PL B1. Nowy szczep bakterii Bacillus subtilis i sposób otrzymywania α-amylazy przy użyciu nowego szczepu

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 1/20 ( ) C12N 9/28 ( ) C12P 19/14 ( ) C12R 1/125 ( ) (54) Nowy szczep bakterii Bacillus subtilis i sposób otrzymywania α-amylazy przy użyciu nowego szczepu (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 21/06 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 05/12 (72) Twórca(y) wynalazku: KENNETH OGBONNA UDEH, Lublin, PL ADAM WAŚKO, Lublin, PL MONIKA KORDOWSKA-WIATER, Lublin, PL ANNA KOŁACZ, Zakrzów, PL PL B1

2 2 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Bacillus sp. oraz sposób otrzymywania α-amylazy przy użyciu nowego szczepu na drodze fermentacji wgłębnej. Skrobia składa się z amylozy (15-30%) i amylopektyny (70-85%). Obecnie, otrzymanie syropu dekstrynowego lub glukozo-fruktozowego ze skrobi rozpuszczalnej odbywa się przy użyciu enzymów amylolitycznych. Enzymy te katalizują przemianę wymienionej skrobi w następujący sposób: 1. upłynnianie skrobi dzięki α-amylazom do dekstryn, 2. scukrzanie dekstryn do glukozy dzięki wprowadzeniu amyloglukozydazy lub/i glukoamylazy, 3. izomeryzację syropu glukozowego do izosyropu dzięki izomerazie glukozowej. Wzrost zapotrzebowania na produkty hydrolizy skrobi spowodował intensyfikację poszukiwań nowych enzymów amylolitycznych, które mogą hydrolizować skrobię surową różnego pochodzenia z pominięciem klasycznego procesu kleikowania. Klasyczny proces kleikowania polega na ogrzaniu 30-35% wodnej zawiesiny skrobi surowej lub zmodyfikowanej powyżej 120 C przez 1,5-2 godzin. Jest on zabiegiem energochłonnym i kosztownym. Stanowi jeden z głównych problemów hydrolizy skrobi wraz z ochłodzeniem hydrolizatów po procesie upłynniania i wpływa na zwiększenie ogólnych kosztów produkcji. Drugim problemem jest konieczność usunięcia jonów Ca 2+ wprowadzonych na etapie upłynniania dla zapewnienia stabilności α-amylazy, gdyż utrudniają one proces scukrzania. Proces scukrzania także wymaga dodatkowych czynności, które są związane z ochłodzeniem układu do 60 C po procesie upłynniania oraz zmianą ph do 4,5 w przypadku użycia glukoamylaz bakteryjnych lub nawet do 4,2 w przypadku użycia glukoamylaz grzybowych. Czynności te także podnoszą koszty operacji, a tym samym wartość rynkową finalnego produktu. Obecnie wykorzystuje się około 20% surowej skrobi kukurydzianej na świecie, głównie w USA, natomiast powszechnie stosuje się skrobię różnego pochodzenia zmodyfikowaną chemicznie, co podnosi dodatkowo koszty produkcji [Appl. Environ. Microbiol., 54, 18, , 1988; Appl. Environ. Microbiol., 55, 6, , 1989; World J. Microbiol. Biotechnol., 12, , 1996]. Większość znanych wynalazków dotyczy podnoszenia termostabilności α-amylaz (do 95 C) przy jednoczesnym obniżeniu optymalnego ph ich działania w kierunku kwasowości (do 5,5) metodami klonowania DNA, mutacji ukierunkowanej punktowo w odcinku DNA oraz hybrydyzacji genów dwóch szczepów [EP ; EP ]. Osiągnięcia te nie przyniosły dotąd oczekiwanych efektów w możliwości użycia tych α-amylaz do przeprowadzenia hydrolizy skrobi surowej różnego pochodzenia z pominięciem klasycznego procesu kleikowania. Europejski opis patentowy nr EP ujawnił metodę zwiększenia syntezy α-amylazy poprzez klonowanie i ekspresję jednego lub więcej genów amylaz u szczepów Bacillus sp. Z kolei w opisie EP opisano sposób wytwarzania chimerycznych α-amylaz oznakowanych symbolem Q-R-L, gdzie Q oznacza N-końcowe polipeptydy zawierające od 55 do 60 reszt aminokwasów, które mają około 75% homologii do 37 reszt N-końcowych amylazy B. amyloliquefaciens; R reprezentuje dany polipeptyd, natomiast L jest C-końcowym polipeptydem zawierającym od 390 do 400 reszt aminokwasów i ma około 75% podobieństwa do 395 reszt C-końcowych aminokwasów B. licheniformis. Europejski opis patentowy nr EP ujawnił sposób otrzymania termostabilnych i kwasostabilnych α-amylaz metodą inżynierii genetycznej przy użyciu szczepów Bacillus licheniformis i B. amyloliquefaciens. Stosowano zarówno chemiczny, jak i enzymatyczny proces mutagenizacji na odcinku DNA tych szczepów. Otrzymane mutanty charakteryzowały się lepszymi właściwościami np. zwiększona termostabilność do 95 C w szerokich zakresach ph i mogą być wykorzystywane w procesie hydrolizy skrobi kukurydzianej metodą klasycznego kleikowania, jak i do procesu osnowania włókien. Mimo zastosowania najnowszych technik, nie uzyskano α-amylaz, które mają zdolność do hydrolizy skrobi surowej różnego pochodzenia z pominięciem klasycznego procesu kleikowania. Powodem jest brak działania większości α-amylaz na skrobię surową. Wynalezienie takiego enzymu doprowadziłoby do zmniejszenia kosztów i skrócenia procesów technologicznych do jednego etapu. Natomiast z polskiego opisu zgłoszeniowego wynalazku nr P znany jest szczep bakterii Bacillus subtilis KU-3 nr KKP/2009/p wyizolowany z Discorea esculantum (yam), który produkuję α-amylazę zdolną do hydrolizy surowej skrobi bez potrzeby poddawania jej kiełkowaniu, α-amylazę otrzymuje się na drodze fermentacji wgłębnej przy użyciu bakterii Bacillus subtilis KU-3 nr KKP/2009/p

3 3 na pożywce produkcyjnej zawierającej produkty pochodzenia roślinnego, korzystnie miazgę ziemniaczaną oraz produkty mineralne z jednoczesnym wstrząsaniem i napowietrzaniem, a po zakończeniu hodowli odwirowuje się powstały płyn. Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii Bacillus sp. oznaczony symbolem KU-5, który zdeponowano w Instytucie Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie pod nr KKP Szczep ten został wyizolowany w Katedrze Technologii Przemysłu Rolno-Spożywczego i Przechowalnictwa, Akademii Rolniczej w Lublinie z bulwy Colocassie esculantum (cocoyam) pochodzącej z Nigerii i scharakteryzowany według klucza Bergey'a [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology - Claus D., Berkeley W.C.R., 1986, 1872, 174, ] oraz testu API 50 CH (BioMëierux). Istota sposobu otrzymywania α-amylazy przy użyciu nowego szczepu Bacillus sp. na drodze fermentacji wgłębnej, na pożywce produkcyjnej zawierającej źródła węgla, azotu i związków mineralnych, a w tym skrobię, z jednoczesnym wstrząsaniem, a po zakończeniu hodowli odwirowaniem powstałego płynu pohodowlanego, przy czym hodowlę produkcyjną prowadzi się w przedziale temperatury od 30 C do 45 C i przy ph od 6,5 do 7,5 w czasie h, polega na tym, że jako mikroorganizm stosuje się szczep Bacillus sp. KU-5 nr KKP 2016, zaś skrobię stanowi surowa skrobia kukurydziana. Ilość skrobi surowej korzystnie wynosi od 0,5% do 4% (w/v). Jako α-amylazę rozumie się zarówno preparat enzymatyczny uzyskany bezpośrednio z hodowli produkcyjnej, zawierający α-amylazę według wynalazku wraz z mineralnymi i organicznymi zanieczyszczeniami jak i oczyszczoną lub częściową oczyszczoną α-amylazę. W wyniku hodowli szczepu Bacillus sp. KU-5 na pożywce produkcyjnej uzyskuje się α-amylazę rozkładającą surową skrobię różnego pochodzenia. Uzyskany preparat według wynalazku ma właściwości biochemiczne pozwalające na jego zastosowanie w procesie upłynniania skrobi surowej różnego pochodzenia z pominięciem klasycznego procesu kleikowania. Uzyskana α-amylaza ta ma optymalną wartość ph i temperaturę działania równe 5,5 i 65 C, co umożliwia jednoczesne połączenie procesów upłynniania i scukrzania w jednym etapie produkcyjnym z pominięciem klasycznego procesu kleikowania. Rozwiązanie to pozwala na duże oszczędności w kosztach produkcji w porównaniu ze znanymi i powszechnie stosowanymi dotychczas metodami, gdzie stosuje się głównie skrobię zmodyfikowaną wraz z procesem kleikowania. Warunkiem skrócenia tych procesów do jednego etapu produkcyjnego jest zastosowanie, oprócz zastosowania α-amylazy wg wynalazku, glukoamylaz lub/i amyloglukozydaz, które działają w tych samych warunkach co α-amylaza według wynalazku. Natomiast, α-amylaza według wynalazku spełnia takie wymaganie i może być z powodzeniem wykorzystywana do tych celów. P r z y k ł a d I. W pierwszym etapie przygotowano skosy agarowe o następującym składzie (w/v): 1% skrobi surowej ziemniaczanej, 3% agaru wzbogaconym bulionem (BTL - Polska). Agar wzbogaconym bulionem według producenta zawiera następujący skład: 15 g/l bulionu wzbogaconego, 15 g/l agaru. Następnie skorygowano ph do 7,0, po czym poddano ogrzewaniu do rozpuszczenia i przenoszono do probówek zamkniętych korkiem z ligniny. Poddano je sterylizacji. Tak przygotowane skosy zaszczepiono komórkami Bacillus sp KU-5 i umieszczono w termostacie przez 24 h w temperaturze 37 C. Uzyskane komórki zaszczepiono na wysterylizowaną i ostudzoną pożywkę posiewową o ph 7,0, umieszczoną w stożkowych kolbach. Do tego celu stosowano pożywkę posiewową o następującym składzie (w/v): 1% skrobi surowej kukurydzianej, 1,5% bulionu zwykłego (BTL - Polska). Bulion zwykły według producenta zawiera następujący skład: 2 g/l ekstraktu wołowego, 2 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l peptonu (Aminobak), 4 g/l NaCl. Hodowlę posiewową prowadzono na wstrząsarce przez 24 h w temperaturze 37 C w znany sposób. Do hodowli produkcyjnej użyto pożywkę o następującym składzie (w/v): 2% skrobi surowej kukurydzianej, 1,5% bulionu zwykłego (BTL-Polska), 0,02% CaCl 2, 0,01% MgSO 4 7H 2 O, 0,02% KH 2 PO 4, 0,04% Na 2 HPO 4 12H 2 O. Następnie skorygowano ph pożywki do 7,0, po czym poddano ją sterylizacji. Po sterylizacji i ostudzeniu pożywkę produkcyjną zaszczepiono komórkami z hodowli posiewowej w ilości 1% i prowadzono hodowlę przez 48 h na wstrząsarce w znany sposób w temperaturze 37 C. Po zakończeniu hodowli produkcyjnej uzyskany płyn pohodowlany wirowano przy 6000 g w czasie 15 min w temperaturze 4 C. W produktach hydrolizy stwierdzono obecność α-amylazy metodą DNS [Anal. Chem., 31, 426, 428, 1959] i HPLC w znany sposób.

4 4 Aktywność jednostkowa i specyficzna uzyskanego enzymu wynosiły odpowiednio od U/ml i , 95 U/mg białka. Jako jedną jednostkę rozumie się ilość enzymu wydzielającego 1 mm równoważnika cukrów redukujących w postaci glukozy w ciągu minuty w warunkach reakcji enzymatycznej. Otrzymana α-amylaza według wynalazku wykazuje aktywności w przedziale ph od 3 do 9 i w temperaturze od 30 C do 90 C, przy czym optymalne warunki działania enzymu przypadają dla ph 5,5 i dla temperatury 65 C. Enzym ten hydrolizuje zarówno surową skrobię różnego pochodzenia jak i zmodyfikowaną z pominięciem klasycznego procesu kleikowania lub/i z poddaniem surowca procesowi kleikowania. Wymienione parametry biochemiczne α-amylazy wg wynalazku pozwalają na użycie tego enzymu wraz z innymi enzymami amylolitycznymi o podobnych cechach do jednoczesnego przeprowadzania procesu upłynniania i scukrzania skrobi surowej. Charakterystyki działania uzyskanej α-amylazy w zależności od wartości ph i temperatury pokazują tabele 1 i 2. Natomiast, charakterystyki termostabilności uzyskanej α-amylazy określono w temperaturze 65 C przy ph 5,5 w czasie od 1 do 4 h w obecności 5 mm jonów Ca 2+ oraz stabilności tego enzymu wobec odczynu w zakresie wartości ph od 3 do 9 w temperaturze 4 C przez 24 h, przedstawiają tabele 3 i 4. Pozostałą aktywność enzymatyczną wobec skrobi surowej różnego pochodzenia po ich sterylizacji w porównaniu z skrobią rozpuszczalną przedstawia tabela 5. T a b e l a 1 Wpływ wartości ph na aktywność enzymatyczną. Wartość ph Pozostała aktywność [%] 3,0 20,20 4,0 69,10 5,0 95,14 5, ,0 97,00 7,0 81,20 8,0 65,06 9,0 25,26 10,0 8,60 T a b e l a 2 Wpływ wysokości temperatury na aktywność enzymatyczną Temperatura [ C] Pozostała aktywność [%] 30 67, , , , , , ,78

5 5 T a b e l a 3 Stabilność uzyskanego enzymu w temperaturze 65 C w 0,1 M buforze octanowym zawierającym 5 mm jonów Ca 2+ przy ph 5,5. Czas [godziny] Pozostała aktywność [%] , , , ,00 T a b e l a 4 Stabilność enzymu w zależności od wartości ph w temperaturze 4 C przez 24 h pozostałą aktywność badano w temperaturze 65 C w 0,1 M buforze octanowym zawierającym 5 mm jonów Ca 2+ przy ph 5,5. Wartości ph Pozostała aktywność [%] 0, ,0 13,50 4,0 42,70 5,0 94,00 5, , , , , ,0 100 T a b e l a 5 Aktywność enzymatyczna uzyskanego enzymu wobec skrobi różnego pochodzenia po ich sterylizacji przez 1h w temperaturze 121 C. (pozostałą aktywność określono w temperaturze 65 C w 0,1 M buforze octanowym zawierającym 5 mm jonów Ca 2+ przy ph 6.0). Źródło skrobi Pozostała aktywność [%] Skrobia rozpuszczalna 100 Surowa skrobia ziemniaczana (Sigma) 93,49 Surowa skrobia pszenna (Sigma) 97,02 Surowa skrobia kukurydziana (Sigma) 76,69 Surowa skrobia kukurydziana (własna) 92,32 Surowa skrobia ryżowa (własna) 87 Surowa skrobia pszenna (własna) 99,37 P r z y k ł a d II. Szczep bakterii uzyskany jak w przykładzie I poddano badaniu. Uzyskano następujące wyniki: 1/ Charakterystyka Bacillus sp. - tlenowy, gram +, laseczka, wytwarza przetrwalniki, katalaza +, VP +, MR -, ureaza -, indol, żelatyna +, gaz, pigment, KNO3 - bez gazu, wzrost 3-7% NaCl. 2/ Wyniki testu API-50CH podobieństwa do Bacillus subtilis. Wyniki pozytywne uzyskano po 24 godzinnej lub 48 godzinnej (48 h) inkubacji.

6 6 1.glycerol 4. arabinoza (48 h) 6. D-ksyloza 10. D-galaktoza 11. D-glukoza 12. D-fruktoza 13. D-mannoza 17. inozytol 19. D-sorbitol 21. metylo-α-glukopyranozyd 22. N-acetyloglukozamina 23. amygdalina 24. arbutyna 25. esculina (48 h) 26. salicyna 27. D-celobioza 28. D-maltoza 29. D-laktoza 31. D-sacharoza 33. inulina 35. D-rafinoza 36. skrobia 37. glykogen 39. gentabioza 40. D-turanoza 47. glukonian potasowy (48 h) - czerwone zabarwienie keto-glukonian potasowy (48 h) - czerwone zabarwienie Szczep KU-5 jest podobny w 80% do szczepu Bacillus subtilis. P r z y k ł a d III Surową skrobię kukurydzianą poddano działaniu α-amylazy według wynalazku. Figura 1 przedstawia widok próbki kontrolnej ziaren surowej skrobi w powiększeniu 5000 razy, zaś figura 2 przedstawia ziarna skrobi poddane hydrolizie przez 4 godziny w temperaturze 50 C. Widoczne są znaczne zmiany ziaren. Zastrzeżenia patentowe 1. Nowy szczep bakterii Bacillus sp. KU-5, identyfikowany jako Bacillus subtilis z symbolem KU-5 i zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych przy Instytucie Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie do celów postępowania patentowego nr KKP Sposób otrzymywania α-amylazy przy użyciu nowego szczepu Bacillus sp. na drodze fermentacji wgłębnej, na pożywce produkcyjnej zawierającej źródła węgla, azotu i związków mineralnych, a w tym skrobię, z jednoczesnym wstrząsaniem, a po zakończeniu hodowli odwirowaniem powstałego płynu pohodowlanego, przy czym hodowlę produkcyjną prowadzi się w przedziale temperatury od 30C do 45 C i przy ph od 6,5 do 7,5 w czasie h, znamienny tym, że jako mikroorganizm stosuje się szczep Bacillus sp. KU-5 nr KKP 2016, zaś skrobię stanowi surowa skrobia kukurydziana. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że ilość skrobi surowej wynosi od 0,5% do 4% (w/v).

7 Rysunki 7

8 8 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)