Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna.

Transkrypt

1 Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna. wersja x 20 transformacji Nr kat Zestaw zawiera komplet odczynników do przeprowadzenia sześciu preparatyk komórek kompetentnych. Każda z preparatyk wystarcza na przeprowadzenie dwudziestu transformacji. 1

2 Skład zestawu Składnik Ilość Temp. Przechowywania Roztwór S1 70 ml +4 do +8 ºC Roztwór S2 7 ml +4 do +8 ºC Roztwór S3 70 ml +4 do +8 ºC DTT 154 mg +4 do +8 ºC Roztwory S1, S2, S3 ph roztworów S1, S2, S3 musi być równe 8,3 +/-0,1. Wyższe lub niższe ph wpływa na obniżenie efektywności tranformacji. Jeżeli jest zbyt niskie, należy dodać NaOH, jeśli zbyt wysokie HCl. Roztwory należy przechowywać w +4 ºC w celu zmniejszenia wahań ph. DTT W celu otrzymania 1 M roztworu DTT należy do probówki zawierającej 154 mg DTT dodać po 1 ml jałowej wody. Roztwór DTT przechowywać w temp. -20 ºC. Zestaw był testowany na szczepach Saccharomyces cerevisiae: BMA64, EthanolRed, INVSc-1. Firma A&A Biotechnology udziela rocznej gwarancji na niniejszy zestaw. Firma nie gwarantuje poprawnego działania zestawu do transformacji w przypadku: odstępstwa od dostarczonego wraz z zestawem protokołu braku użycia innego niż zalecanego w niniejszym protokole wyposażenia i materiałów użycia innych odczynników niż zalecane lub które nie wchodzą w skład zestawu użycia przeterminowanych odczynników 2

3 Przygotowanie komórek kompetentnych Wyposażenie i materiały niezbędne do przygotowania komórek kompetentnych nie wchodzące w skład zestawu wytrząsarka 30 ºC jałowa pożywka YPD Broth (YPD) (nr kat , , ) jałowa pożywka YPD Agar (YPDA) (nr kat , ) jałowe probówki o poj. 50 ml typu Falcon wirówka z rotorem do wirowania probówek o poj. 50 ml typu Falcon sterylne probówki o poj. 1,5 ml typu Eppendorf szczep drożdży Saccharomyces cerevisiae Przed przystąpieniem do protokołu Drożdże Saccharomyces cerevisiae należy przesiać redukcyjnie na płytkę z podłożem YPDA. Płytkę inkubować przez 2 dni w temp ºC. Roztwory S1 i S2 powinny mieć temp. pokojową. Protokół przygotowania komórek kompetentnych 1. W 10 ml pożywki YPD zaszczepić pojedynczą kolonię Saccharomyces cerevisiae uzyskaną z posiewu redukcyjnego. Inkubować hodowlę w wytrząsarce przez noc w temp. 30 ºC. 2. Do 10 ml świeżej pożywki YPD dodać taką ilość hodowli nocnej, aby uzyskać OD600=0,2-0,4. 3. Inkubować w wytrząsarce przez 3-6 godz. w temp. 30 ºC, do uzyskania OD600=0,6-1,0. Jeśli po 6 godz. inkubacji hodowla nie osiągnie OD600=0,6, należy jeszcze raz przesiać redukcyjnie szczep Saccharomyces cerevisiae i rozpocząć procedurę od początku. 4. Po osiągnięciu odpowiedniego OD600 odwirować komórki przez 5 min przy 500 x g w temp. pokojowej. 5. Zlać supernatant. 6. Osad delikatnie zawiesić w 10 ml roztworu S1. Dodać 100 μl 1M roztworu DTT i dokładnie wymieszać przez pipetowanie. ph roztworu S1 musi być równe 8,3 +/- 0,1. 3

4 7. Wirować komórki przez 5 min przy 500 x g w temp. pokojowej. 8. Zlać supernatant. 9. Osad delikatnie zawiesić w 1 ml roztworu S2. ph roztworu S2 musi być równe 8,3 +/-0, Rozporcjować zawiesinę komórek kompetentnych po 50 μl do jałowych probówek o poj. 1,5 ml typu Eppendorf. Na jedną transformację należy używać 50 μl komórek kompetentnych. Komórki mogą być wielokrotnie zamrażane/rozmrażane bez strat w efektywności transformacji. 11. Tak przygotowane komórki kompetentne można użyć bezpośrednio do transformacji (patrz strona 5) lub zamrozić w -80 ºC, w celu późniejszego użycia. Bardzo ważne jest, aby komórki kompetentne zamrażać powoli. Nie wolno zamrażać komórek w ciekłym azocie. Zaleca się przechowywanie komórek kompetentnych w pudełku styropianowym, w temp. -80 ºC. 4

5 Transformacja komórek kompetentnych Wyposażenie i materiały niezbędne do transformacji komórek kompetentnych nie wchodzące w skład zestawu termoblok 30 ºC jałowa pożywka YPD Broth (YPD) (nr kat , , ) płytki z podłożem selekcyjnym - 1 płytka na 1 transformację jałowe probówki o poj. 50 ml typu Falcon wirówka z rotorem do wirowania probówek o poj. 50 ml typu Falcon Przed przystąpieniem do protokołu Przygotować odpowiednią liczbę płytek z podłożem selekcyjnym. Przed przystąpieniem do transformacji - podłoża oraz roztwór S3 powinny mieć temp. pokojową. Zaleca się przygotowanie dodatkowej płytki z podłożem selekcyjnym dla kontroli negatywnej transformacji. Protokół 1. Do każdej transformacji użyć 50 μl komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae, rozmrożonych lub świeżo przygotowanych, o temp. pokojowej. 2. Do komórek kompetentnych dodać po 1 μg linowego DNA i delikatnie wymieszać. Zwiększenie ilości DNA do 5 μg może podnieść efektywność transformacji. Objętość DNA nie powinna być większa niż 5 μl. 3. Do mieszaniny DNA i komórek kompetentnych dodać po 500 μl roztworu S3 i wymieszać przez worteksowanie. ph roztworu S3 musi być równe 8,3 +/- 0,1. 4. Całość inkubować przez 1 godz. w temp. 30 ºC. Worteksować co 15 min. Worteksowanie co 15 min wpływa na poprawę wydajności transformacji. Jeśli transformowany jest plazmid bez oporności na zeocynę, przejść do pkt Jeśli transformowany jest plazmid z opornością na zeocynę: - mieszaninę należy przenieść do 1 ml pożywki YPD bez antybiotyku będącej w probówce typu Falcon o pojemności 50 ml. - inkubować hodowlę przez 1 godz. z wytrząsaniem 220 RPM w temp. 30 ºC w celu ekspresji genów odpowiedzialnych za oporność na antybiotyk. 5

6 6. Zwirować komórki przez 5 min przy 3000 x g w temp. pokojowej. 7. Zlać supernatant. 8. Osad zawiesić w μl pożywki YPD, buforu TE lub roztworu S μl mieszaniny transformacyjnej wysiać na płytkę z podłożem selekcyjnym. Do wektrów przenoszących oporność na zeocynę zaleca się stosowanie podłoża YPDA z zeocyną (100 μg/ml). 10. Płytki inkubować od 2 do 4 dni w temp. 30 ºC. Użycie zestawu pozwala na uzyskanie około 100 kolonii na 1 transformację. 6

7 Pożywki YPD Broth (YPD) (nr kat , , ) Przygotowanie 1000 ml pożywki: 1. Do odpowiedniego naczynia odważyć 50 g podłoża. 2. Uzupełnić do 1000 ml jałową wodą i wymieszać. 3. Zawiesinę autoklawować przez min w temp. 121 ºC. 4. Po schłodzeniu do temp ºC ponownie wymieszać przed użyciem. Po rozpuszczeniu i autoklawowaniu, końcowe ph=7,0 w temp. 25 ºC. YPD Agar (YPDA) / YPD Agar (YPDA) z zeocyną (nr kat , ) 100 μg/ml zeocyna Przygotowanie 1000 ml pożywki: 1. Do odpowiedniego naczynia odważyć 70 g podłoża. 2. Uzupełnić do 1000 ml jałową wodą i wymieszać. 3. Zawiesinę autoklawować przez min w temp. 121 ºC. 4. Po schłodzeniu pożywki do temp ºC dodać po 100 ml jałowego roztworu 20% glukozy, a do podłoża z zeocyną, dodatkowo 1 ml zeocyny (100 mg/ml) i ponownie wymieszać przed użyciem. Po rozpuszczeniu i autoklawowaniu, końcowe ph=7,0 w temp. 25 ºC. 7

8 Produkty powiązane Składniki i gotowe podłoża Ilość Nr kat. LB Agar Miller (LA) LB Miller (LB) 250 g g g g g Agar 500 g g g YPD 500 g g g YPDA 500 g g Zeocyna 1 g Informacje bezpieczeństwa UWAGA S1, S2, S3 roztwór H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. UWAGA DTT (dithiothreitol) H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P261 Unikać wdychania pyłu. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. 8