Wpływ inhibitorów na wartości kinetycznych efektów izotopowych w reakcji katalizowanej przez enzym fenololiazę tyrozynową

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Wpływ inhibitorów na wartości kinetycznych efektów izotopowych w reakcji katalizowanej przez enzym fenololiazę tyrozynową"

Kornelia Żurawska
5 lat temu
Przeglądów:

Wpływ inhibitorów na wartości inetycznych efetów izotopowych w reacji atalizowanej przez enzym fenololiazę tyrozynową Wojciech Augustynia, Marianna

1 Wpływ inhibitorów na wartości inetycznych efetów izotopowych w reacji atalizowanej przez enzym fenololiazę tyrozynową Wojciech Augustynia, Marianna Kańsa Pracownia Peptydów, Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawsiego IV Krajowa Konferencja Radiochemia i Chemia Jądrowa Kraów Przegorzały, 911 maja 005

2 Plan wystąpienia 1. Wstęp: ogólna charaterystya fenololiazy tyrozynowej mechanizm działania enzymu. Metody wyznaczania KIE w badanej reacji za pomocą metody onurencyjnej (radiochemia) i nieonurencyjnej (pomiary inetyi). Wynii badań nad wpływem rozpuszczalnia ( vs D ), inhibitorów (fenol, Lfenyloalanina, SmetyloLcysteina) i wasu Lewisa (AlCl ) na wartości inetycznych efetów izotopowych w enzymatycznym rozładzie tyrozyny 4. Podsumowanie i dysusja wyniów w onteście mechanizmu reacji atalizowanej przez fenololiazę tyrozynową

3 Fenololiaza tyrozynowa C TPL PLP C N podczas reacji ulega rozerwaniu wiązanie pomiędzy alifatycznym i aromatycznym atomem węgla proton z pozycji α jest częściowo przenoszony na atom węgla 1 reszty aromatycznej atalizuje taże reację syntezy Ltyrozyny z pochodnych fenolu i pirogronianu, racemizację alaniny, wymianę atomu wodoru α w ilu Laminowasach oraz deaminację atomu węgla α do atywności atalitycznej onieczne są ationy jednowartościowe (K, Rb, Cs lub N 4 ); jony Na i Li to inhibitory TPL

4 Fenololiaza tyrozynowa inaczej: βtyrozynaza, TPL, E.C występowanie: Gramujemne Enterobacteriaceae i nietóre stawonogi budowa: biało α/β wymiary 15Å x 60Å x 144Å 4 podjednosti po 51Da znana strutura rystalograficzna zastosowanie: biotechnologiczne otrzymywanie dopy oznaczanie PLP w materiale biologicznym utylizacja odpadów fenolowych

5 Mechanizm działania TPL N K 57 N P C N N N P C N N C P N N C P N N C P N P C N

6 Wyznaczanie KIE metodą nieonurencyjną C 1U/ml TPL 50μM PLP p M KP i 0.M KCl 1mM DTT C 0U/ml LD 0.4mM NAD N C v Dodate NAD i dużego nadmiaru LD czyni reację nieodwracalną i umożliwia bezpośredni pomiar inetyi poprzez spetrofotometryczny pomiar spadu absorpcji przy 40nm V max Pomiar szybości reacji dla różnych stężeń Ltyrozyny umożliwia wyznaczenie V max i K m z równania MichaelisaMenten 0.5 V max K m V v = (K max m [S] [S]) [S]

7 Wyznaczanie KIE metodą onurencyjną C 1U/ml TPL 50μM PLP p M KP i 0.M KCl 1mM DTT C 0U/ml LD eq NAD N C Po rozdziale produtów i substratów za pomocą chromatografii jonowymiennej wyznaczano radioatywność właściwą wyjściowych substratów (R 0 ), produtów (R p ) i stopień onwersji (f); KIE obliczano używając równanie YanwichaTonga: R0 ln(1 f ) Rp α = ln(1 f) Metoda podwójnego znaowania, 1 14 C jao standard wewnętrzny NAD i LD przeształcają nietrwały pirogronian w trwały Lmleczan

8 Efety izotopowe w pozycji Kinetyczny efet izotopowy /D α V α V/K C Atom wodoru α i cząstecza wody biorą udział w tym samym stanie przejściowym derwanie protonu α ma więsze znaczenie dla szybości reacji, niż jego następcza wymiana z rozpuszczalniiem D.4 ± ± ± ± 0.61 Rozpuszczalniowy efet izotopowy /D bserwowany inetyczny efet izotopowy /T bs. KIE 4,00,00,00 α V α V/K Ltyrozyna [ ]Ltyrozyna 1.49 ± ± ± ± 0.1 1,00 0,10 0,0 0,0 0,40 0,50 f D

9 Badania NMR 1 NMR A BF B C D start D C A C 15 E D PLP TPL 45 C F N E Wymiana protonów w pozycji nie zachodzi w widoczny sposób po dodaniu do uładu dehydrogenazy mleczanowej i LD

10 C D α V = 1.09 ± 0.04 D α V/K = 0.98 ± 0.10 Efety izotopowe w pozycji 5,00 4,00 C C bs. KIE,00,00 T α V/K = 1.09 ± 0.0 1,00 D 0,10 0,0 0,0 0,40 f

11 Wpływ produtów reacji na KIE /T C C,00 5,00 1,50 4,00 bs. KIE 1,00 0,50 bez fenolu z fenolem 0,10 0,0 f bs. KIE,00,00 1,00 bez fenolu z fenolem 0,10 0,0 0,0 0,40 f bserwowany KIE /T w pozycjach i S nie zależy od obecności: pozostałych produtów reacji (was pirogronowy, amonia) produtu ubocznego reacji (was phydrosyfenylopirogronowy)

12 Stałe inhibicji fenolem Ltyrozyna [ ]Ltyrozyna [ ]Ltyrozyna K i (V max ) [μm] 67 ± 6 11 ± 1 97 ± 6 K i (V max /K m ) [μm] 64 ± 8 8 ± 7 59 ± 6 1 Ph E S EQ EA E 1 Ph P V max V max /K m Szybości reacji: V max = [E] [Ph] V max / K m = 1 [E] 1 1 [Ph] Początowe szybości reacji: V max = [E] V max / K m 1 [E] = 1 Stałe inhibicji: V V [Ph] = 1 i K i K ( V i max ) = K i (V max /K m ) = ( 1 1 )

13 Wpływ aminowasów na KIE /T w pozycji S C C,00 Ulega αdeprotonacji Ulega βeliminacji 1,50 C Ulega αdeprotonacji Nie ulega βeliminacji bs. KIE 1,00 0,50 bez dodatu z Phe z SmetyloCys 0,10 0,0 f

14 Wpływ wasów Lewisa na wartości KIE /T Kwasy Lewisa przyspieszają tworzenie zasady Schiffa pomiędzy tyrozyną a PLP w roztworze,00,00 1,50 bs. KIE 1,00 0,50 0,10 0,0 f C bez dodatu z AlCl bs. KIE,00 1,00 0,10 0,0 f C bez dodatu z AlCl Pomiar parametrów inetycznych reacji w obecności Al oazał się niemożliwy. Początowo reacja biegnie z szybością zbliżoną do procesu bez dodatu soli glinu. Później następuje masymalnie.5rotne spowolnienie procesu (przy mm AlCl ), prawdopodobnie wsute wytworzenia się zasady Schiffa.

15 Podsumowanie Reacja hydrolitycznego rozładu tyrozyny atalizowana przez fenololiazę tyrozynową: zachodzi z wymianą protonów α i β z wodą biegnie przez etapy tórych względne szybości zmieniają się w miarę trwania procesu; np. szybość oderwania α i βprotonów maleje drastycznie w tracie reacji jest reacją w tórej podstawienie protonów wody deuteronami nie powoduje dużej zmiany względnej szybości deprotonacji względem eliminacji fenolu na atomie węgla α. dmienna sytuacja ma miejsce podczas deprotonacji w pozycji β, gdzie woda deuterowana zdecydowanie bardziej promuje proces deprotonacji niż to ma miejsce dla zwyłej wody różnicuje diastereotopowe atomy wodoru w pozycji β, tóre zachowują się odmiennie podczas całego procesu jest reacją w tórej zmiany względnych szybości poszczególnych etapów nie są powodowane pojawianiem się produtów oddysocjowujących od enzymu może być warunowana tworzącym się przejściowo poczas reacji αaminoarylanem związanym z PLP zachodzi wolniej w obecności wasów Lewisa, ale względne szybości poszczególnych etapów pozostają bez istotnych zmian w obecności taich wasów

16 Podzięowania dla dra Ryszarda Kańsiego (Pracownia Radiochemii na Wydziale Chemii UW) za umożliwenie wyonania esperymentów radiochemicznych i pomoc w ich realizacji dla prof. Roberta Phillipsa (University of Georgia, Athens, USA) za dostarczenie TPL i cenne dysusje dla oleżane z zespołu za tworzenie dobrej atmosfery w grupie dla organizatorów IV Krajowej Konferencji Radiochemia i Chemia Jądrowa za umożliwienie nam zaprezentowania wyniów badań Dzięuję za uwagę!

Podobne dokumenty

Syntezy izotopomerów L-tyrozyny i ich wykorzystanie do badania mechanizmu działania. ania β-tyrozynazy

Syntezy izotopomerów L-tyrozyny i ich wykorzystanie do badania mechanizmu działania. ania β-tyrozynazy Syntezy izotopomerów Ltyrozyny i ich wykorzystanie do badania mechanizmu działania ania βtyrozynazy Wojciech Augustyniak Promotor: prof. dr hab. Marianna Kańska Pracownia Peptydów Wydział hemii UW Plan