E.coli Transformer Zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli

Transkrypt

1 E.coli Transformer Zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli Wersja x40 transformacji Nr kat Zestaw zawiera komplet odczynników do przygotowania sześciu preparatyk komórek kompetentnych. Każda z preparatyk wystracza na przeprowadzenie czterdziestu transformacji.

2 -2- Przygotowanie komórek kompetentnych Wyposażenie i materiały niezbędne do przygotowania komórek kompetentnych nie wchodzące w skład zestawu: wytrząsarka 37ºC jałowa pożywka LB (1% trypton, 0,5% ektrat drożdżowy, 1% NaCl, ph 7,0) (Skład i przygotowanie pożywki na stronie 7) jałowe probówki typu Falkon o pojemności 50 ml wirówka z rotorem do wirowania probówek typu Falkon o pojemności 50 ml sterylne probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml szczep Escherichia coli Przed przystąpieniem do protokołu: Bakterie Escherichia coli należy przesiać posiewem redukcyjnym na płytkę z podłożem LA (Skład i przygotowanie podłoża na stronie 7). Płytkę inkubować w temperturze 37ºC przez noc Roztwory S1 i S2 należy schłodzić w lodzie Protokół 1. W 10 ml pożywki LB (w razie konieczności z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku) zaszczepić pojedyńczą kolonię E.coli uzyskaną z posiewu redukcyjnego. Inkubować hodowlę w wytrząsarce w temperaturze 37ºC przez noc 2. Do 100 ml świeżej pożywki LB (w razie konieczności z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku) dodać 1 ml hodowli nocnej 3. Inkubować w wytrząsarce w temperaturze 37ºC przez 2-3 godzin, rpm, do uzyskania OD600=0,3-0,5 kiedy bakterie osiągną fazę logarytmicznego wzrostu 4. Po osiągnięciu odpowiedniego OD600 hodowlę schłodzić w lodzie przez 15 min 5. Następnie odwirować hodowlę przez 5 min przy 3500 rpm w wirówce i rotorze schłodzonym do +4ºC 6. Osad bakterii delikatnie zawiesić w 2 ml Roztworu S1. Roztwór S1 i S2 należy schłodzić w lodzi

3 -3-7. Ostrożnie dodać 2 ml Roztworu S2 i delikatnie wymieszać 8. Mieszaninę inkubować w lodzie przez 15 minut 9. Rozporcjować zawiesinę komórek kompetentnych po 100 μl do sterylnych probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml Na jedną transformację należy używać 100 μl komórek kompetentnych. Nie zaleca się wielokrotnego zamrażania/rozmrażania komórek kompetentnych 11. Tak przygotowane komórki kompetentne można użyć bezpośrednio do transformacji (patrz strona 4) lub zamrozić w -80ºC w celu późniejszego użycia Bardzo ważne jest aby komórki kompetentne zamrażać powoli. Nie wolno zamrażać komórek w ciekłym azocie. Zaleca się przechowywanie komórek kompetentnych w pudełku styropianowym, w temperaturze -80ºC

4 -4- Transformacja komórek kompetentnych Wyposażenie i materiały niezbędne do transformacji komórek kompetentnych nie wchodzące w skład zestawu: termoblok 37ºC lub łaźnia ultradźwiękowa (o mocy 300 W lub więcej) wirówka płytki z podłożem selekcyjnym 1 płytka na 1 transformację jałowa pożywka LB (1% trypton, 0,5% ektrat drożdżowy, 1% NaCl, ph 7,0) (Skład i przygotowanie pożywki na stronie 7) Przed przystąpieniem do protokołu: Przygotować odpowiednią liczbę płytek z podłożem selekcyjnym Przed przystąpieniem do transformacji podłoża powinny mieć temperaturę pokojową Zaleca się przygotowanie dodatkowej płytki z podłożem selekcyjnym dla kontroli negatywnej transformacji Protokół 1. Do każdej transformacji użyć 100 μl komórek kompetentnych E.coli, rozmrożonych w lodzie lub świeżo przygotowanych schłodzonych w lodzie 2. Do komórek kompetentnych dodać plazmidowego DNA lub mieszaniny ligacyjnej i delikatnie wymieszać Większa ilość DNA może podnieść efektywność transformacji. Objętość DNA nie powinna być większa niż 20 μl 3. Mieszaninę DNA/komórki kompetentne inkubować w lodzie przez min Podczas inkubacji w lodzie probówką z mieszaniną nie należy potrząsać i mieszać ponieważ wpływa to na obniżenie efektywności transformacji. Dłuższy czas inkubacji polepsza efektywność transformacji 4. Po inkubacji probówki z mieszaniną umieścić ostrożnie w termobloku w temperaturze 37ºC przez 10 min Krok ten można wykonać również w łaźni ultradźwiękowej. Do włączonej łaźni ultradźwiękowej o temperaturze pokojowej wstawiamy próbki na 5-10 s 5. Mieszaninę transformacyjną schłodzić w lodzie przez 2 min Jeśli transformowany jest plazmid z opornością na ampicylinę przejść do pkt. 7

5 6. Do mieszaniny dodać 1 ml podgrzanej do 37ºC pożywki LB bez antybiotyku. Inkubować hodowlę w temperaturze 37ºC z wytrząsaniem 220 rpm przez 45 min w celu ekspresji genów odpowiedzialnych za oporność stransformowanych komórek na antybiotyk 7. Na płytkę z podłożem selekcyjnym wysiać po μl mieszaniny transformacyjnej Płytki inkubować w temperaturze 37ºC przez noc. Średnia wydajność transformacji do komórek E.coli TOP10F wynosi CFU dla plazmidu puc19

6 Skład zestawu -6- Odczynnik Nr kat Ilość Sposób przechowywania Roztwór S S1 15 ml +4-8 ºC Roztwór S S2 15 ml +4-8 ºC Zestaw był testowany na pochodnych szczepów E. coli B, E. coli K-12 Firma A&A Biotechnology udziela rocznej gwarancji na niniejszy zestaw. Firma nie gwarantuje poprawnego działania zestawu w wypadku: odstępstw od dostarczonego wraz z zestawem protokołu braku zalecanego w niniejszym protokole wyposażenia i materiałów użycia innych odczynników niż zalecane lub które nie wchodzą w skład zestawu użycia przeterminowanych odczynników Roztwór S1, Roztwór S2 (Xn, Harmful, R:22-36 S: 26-37) (Xn, Środek szkodliwy) Działa szkodliwie po połknięciu. Działa drażniąco na oczy i skórę. Zanieczyszczone oczy przemyć natychmiast dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza. Nosić odpowiednie rękawice ochronne.

7 -7- Pożywki LB 1% trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 1% NaCl, ph 7,0 Przygotowanie 1000 ml pożywki: 1. W 1000 ml wody rozpuścić 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g soli. 2. Doprowadzić ph do wartości 7,0 z użyciem 1M NaOH 3. Mieszaninę autoklawować LA 1% trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 1% NaCl, 1.5% agar, ph 7,0 Przygotowanie 1000 ml pożywki: 1. W 900 ml wody rozpuścić 10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu, 15 g agaru 2. Doprowadzić ph do wartości 7,0 z użyciem 1M NaOH 2. Mieszaninę autoklawować 3. Po ochłodzeniu pożywki do 60ºC jeśli konieczne należy dodać odpowiedniego antybiotyku.

8 Lista produktów powiązanych z zestawem Składniki i Gotowe podłoża Ilość Nr kat. Ekstrakt drożdżowy 250 gr gr gr Trypton 250 gr gr gr Agar 250 gr gr gr LB 250 gr gr LB-Agar (LA) 250 gr gr Ampicilin sodium 5 gr gr gr Kanamycin Monosulfate 5 gr gr gr Chloramphenicol 5 gr gr gr Carbenicillin Disodium 5 gr gr gr Zeocyna 1 gr