(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP00/05666 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA () OPIS PATENTOWY (9) PL () 005 () Numer zgłoszenia: (3) B Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej () Data zgłoszenia: (6) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP00/05666 (7) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:.0.00, WO0/035 PCT Gazette nr 0/0 (5) Int.Cl. C07K /6 (006.0) CP /0 (006.0) (5) Sposób przechowywania białka w rozpuszczalniku wodnym (30) Pierwszeństwo: ,DE, (73) Uprawniony z patentu: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH, Frankfurt,DE (3) Zgłoszenie ogłoszono: BUP /03 (7) Twórca(y) wynalazku: Franz-Josef Rubroeder,Vilmar,DE Reinhold Keller,Bad Soden,DE (5) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP /0 (7) Pełnomocnik: Barbara Gugała, PATPOL Sp. z o.o. (57) Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób przechowywania białka w rozpuszczalniku wodnym, w którym zmniejszanie w czasie skutecznego stężenia białka jest opóźniane, charakteryzujący się tym, że do wodnego rozpuszczalnika wprowadza się cysteinę, przy czym stężenie cysteiny w wodnym roztworze białka jest w zakresie od 50 do 0 mm, a jako białko stosuje się insulinę, pochodną insuliny i/lub jej prekursor. Wprowadzenie cysteiny opóźnia zmniejszanie w czasie skutecznego stężenia białka. Sposób nadaje się do zastosowania przy wytwarzaniu białek w mikroorganizmach. PL 005 B

2 PL 00 5 B Opis wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób przechowywania białka w rozpuszczalniku wodnym. Stan chemiczny grup SH białek lub innych struktur wrażliwych na utlenianie wpływa często na identyczność, aktywność lub skuteczne stężenie białek. Identyczność oznacza określone fałdowanie białka. Aktywność oznacza aktywność enzymatyczną. Skuteczne stężenie białka oznacza taką zawartość białka w roztworze, która została prawidłowo fałdowana pod względem jego funkcji biologicznej in-vivo. Z literatury wiadomo, że utlenianie zmieniające strukturę białek można stłumić przez zastosowanie odczynników tiolowych, na przykład -merkaptoetanolu lub cysteiny. Można na przykład stabilizować tiolami oksydazę D-aminokwasową (DAO). Flawoproteina DAO katalizuje stereospecyficzne dezaminowanie D-aminokwasów do odpowiednich α-ketonokwasów i amoniaku (P. Golini i inni, Enzyme and Microbial Technology, 7, 995, 3-39). Wprowadzenie tioli, na przykład cysteiny, może także spowodować zmniejszenie aktywności białek. Ten efekt można wyjaśnić także obecnością reszt cysteiny. Przykładem jest aminoacylaza. Aminoacylaza jest dimerycznym enzymem zawierającym atom Zn + na każdą podjednostkę. Każda podjednostka enzymu zawiera dwie cysteinowe grupy SH i dwa wiązania disiarczkowe. Chemiczne modyfikowanie grup SH, na przykład przez rozrywanie wiązań disiarczkowych, może spowodować dezaktywację enzymu. Stwierdzono, że wprowadzenie -merkaptoetanolu zmniejsza aktywność aminoacylazy, natomiast usunięcie -merkaptoetanolu w wyniku dializy lub filtracji żelowej może prawie całkowicie przywrócić początkową aktywność enzymatyczną. (W. Kordel i F. Schneider, Biochem. Biophys. Acta 5, 976, 6-57). W przypadku cysteiny i kilku jej pochodnych w pewnym zakresie dla określonych preparatów i ich specjalnych zastosowań stwierdzono aktywność przeciwbakteryjną, przeciwwirusową lub przeciwgrzybiczą. Stwierdzono na przykład, że wprowadzenie cysteiny chroni w pewnej mierze artykuły żywnościowe przed psuciem się (opis patentowy US nr A). Metodami transformacji genowej można wytwarzać rekombinantowe białka, na przykład insulinę lub jej prekursory, a także pochodne insuliny, które mają składy aminokwasów różniące się od wprowadzonej sekwencji genowej (na przykład ludzkiej sekwencji genowej) w mikroorganizmach modyfikowanych metodami transformacji genowej, na przykład w bakteriach Escherichia coli. Syntezę rekombinacyjną mikroorganizmów przeprowadza się za pomocą wektorów ekspresji. Wektory ekspresji składają się z plazmidu wektorowego, który powinien zawierać sekwencję kontrolną dla replikacji plazmidu, a także gen selekcyjny (gen odporności na antybiotyki, znacznik wymiany materii i inne), w którym zastosowano kodujący obszar genu interesującego białka (na przykład insuliny) pod kontrolą promotora aktywnego w wybranych mikroorganizmach (na przykład promotora lac dla B. coli). Sposób wytwarzania białek rekombinantowych (na przykład insuliny, pochodnych insuliny i innych) przez współdziałanie transgenicznie modyfikowanych mikroorganizmów składa się z serii etapów tego sposobu, które zachodzą na siebie i muszą być odpowiednio dostosowane do siebie. Na przykład sposób - wytwarzania insuliny ludzkiej może obejmować następujące etapy: fermentację mikroorganizmów - rozdzielenie komórek - roztwarzanie komórek - izolację i przekładanie warstwy białka fuzyjnego z wstecznym fałdowaniem cysteiny do rodzimej struktury przestrzennej z jednoczesnym wytwarzaniem się mostków disiarczkowych i z następnym oddzieleniem obcych białek niezawierających surowców wtórnych - rozszczepienie enzymatyczne do insuliny argininowej - podstawowe oczyszczanie wodnego roztworu białka - pierwsze oczyszczanie chromatograficzne rozszczepienie enzymatyczne do ludzkiej insuliny - drugie oczyszczanie chromatograficzne - dokładne oczyszczanie metodą HPLC - przekrystalizowanie - suszenie. Duża liczba przeprowadzanych pojedynczych operacji zwykle powoduje znaczne pogorszenia wydajności ogólnej, ponieważ na żadnym etapie nie można uniknąć strat związanych z wydajnością danego wybranego etapu sposobu. Wydajność ogólną można poprawić przez optymalizację etapów pośrednich. Takie sposoby budzą szczególne zainteresowanie, ponieważ pozwalają bardziej ekonomicznie wykorzystać stosowane zasoby oraz zmniejszyć obciążenia środowiska. Opis patentowy EP nr ujawnia na przykład ulepszony sposób wytwarzania prekursora insuliny lub pochodnych insuliny z właściwie związanymi mostkami cystyny w obecności cysteiny lub chlorowodorku cysteiny oraz chaotropowego środka pomocniczego.

3 PL 00 5 B 3 Pochodnymi insuliny są pochodne występujących w naturze insulin lub pochodnych insuliny, a mianowicie insuliny ludzkiej i insulin zwierzęcych. Te pochodne insuliny poza tym różnią się od identycznej insuliny występującej w naturze brakiem i/lub zamianą co najmniej jednej reszty aminokwasowej znajdującej się w występującej w naturze insulinie na inną genetycznie kodowaną resztę aminokwasową i/lub różnią się addycją co najmniej jednej genetycznie kodowanej reszty aminokwasowej. Podczas przechowywania białek zwykle ma miejsce zmniejszenie ich skutecznych stężeń. Przechowywanie wytworzonych produktów między poszczególnymi etapami sposobu może być konieczne z różnych powodów. Tak na przykład może się zdarzyć, że zdolność przerobowa włączonych później technicznych etapów przerobu nie wystarcza do objęcia nimi całej ilości produktu z poprzedniego etapu sposobu. Zapotrzebowanie w czasie na przechowywanie pośrednie może mieć różny czas trwania. Wynika ono ze zdolności produkcyjnej, ze stopnia dopasowania poszczególnych zespołów technicznych, z potrzeby dodatkowego dostarczania środków chemicznych lub urządzeń albo z innych powodów i wymagane przechowywanie pośrednie może przedłużyć się do kilku. Skuteczny sposób zwiększania wydajności uzyskuje się wtedy, gdy w przypadku nieuniknionego pośredniego przechowywania produktów z poszczególnych etapów sposobu przed ich dalszym przerobem udaje się utrzymać w możliwie wąskich granicach występujące straty skutecznego białka. Dotychczas nie ujawniono zastosowania cysteiny lub jej pochodnych do ograniczania strat skutecznych wydajności białek podczas pośredniego przechowywania wyników produkcyjnych o różnym składzie i do dostosowania stanu z poszczególnych etapów przemysłowych sposobów wytwarzania z włączeniem składników biologicznych, na przykład z udziałem katalizatorów enzymatycznych lub zmienionych genetycznie mikroorganizmów. Sposoby takie stosuje się na przykład do wytwarzania insuliny. Przechowywane pośrednie wytworzone produkty w zależności od etapu sposobu mogą składać się z różnej liczby wielu kompleksowo złożonych makrocząsteczek o charakterze biologicznym (białek, DNA, tłuszczów), mikroorganizmów, substancji buforowych, produktów wyjściowych i innych. Celem sposobu wytwarzania jest z reguły wytwarzanie możliwie jednorodnej substancji, a w przypadku produkcji insuliny - wytwarzanie insuliny. Jeśli wytworzone produkty muszą być przechowywane, to w przypadku wytwarzania białka, na przykład insuliny, zwykle ma miejsce zmniejszenie skutecznego stężenia tego białka. Termin przechowywanie białka dotyczy wszelkiego przechowywania białka niezależnie od objętości, w jakiej występuje białko, od czasu trwania samego przechowywania lub od warunków temperaturowych, w jakich się odbywa. Przechowywanie białek zwykle odbywa się w roztworach wodnych. Wodny roztwór białka obok składników pożywek do hodowania mikroorganizmów w określonej postaci lub jako pełnych pożywek zawierających w szczególności źródła węgla lub źródła azotu, może zawierać aminokwasy i sole nieorganiczne i pierwiastki śladowe, oraz składniki różnego rodzaju buforów chemicznych, a także makrocząsteczki pochodzenia biologicznego, jak DNA lub tłuszcze, a ponadto związki organiczne lub nieorganiczne, na przykład dodecylosiarczan sodu lub octan potasu, a także składniki rozpuszczalnika różnego ważności, jak metanol lub eter naftowy. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób przechowywania białka w rozpuszczalniku wodnym, w którym zmniejszanie w czasie skutecznego stężenia białka jest opóźniane, charakteryzujący się tym, że do wodnego rozpuszczalnika wprowadza się cysteinę, przy czym stężenie cysteiny w wodnym roztworze białka jest w zakresie od 50 do 0 mm a jako białko stosuje się insulinę, pochodną insuliny i/lub jej prekursor. Sposób nadaje się do stabilizowania spowalniania zmniejszania się w czasie skutecznego stężenia białka podczas przechowywania go w roztworach wodnych. Sposób można zastosować na przykład do wytwarzania białek przez mikroorganizmy. Jako mikroorganizmy można między innymi zastosować przede wszystkim bakterie, a zwłaszcza Escherichia coli, drożdże, przede wszystkim Saccharomyces cerevisiae lub Pichia pastoris, a także komórki owadów. Te mikroorganizmy można w korzystnej odmianie wykonania wynalazku transformować za pomocą konstruktów wektorów ekspresji do indukowanej lub do konstytutywnej ekspresji omawianego białka. Mikroorganizmy hoduje się wstępnie i roztwarza po syntezie białka. Roztwarzanie można wykonać zasadniczo wszystkimi sposobami odpowiednimi do uwalniania białka z bakterii. Jako sposób roztwarzania można zastosować na przykład ultradźwięki, sposoby chemiczne z użyciem octanu potasu, dodecylosiarczanu sodu lub lizozymu, ogrzewanie mikroorganizmów lub prasę francuską. Roztwarzanie mikroorganizmu można pominąć, jeśli otrzymywane białko jest wydzielane bezpośrednio do pożywki. Sposób można w zasadzie stosować także w przypadku białek wydzielanych.

4 PL 00 5 B Kompleksowe mieszaniny białek, które tworzą się podczas roztwarzania mikroorganizmów lub podczas wydzielania białka bezpośrednio do pożywki, znajdują się zwykle w roztworze wodnym. Białka mogą być rozpuszczone lub mieć postać suspensji. Te roztwory białek przechowuje się zwykle w zakresie temperatury od 0 C do 50 C, lub od 5 C do 30 C lub w temperaturze 5 C. W celu opóźnienia dezaktywacji wprowadza się cysteinę do tej mieszaniny białek. Stężenie cysteiny w mieszaninie białek może wynosić od 50 mm do 0 mm. Korzystnie wprowadza się 70 mm. Białka w kompleksowych roztworach cząsteczek można w ten sposób przechowywać w ciągu kilku z jedynie nieznacznym zmniejszeniem skutecznego stężenia białka. Sposób można zastosować do syntezy białek heterologicznych, zwłaszcza w mikroorganizmach, po ich roztwarzaniu, z następnym oczyszczaniem i z ewentualną renaturacją, korzystnie do wytwarzania insuliny i jej prekursorów. Jako białka przechowywane sposobem według wynalazku stosuje się insulinę lub pochodne insuliny. Sposób wytwarzania tego białka heterologicznego obejmuje ekspresję białka heterologicznego lub jego prekursora w transformowanym mikroorganizmie, w którym przechowuje się potem białko heterologiczne sposobem według niniejszego wynalazku. To białko heterologiczne lub jego prekursor następnie ewentualnie renaturuje się, oczyszcza do sekwencji lidera lub przerabia w szczególny sposób i w końcu po oczyszczaniu i izolowaniu otrzymuje się pożądany produkt. P r z y k ł a d y Podczas przeprowadzania sposobu wytwarzania insuliny stwierdzono, że dzięki wprowadzeniu cysteiny do białka fuzyjnego otrzymuje się produkt trwały podczas przechowywania w ciągu miesięcy. Natomiast produkt niepoddany takiej obróbce już po kilku dniach nieodwracalnie traci część aktywności. W podanych przykładach zastosowano cząsteczki prekursora ludzkiej insuliny, a także pochodnej insuliny. Strukturę i sekwencję aminokwasów ujawniono w protokołach sekwencji zamieszczonych w opisie patentowym EP Prekursor ludzkiej insuliny ma sekwencję ludzkiej insuliny występującej w naturze. Prekursor pochodnej insuliny zawiera w położeniu łańcucha A glicynę zamiast argininy i na terminalnym węglu końca łańcucha B w położeniach 3 i 3 zawiera dwie cząsteczki argininy. Białka fuzyjne insulin można wytwarzać w wyniku fermentacji modyfikowanych genetycznie komórek Escherichia coli według opisów patentowych EP i EP Otrzymuje się przy tym suspensję białka, która zawiera od około 0% wagowych do około 5% wagowych stałej substancji i od około 0% wagowych do około 50% wagowych fałdowanej insuliny. Dla zamierzonego stabilizowania białka za pomocą cysteiny wprowadzono do około 500 kg tej suspensji białka (odpowiadającej szarży fermentacyjnej) w ciągu 0 minut z jednoczesnym silnym mieszaniem 75 kg monohydratu chlorowodorku cysteiny. ph obniżyło się przy tym od wartości 7,0 do wartości,5. Suspensja miała przy wartości ph około 5 i postać gęstej pasty, ale przy wartości ph poniżej można ją było znowu z łatwością mieszać. W takich warunkach próby w suspensji białka ustaliło się stężenie 70 mm chlorowodorku cysteiny. Suspensję białka mieszano jeszcze w ciągu 60 minut i następnie pozostawiano bez dodatkowego mieszania aż do przerobu. P r z y k ł a d W celu doświadczalnego potwierdzenia konserwującego działania cysteiny wykonano następujące próby laboratoryjne: Białko fuzyjne ludzkiej insuliny i białko fuzyjne pochodnej insuliny wytwarzane według opisu patentowego EP przechowywano, z cysteiną i bez cysteiny, w temperaturze 5 C i w temperaturze pokojowej, w ciągu do miesięcy. Z szarż pobierano próbki podczas próby. Białko fuzyjne zamieniono metodą redukcyjnego fałdowania w prepro-postać ludzkiej insuliny lub w prepro-postać pochodnej insuliny (patrz opis EP 906 9). Do szarż przechowywanych bez monohydratu chlorowodorku cysteiny wprowadzono ilość cysteiny potrzebną do fałdowania w czasie około h przed początkiem fałdowania. W przypadku innych szarż, które zawierały cysteinę w postaci środka konserwującego, nie było to konieczne. Przebieg reakcji do prepro-postaci ludzkiej insuliny lub do prepro-postaci pochodnej insuliny oznaczano metodą HPLC. Analiza HPLC. 0,5 g białka rozpuszczano w 0 ml roztworu zawierającego 6 M chlorowodorku guanidyny, 50 mm Tris, ph,5 mm etylenodiaminotetraoctanu (EDTA), % -merkaptoetanolu, 0 mm ditiotreitolu w temperaturze 95 C w ciągu minut i następnie wirowano przy 000 G w ciągu 0 minut. Z kla-

5 PL 00 5 B 5 rownej górnej cieczy pobrano próbkę 0,0 ml i wprowadzono ją na kolumnę chromatografii wysokociśnieniowej. Kolumna: Nucleogel RN 300-5/6 (Macherey & Nagel, Akwizgran, Niemcy). Gradient: bufor A: 0,% kwas trifluorooctowy (TFA) bufor B: 0,09% TFA w acetonitrylu. Temperatura: 55 C. Całkowity czas przepływu: 0 minut. Gradient wykazywał następującą ilość buforu B po odpowiednich czasach przepływu: 0 minut - - 5%, minut - 60%, 3 minut - 90%, 5 minut - 00%. Przepływ ml/minuta. Detekcja: 5 nm. Wyniki prób. T a b e l a Przechowywanie fuzyjnego białka ludzkiej insuliny w temperaturze 5 C, ilość substancji, mg/l, po fałdowaniu (substancją jest fałdowana ludzka insulina).. dzień z cysteiną bez cysteiny T a b e l a Przechowywanie fuzyjnego białka ludzkiej insuliny w temperaturze pokojowej, ilość substancji, mg/l, po fałdowaniu. dzień z cysteiną bez cysteiny 65 3 %* %* *ocena niemożliwa z powodu wyraźnego gnicia T a b e l a 3 Przechowywanie fuzyjnego białka pochodnej insuliny w temperaturze 5 C, ilość substancji, mg/l, po fałdowaniu (substancją jest fałdowana pochodna insuliny).. dzień z cysteiną bez cysteiny T a b e l a Przechowywanie fuzyjnego białka pochodnej insuliny w temperaturze pokojowej, ilość substancji, mg/l, po fałdowaniu.. dzień z cysteiną bez cysteiny %* *ocena niemożliwa z powodu wyraźnego gnicia Wprowadzenie cysteiny lub chlorowodorku cysteiny umożliwia uzyskanie czasów przechowywania do miesięcy bez znacznej straty aktywności. Zastrzeżenia patentowe. Sposób przechowywania białka w rozpuszczalniku wodnym, w którym zmniejszanie w czasie skutecznego stężenia białka jest opóźniane, znamienny tym, że do wodnego rozpuszczalnika wpro-

6 6 PL 00 5 B wadza się cysteinę, przy czym stężenie cysteiny w wodnym roztworze białka jest w zakresie od 50 do 0 mm a jako białko stosuje się insulinę, pochodną insuliny i/lub jej prekursor.. Sposób według zastrz., znamienny tym, że przechowuje się białko, które jest białkiem heterologicznym wytwarzanym w mikroorganizmie. 3. Sposób według zastrz., znamienny tym, że przechowuje się białko wytwarzane w mikroorganizmie stanowiącym bakterię.. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że przechowuje się białko wytwarzane w mikroorganizmie stanowiącym bakterię Escherichia coli. 5. Sposób według zastrz., znamienny tym, że przechowuje się białko wytwarzane w mikroorganizmie stanowiącym drożdże. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że przechowuje się białko wytwarzane w mikroorganizmie stanowiącym drożdże Saccharomyces cerevisiae. 7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że przechowuje się białko wytwarzane w mikroorganizmie stanowiącym drożdże Pichia pastoris.. Sposób według zastrz., znamienny tym, że przechowuje się białko wytwarzane w mikroorganizmie stanowiącym komórki owadów. 9. Sposób według zastrz. albo 3 albo albo 5 albo 6 albo 7 albo, że przechowuje się białko wytwarzane przez mikroorganizm za pomocą konstruktu wektora ekspresji. 0. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że białko występuje w postaci rozpuszczonej.. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że białko występuje w postaci suspensji.. Sposób według zastrz., znamienny tym, że stężenie cysteiny w wodnym roztworze białka wynosi 70 mm. 3. Sposób według zastrz,, znamienny tym, że białko przechowuje się w temperaturze od 0 C do 50 C.. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że białko przechowuje się w temperaturze od 5 C do 30 C. 5. Sposób według zastrz., znamienny tym, że białko przechowuje się w temperaturze 5 C. Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena,00 zł.