BIOSYNTEZA ACYLAZY PENICYLINOWEJ. Ćwiczenia z Mikrobiologii Przemysłowej 2011

Transkrypt

1 BIOSYNTEZA ACYLAZY PENICYLINOWEJ Ćwiczenia z Mikrobiologii Przemysłowej 2011

2 Acylaza penicylinowa Enzym hydrolizuje wiązanie amidowe w penicylinach Reakcja przebiega wg schematu: acylaza Reszta: fenyloacetylowa w Pen. G Fenoksyoctowa w Pen. V i prowadzi do otrzymania kwasu 6-aminopenicylanowego z równoczesnym odszczepieniem reszty kwasowej

3 Środowisko reakcji Reakcja zachodzi w środowisku obojętnym lub lekko alkalicznym. W środowisku kwaśnym acylaza posiada zdolność katalizowania reakcji odwrotnej syntezy penicyliny lub innych amidów.

4 Producenci acylazy penicylinowej Produkowana przez różne drobnoustroje. W zależności od producenta enzym istnieje w formie różnych izoenzymów o różnych właściwościach i specyficzności substratowej. Jeden producent może wytwarzać acylazy o różnych specyficznościach substratowych.

5 Podział acylaz penicylinowych Typ 1 acylaza fenoksymetylopenicylinowa (PVA) Duża różnorodność różna specyficzność substratowa. Szybsze i wydajniejsze usuwanie grup acylowych z penicyliny fenoksymetylowej niż benzylowej. Producenci: grzyby z rodzaju Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Mucor, Trichoderma, Botrytis i promieniowce. Produkcja konstytutywna lub indukowana. Właściwości: działanie w ph 8 10 i temp C. Częstsze wytwarzanie zewnątrzkomórkowe niż wewnątrzkomórkowe.

6 Podział acylaz penicylinowych Typ 2 acylaza benzylopenicylinowa (PGA) Efektywniejsza hydroliza penicyliny benzylowej niż innego typu. Szerokie zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym Producenci: bakterie należące do różnych rodzajów: Escherichia, Bacillus, Aerobacter, Proteus, Corynebacterium, Micrococcus (częściej gramujemne). Właściwości: duża rozpiętość, ph 7,5 8,5, temp C. Indukowana kwasem fenylooctowym. Wytwarzana głównie wewnątrzkomórkowo przez zwierzęta i rośliny.

7 Produkcja przemysłowa Stosowane są acylazy pochodzące zarówno z bakterii, jak i z grzybów. Do hydrolizy penicylin używane są całe komórki lub immobilizowany na różnych nośnikach enzym.

8 Metody otrzymywania kwasu 6-AP Bezpośrednia fermentacja Enzymatyczna hydroliza penicylin Mała wydajność Chemiczne odszczepianie bocznego łańcucha penicylin Doskonała wydajność Wady: konieczność stosowania bardzo niskich temperatur, energochłonność, drogie i nietrwałe surowce (wysoki koszt), powstawanie odpadów zanieczyszczających środowisko naturalne Zwiększenie wydajności metod enzymatycznych osiągnięte dzięki immobilizacji enzymu

9 Penicyliny półsyntetyczne Kwas 6-AP jest bardzo ważnym półproduktem do wytwarzania penicylin półsyntetycznych. Penicyliny półsyntetyczne otrzymuje się przez acylowanie kwasu 6-AP. Wiele z nich ma zastosowanie kliniczne: Zmodyfikowane penicyliny oporne na działanie β-laktamaz: metycylina, nafcylina, kloksacylina (syntarpen), ampicylina, karbenicylina.

10 Warunki wytwarzania acylazy na skalę przemysłową Podłoże na bazie peptydów i peptonów. Dodatek łatwo metabolizowanych węglowodanów hamuje syntezę. Zwiększenie wydajności przez indukowanie acylazy kwasem fenylo- lub fenoksyoctowym. Temperatura C. Silne napowietrzanie. ph obojętne lub lekko alkaliczne. Maksymalna produkcja w logarytmicznej fazie wzrostu bakterii. Hodowla prowadzona przez 1 4 dni.

11 Warunki wytwarzania acylazy na skalę przemysłową - preparaty W produkcji stosowane są udoskonalone pod względem genetycznym, wysokowydajne szczepy: Escherichia coli Kluyvera citrophila Pseudomonas melanoganum Bacillus megaterium Preparaty enzymatyczne stanowią immobilizowane komórki drobnoustrojów lub częściej oczyszczony enzym.

12 Oczyszczanie acylazy Stanowi 0,1 1 % masy komórkowej. Oczyszczanie przez: frakcyjne wytrącanie np. siarczanem amonu, chromatografię powinowactwa, adsorpcyjną, technikę podziału w wodnych układach dwufazowych, elektroforezę preparatywną, dializę i fermentację.

13 Problem produkcji W trakcie reakcji hydrolizy wiązania amidowego powstaje kwas karboksylowy, który powoduje obniżenie ph środowiska. W niskim ph enzym traci aktywność, więc środowisko reakcji musi być neutralizowane. W tym celu stosuje się dodatek wody amoniakalnej lub ługu sodowego.

14 Produkcja przemysłowa acylazy ciąg dalszy Wydajność hydrolizy powinna wynosić %. Do hydrolizy używana najczęściej penicylina benzylowa lub fenoksyoctowa (sól sodowa lub potasowa). Produkt reakcji (kw. 6-AP) izoluje się z roztworu przez krystalizację.

15 Inne substraty acylazy penicylinowej Specyficzność nie jest ograniczona tylko do penicylin. dezacetoksycefalosporyna benzylowa lub fenoksymetylowa kw. 7- aminodezacetoksycefalosporanowy (7-ADCK) a c y l a z a dezacetocefalosporyny półsyntetyczne

16 Rola acylazy penicylinowej w metabolizmie komórkowym nie jest jasna może być ona zaangażowana w degradację związków fenylooctowych, które mogą stanowić źródło węgla w komórce.