Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów:

Transkrypt

1 Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: dobór warunków samej reakcji PCR (temperatury, czas trwania cykli, ilości cykli itp.) dobór odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji dobór właściwych ilości składników mieszaniny reakcyjnej tj.: stężenia dntp, polimerazy, starterów, magnezu

2 Warunki temperaturowe reakcji Denaturacja Temperatura i czas trwania etapu denaturacji zależy od rodzaju matrycowego DNA używanego do reakcji wstępna denaturacja - ogrzewanie DNA przez okres 3-5 min w temp C jest wystarczające do denaturacji genomowego DNA opcjonalnie etapy denaturacji w kolejnych cyklach mogą być krótsze i przebiegać w niższej temperaturze

3 Temperatura etapu przyłączania - hybrydyzacji (annealingu) starterów jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na skuteczność i specyficzność reakcji PCR czas trwania tego etapu jest zależny od wielkości starterów, ale zwykle nie przekracza 1 min temperatura przyłączania starterów powinna być o 5 C niższa niż obliczona temperatura topnienia starterów (T m ). Zbyt niska temperatura powoduje, że startery przyłączają się w niespecyficznych miejscach (na zasadzie niepełnej komplementarności Istnieje wiele wzorów na obliczenie temperatury topnienia starterów. Do najprostszych, a zarazem najczęściej używanych należy wzór: T m = [4(G + C) + 2(A + T)] ( C)

4 Dlatego też temperaturę przyłączania starterów najlepiej zoptymalizować przygotowując szereg reakcji PCR z różnymi temperaturami annealingu primerów. Temperatura przyłączania starterów musi być dobrana doświadczalnie gradientowy PCR W praktyce ilość startera, matrycowego DNA, stężenie soli i innych związków obecnych w mieszaninie reakcyjnej wpływa na temperaturę przyłączania startera, która bywa czasami wyższa o kilka stopni od obliczonej temperatury topnienia.

5 Temperatura i czas trwania wydłużania - elongacji startera zależy od używanej polimerazy - zwykle optymalna temperatura wynosi C (szybkość przyłączania nowych nukleotydów 100 nt/s) przyjmuje się jednak, że do syntezy fragmentów o wielkości 1 kpz wymagany czas elongacji wynosi 1 min.

6 Temperatura elongacji startera c. d. obniżenie temperatury elongacji wpływa znacznie na szybkość syntezy np. już przy 70 C ilość wstawianych nukleotydów wynosi ok. 60 nt/s. obniżenie temperatury elongacji kosztem wydłużenia czasu jej trwania jest korzystne np. wtedy, gdy wymagana jest większa dokładność w syntezie nowej nici np. w reakcji cyklicznego sekwencjonowania lub wówczas gdy amplifikowany fragment będzie klonowany do wektorów ekspresyjnych. W takich przypadkach stosowane są temperatury C i wydłużamy czas elongacji. Przy wysokiej temperaturze przyłączania starterów możliwe jest ograniczenie etapów reakcji PCR do denaturacji i wspólnego etapu przyłączania i wydłużania starterów. Jest to tzw. dwustopniowy PCR

7 Ilość cykli w reakcji PCR wynosi od 20 do 50 i zależy głównie od początkowej ilości matrycowego DNA. Dla małej ilości docelowego DNA (ok. 50 cząsteczek) sugeruje się cykli teoretyczna wydajność reakcji po n cyklach wynosi 2 n dwuniciowych, specyficznych cząsteczek DNA rzeczywista wydajność jest niższa (mniejsza wydajność reakcji np. przez spadek ilości dntp, zmniejszenie aktywności polimerazy).

8 Składniki reakcji PCR matrycowe DNA startery termostabilna polimeraza DNA odpowiedni bufor reakcyjny jony magnezu mieszanina czterech dezoksyrybonukleotydów (dntp)

9 Startery długość primerów powinna wynosić około zasad, a temp. ich topnienia, która zależy od rodzaju i ilości nukleotydów od C ze względu na wydajność syntezy i stabilność oligonukleotydów, powinno się unikać starterów o długości powyżej 40 nukleotydów startery mogą zawierać zmodyfikowane nukleotydy, najczęstsze modyfikacje to: znakowanie fluorochromami, biotyną, digoksgeniną czy wbudowywanie tionukleotydów jeśli amplifikowane produkty mają wielkość kilkuset pz startery mogą być nieco krótsze (16-18 nt), dla fragmentów rzędu kilku kpz startery powinny być dłuższe (24 i więcej nt)

10 Parametry dobrego startera powinien być wysoko specyficzny dla danej sekwencji Przy amplifikacji z użyciem całkowitego DNA nietrudno sobie wyobrazić, że starter przyłączy się tylko do jednego miejsca. Prawdopodobieństwo wystąpienia dwóch identycznych 20 nt starterów wynosi 4 20 czyli Oznacza to, że sekwencja danego startera występuje raz na nukleotydów. Ze względu na wielkość genomów teoretycznie niemożliwe jest występowanie dwóch takich starterów w genomie. obecność na 3 końcu startera nieunikalnych sekwencji o długości 6-7 nt objawia się występowaniem niespecyficznych produktów w reakcji PCR. Pracując z DNA ssaków trzeba zawsze sprawdzać czy projektowany starter nie wykazuje homologii z sekwencjami powtórzonymi typu Alu lub innymi sekwencjami repetetywnymi. Należy również unikać homooligomerów (jak AAAAAA-) i dwunukleotydowych powtórzeń typu np. ATATAT-.

11 Primery c. d. starter powinien zawierać około 50% par GC. Ilość GC wpływa na temperaturę topnienia starterów, która nie może być większa niż optymalna temperatura działania polimerazy wymóg co do proporcji GC/AT nie jest bezwarunkowy, gdyż np. dla genomów o dużej zawartości par GC, czy miejsc bogatych w AT niemożliwe jest jego spełnienie przyjmuje się że startery powinny zawierać ilość GC/AT podobną lub wyższą niż amplifikowana matryca nie powinny tworzyć struktur typu szpilki do włosów nie powinny zawierać w części 3 końcowej sekwencji komplementarnych do samych siebie oraz do drugiego startera

12 odległość między starterami w amplifikowanym DNA powinna wynosić od 0.1 do kilku kpz, ponieważ... Większość standardowych polimeraz używanych w reakcji PCR wydajnie amplifikuje fragmenty do kilku tysięcy nukleotydów. Amplifikacja dłuższych fragmentów wymaga użycia specjalnie przystosowanych polimeraz lub ich mieszanin, a także specyficznych warunków amplifikacji. robocze stężenie każdego z primerów w mieszaninie reakcyjnej wynosi od 0,2-0,4 M i stanowi molowy nadmiar w stosunku do ilości moli matrycy! stężenie 1 M odpowiada ilości 1pmola startera w 1 l roztworu

13 Bufor reakcyjny bufor reakcji PCR jest specyficzny dla danej polimerazy i zwykle jest dostarczany razem z polimerazą stabilizuje ph mieszaniny reakcyjnej w buforze obecne są również jednowartościowe jony w postaci KCl, ich standardowe stężenie wynosi ok. 50mM i umożliwia amplifikację fragmentów o wielkości powyżej 500pz. Większe stężenie soli (70-100mM) poprawia amplifikację fragmentów poniżej 500pz

14 Jony dwuwartościowe wszystkie polimerazy wymagają do działania dwuwartościowych kationów, zwykle są to jony Mg +2, ale niektóre polimerazy działają również po dodaniu jonów Mn +2 ilość cząsteczek Mg +2 musi przewyższać ilość grup fosforanowych obecnych w mieszaninie reakcyjnej ponieważ zarówno wolne nukleotydy jak i startery wiążą jony Mg +2 końcowe stężenie Mg +2 wynosi zwykle od 0,5 do 5 mm

15 Deoksynukleotydy (dntp) stosowany mix dntp powinien zawierać równe ilości czterech nukleotydów datp, dttp, dctp i dgtp końcowe stężenie poszczególnych nukleotydów w mieszaninie reakcyjnej wynosi zwykle od 200 do 250 M (w objętości 50 l jest to ilość dntp wystarczająca do syntezy ok. 6-6,5 g DNA) Wysokie stężenie dntp (>4 mm) hamuje reakcję PCR prawdopodobnie poprzez wiązanie jonów Mg +2. Przy amplifikacji krótkich fragmentów DNA (do 1 kpz) można używać mniejszych ilości nukleotydów (0,5 pm-20 M)

16 Czułość reakcji PCR ilość matrycowego DNA potrzebna do PCR jest stosunkowo mała (teoretycznie wystarczy jedna cząsteczka DNA) Jeśli to możliwe końcowe stężenie DNA w próbce powinno być rzędu ng.

17 Ilość matrycy potrzebnej do wydajnej amplifikacji zależy od jej złożoności. Np. w 4kb plazmid niosącym 1 kb wstawkę interesujący nas target stanowi 25%. Dla porównania 1 kb target w genomie ludzkim ( bp) stanowi ok %. A zatem dla utrzymania tej samej ilości docelowego DNA matrycowego na starcie reakcji PCR należy użyć 1,000,000- razy więcej ludzkiego genomowego DNA niż plazmidu 1μg of 1kb dsdna = molecules 1μg of pgem Vector DNA = molecules 1μg of lambda DNA = molecules 1μg of E. coli genomic DNA = molecules 1μg of human genomic DNA = molecules Mała ilość matrycy mała wydajność amplifikacji, zbyt duża ilość matrycy niespecyficzna amplifikacja.

18 Unikanie zanieczyszczeń w reakcji PCR Główną zasadą jaka powinna być spełniona to fizyczne rozdzielenie etapów procedury przygotowania próbki i reakcji PCR Zestaw plastików (końcówki pipet, próbówki) pipety automatyczne powinny być używane tylko do określonego przeznaczenia (izolacja lub PCR)