieria genetyczna- 6 ECTS. Inżynieria genetyczna. Podstawowe pojęcia Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka

Transkrypt

1 Inżynieria genetyczna- 6 ECTS Część I Badanie ekspresji genów Podstawy klonowania i różnicowania transformantów Kolokwium (14pkt) Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka Kolokwium (26pkt) EGZAMIN 55pkt Obecności + aktywność 5pkt Inżynieria genetyczna Celowa ingerencja w organizm, polegająca na wprowadzeniu do genomu żywego organizmu nowych informacji genetycznych Przeniesienie genów z jednego organizmu do innego, lub zmodyfikowanie genomu poprzez izolowanie lub eliminację kodu genetycznego W wyniku takich zabiegów organizm ulega modyfikacji, przybierając cechy zgodne z oczekiwaniami; zmianom ulegają: - właściwości fizyczne (np.: rozmiar, masa, wygląd, kolor, itp.) - fizjologiczne (np.: procesów wzrostu i starzenia się, odporności, itp.) Podstawowe pojęcia Transformacja- wprowadzenie do komórki fragmentu DNA innego organizmu Transgen - gen lub materiał genetyczny przeniesiony z komórek jednego organizmu do innego (także z wirusów) Organizm transgeniczny (transformant)= modyfikowany genetycznie (GMO)- organizm (i jego potomstwo) otrzymany po transformacji Klonowanie- tworzenie identycznej kopii komórki, organizmu Indukowana mutageneza- proces kontrolowany mający na celu wprowadzenie zmian (jakościowych) w genomie Konstrukt genowy- różne cząsteczki (fragmenty) DNA będące wynikiem połączenia (ligacji) i służące do doświadczeń 1

2 1928 Fryderyk Griffith, odkrywa istnienie czynnika transformacyjnego Streptococcus pneumoniae (dwoinka) wywołujące ostre zapalenie płuc- grypa Hiszpanka Typ IIIS (posiadające kapsułę polisacharydową) oraz IIR (nieposiadające)- oba typy rozpoznawalne w warunkach in vitro 1944 Oswald Avery, Colin MacLeod i Maclyn McCarty potwierdzają istnienie czynnika transformacyjnego, wyjaśniają co jest podstawą udanej transformacji (nie białka lecz DNA) Przed procesem transformacji do unieszkodliwionych termicznie bakterii wywołujących stan chorobowy dodawano kolejno: - proteazę, lipazę, RNazę, DNazę W trzech pierwszych przypadkach transformacja przebiegała pomyślnie, w ostatnim nie! 1952 Alfred Herschey i Marta Chase transformują bakterie wirusem Bakteriofag T2 posiada tylko białkowy kapsyd i DNA znakowanie izotopowe potwierdza, że przemieszczeniu ulega tylko DNA 2

3 1972 Gobin Khorana Paul Berg syntetyzują in vitro trzynukleotydowe cząsteczki DNA, z wykorzystaniem fosfodiestrów 1973 Herbert Boyer i Stanley Cohen opracowują technikę rekombinacji DNA różnych organizmów (Procaryota i Eukaryota) Konstruują funkcjonalne plazmidy Wprowadzają do genomu bakteryjnego plazmidy z fragmentami genów wirusa lub płaza Pokazują nieograniczone możliwości transformacji! I co było dalej.? Bezpieczna produkcja insuliny, hormonu wzrostu, IX czynnik krzepnięcia krwi na bazie transgenicznych bakterii Produkcja szczepionki na wirusowe zapalenie wątroby typu B Produkcja transgenicznych roślin- złoty ryż Klonowanie- owca Dolly i 264 inne gatunki! Indukowana mutageneza- pozwala sprawdzać funkcje genów Konstrukty genowe- terapia genowa 3

4 DNA mrna białko Informacje o ekspresji genów Informacje o odpowiedzi komórkowej na zadany czynnik Informacje o produkcji białka (nie zawsze) Dokładna liczba kopii genu Wykrywanie kopii wirusów i patogenów Wykrywanie metylacji DNA Wykrywanie mutacji Rodzaje reakcji ABSOLUTE QUANTIFICATION Krzywa standardowa Standardem musi być dobrze mianowany roztwór patogenu Reakcja najczęściej stosowana do obliczania ilości kopii wirusów W przypadku posiadania krzywych uniwersalnych również bakterii RELATIVE QUANTIFICATION Krzywa standardowa Standardem jest wielokrotnie rozcieńczana matryca Reakcja najczęściej stosowana do badania ekspresji genów Fazy reakcji PCR Wykładnicza Jeżeli wydajność reakcji wynosi 100% to każda z dwóch nici matrycy jest podstawą do replikacji; najwyższa precyzja i specyficzność powielania Liniowa Zmienna. Matryca zaczyna ulegać rozpadowi i wydajność reakcji zaczyna się pogarszać Plateau Reakcja zatrzymuje się, a przeprowadzana dalej będzie degradować wytworzone produkty 4

5 Fazy reakcji PCR PCR phases in linear view Plateau Liniowa [DNA] Wykładnicza Cykl # Fazy reakcji PCR liniowo logarytmicznie Geny kontroli endogennej Prezentowane są we wszystkich badanych tkankach Mają zawsze stały poziom ekspresji Kalibratory Geny, z których ekspresją będzie bezpośrednio porównywany badany gen Kontrola endogenna może być również kalibratorem! 5

6 6