NOVA Lite HEp-2 ANA Kit with DAPI Do diagnostyki In Vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 NOVA Lite HEp-2 ANA Kit with DAPI Do diagnostyki In Vitro Złożoność CLIA: Wysoka Kod produktu: Przeznaczenie NOVA Lite HEp-2 to pośrednie badanie immunofluorescencyjne do badań przesiewowych i oznaczania półilościowego przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) w surowicy ludzkiej. Obecność przeciwciał przeciwjądrowych może być stosowana w połączeniu z objawami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi, aby wspomóc diagnostykę tocznia rumieniowatego układowego (SLE) lub innych chorób tkanki łącznej bądź reumatycznych. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Pojęcie przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) opisuje różnorodne przeciwciała, które wchodzą w reakcję ze składnikami jąder komórkowych, w tym z DNA, RNA oraz wieloma białkami i rybonukleoproteinami. 1 Te przeciwciała często występują u pacjentów z chorobami tkanki łącznej lub reumatycznymi, szczególnie toczniem rumieniowatym układowym. Praktycznie wszyscy pacjenci SLE są ANA-pozytywni. Ta czułość diagnostyczna doprowadziła do włączenia przez podkomisję Amerykańskiego Kolegium Reumatologii testowania ANA do poprawionych w 1982 r. kryteriów klasyfikacji toczenia rumieniowatego układowego. 2 Pomimo tego, że badanie ANA jest doskonałym badaniem przesiewowym dla SLE (wynik negatywny praktycznie wyklucza aktywne SLE 3 ), w żadnym wypadku nie jest to badanie swoiste. Pacjenci z innymi chorobami tkanki łącznej, jak reumatoidalne zapalenie stawów, twardzina i zapalenie skórno-mięśniowe mają często wyniki pozytywne i w innych stanach chorobowych oraz u osób zdrowych można obserwować niskie miana ANA. Pozytywne wyniki ANA mogą występować po ciężkich oparzeniach lub infekcjach wirusowych i zgłaszano je u niektórych osób zdrowych, zwłaszcza osób starszych. Ze wzg lędu na brak swoist ości zaleca się, aby wszystkie prób ki pozytywne pod wzg lędem ANA miar eczkować do punktu końcowego i pr zepr owadzić bardziej swoist e badania pod kątem autopr zeciwciał skier owanych pr zeciwko podwój nej nici DNA ( dsdna) i ekstrahowalnemu ant ygenowi j ądr owemu ( ENA). Referencyjną metodą badania ANA jest pośrednia immunofluorescencja. Popularnymi substratami są cienkie skrawki narządów gryzoni lub różne rodzaje linii komórkowych. Ogólnie jest przyjęte, że substraty linii komórkowych są preferowane przed skrawkami narządów, ponieważ szybko dzielące się komórki wykazują wyższe poziomy określonych antygenów istotnych klinicznie, w tym centromeru, SS-A(Ro), Scl-70 i PCNA/cykliny. Oprócz rodzaju substratu dla wydajności testu ANA kluczowe są trzy inne czynniki: 1) utrwalacz zastosowany podczas przygotowywania preparatu, 2) współczynnik fluoresceiny do białka (F/P) oraz 3) swoistość podklasy immunoglobulin koniugatu. Niektóre utrwalacze lub ich kombinacje niszczą określone antygeny jądrowe i należy unikać ich stosowania. Czułość i nieswoistość barwienia tła koniugatu jest określana przez współczynnik F/P, natomiast swoistość chorobowa koniugatu jest określana przez reaktywność podklasy immunoglobulin. Praktycznie wszystkie istotne klinicznie autoprzeciwciała wykazują swoistość podklasy IgG, nawet w obecności ANA swoistych wobec IgM i IgA. 4 Dla odróżnienia ANA występujące u zdrowych krwiodawców to ogólnie wyłącznie podklasy IgM oraz IgA. 5 Z tego powodu koniugaty swoiste dla IgG mają wyższą swoistość chorobową. Substrat wybrany dla badania NOVA Lite HEp-2 ANA to optymalnie utrwalona linia komórkowa nabłonka ludzkiego (HEp-2) a koniugat to oczyszczona metodą powinowactwa IgG przeciwludzka posiadająca starannie wybrany współczynnik F/P. 1

2 Te parametry odczynników umożliwiają wykrywanie przez test NOVA Lite HEp-2 ANA autoprzeciwciał istotnych klinicznie (w tym SS-A i Scl-70), które mogą pozostawać niewykryte przez niektóre inne komercyjne testy ANA. Ponadto koniugat IgG swoiście eliminuje wyniki fizjologicznie fałszywie pozytywne spowodowane normalnie występującymi niskimi mianami autoprzeciwciał IgM, które często występują u zdrowych osób starszych. Zasady badania W p r z y p a d k u p o ś r e d n i e j t e c h n i k i i m m u n o f l u o r e s c e n c j i p r ó b k i s ą i n k u b o w a n e z s u b s t r a t e m a n t y g e n przeciwciała, które nie weszły w reakcję, są ypłukiwane. w Substrat jest inkubowany ze swoistym koniugatem znakowanym fluoresceiną, a następnie niezwiązany odczynnik jest wypłukiwany. Próbki zawierające autoprzeciwciała obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym będą wykazywać jasnozieloną 2 fluorescencyjną barwę w miejscach komórki lub jądra, gdzie nastąpiło związanie autoprzeciwciał. Odczynniki Preparaty substratu HEp-2 (ludzkie komórki nabłonkowe); 12 dołków/preparat wraz z osuszaczem Koniugat IgG przeciwludzkich (kozich), znakowany fluoresceiną w buforze zawierającym DAPI i,09% azydku sodu Kontrola wzoru punktu końcowego miareczkowania ANA, 1 fiolka buforu zawierającego 0,09% azydek sodu oraz przeciwciała surowicy ludzkiej przeciw HEp-2, wstępnie rozcieńczona System kontroli negatywnej IFA, 1 fiolka buforu zawierającego 0,09% azydek sodu bez przeciwciał surowicy ludzkiej przeciw HEp-2, wstępnie rozcieńczona Koncentrat PBS (40x), wystarcza na 2000 ml Środek do osadzania preparatu, 0,09% azydek sodu Szkiełka nakrywkowe Ostrzeżenia 1. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W związku z tym kontrola wzoru punktu końcowego miareczkowania ANA i system kontroli negatywnej IFA powinny być obsługiwane w taki sam sposób jak materiał potencjalnie zakaźny W niektórych składnikach zestawu jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 3. Podczas pracy z dost arczonym i odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochr ony osobistej. 4. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych In Vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niekompletne lub nieskuteczne wypłukanie dołków IFA może spowodować wysoki poziom tła. 2

3 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, moc żarówki używanego mikroskopu, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Z czasem koniugat IgG przeciwludzkiej może zmienić kolor z powodu ekspozycji na światło. Jednak zmiana barwy nie ma wpływu na wynik badania. 7. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Rozcieńczony bufor do płukania jest stabilny przez 4 tygodnie w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały Dostarczony element Preparaty substratu HEp-2, 12 dołków Koniugat FITC przeciwludzkiej IgG z DAPI Możliwy do miareczkowania wzór kontroli ANA Systemu negatywnej kontroli FA Koncentrat PBS (40x) Środek do osadzania preparatu Ilość 20 x 12 dołków 1 x 15 ml 1 x 0,5 ml 1 x 0,5 ml 2 x 25 ml 1 x 7 ml Szkiełka nakrywkowe 1 x 20 3

4 Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety o objętości μl Woda destylowana lub dejonizowana Gruszki laboratoryjne lub pipety Pasteura Komora wilgotna Pojemnik 1 l (do rozcieńczania PBS) Barwiacz Coplina Mikroskop fluorescencyjny z filtrem wzbudzającym 495 nm i filtrem barierowym 515 nm Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20 26 C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat PBS. WAŻNE: Rozcieńczyć koncentrat PBS w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu PBS do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej i dokładnie wymieszać. Bufor PBS jest używany do rozcieńczania próbek pacjentów oraz jako bufor do płukania. Rozcieńczony bufor może być przechowywany maksymalnie przez 4 tygodnie w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczyć próbki pobrane od pacjenta: a. Wstępne badanie przesiewowe: Rozcieńczyć próbki pacjentów rozcieńczonym buforem fosforanowym 1:40 (np. dodać 50 μl surowicy do 1,95 ml buforu fosforanowego). b. Miareczkowanie: Z początkowego rozcieńczenia przesiewowego dla wszystkich próbek pozytywnych wykonać serię 2-krotnych rozcieńczeń za pomocą rozcieńczonego buforu PBS (tj. 1:80, 1: :2560). Procedura badania 1. Przygotować preparat substratu: Preparaty substratu przed wyjęciem z woreczka muszą osiągnąć temperaturę pokojową. Oznaczyć ołówkiem i umieścić w odpowiedniej komorze wilgotnej. Dodać 1 kroplę (20 25 μl) nierozcieńczonej kontroli pozytywnej i negatywnej, odpowiednio do dołka 1 i 2. Dodać 1 kroplę (20 25 μl) rozcieńczonej próbki pacjenta do pozostałych dołków. 2. Inkubacja preparatu: Inkubować preparat przez 30 ± 5 minut w komorze wilgotnej (zwilżony ręcznik papierowy włożony na płasko na spodzie zamkniętej torebki lub szklanego pojemnika zapewni odpowiednie warunki wilgotności). Nie dopuścić do wyschnięcia substratu podczas badania. 3. Wypłukać preparaty: Po inkubacji użyć plastikowej gruszki laboratoryjnej lub pipety, aby delikatnie przepłukać surowicę rozcieńczonym buforem PBS. Ustawić preparat oraz strumień bufora PBS w taki sposób, aby ograniczyć wypłukiwanie próbek między dołkami. Unikać kierowania strumienia bezpośrednio na dołki, aby nie dopuścić do uszkodzenia substratu. Jeśli jest to wymagane, można umieścić preparaty na maks. 5 minut w barwiaczu Coplina z rozcieńczonym buforem PBS. 4. Dodanie koniugatu fluorescencyjnego: Strząsnąć nadmiar buforu PBS. Umieścić preparat z powrotem w komorze wilgotnej i natychmiast przykryć każdy dołek kroplą koniugatu fluorescencyjnego. Inkubować preparaty przez dodatkowe 30 ± 5 minut. 5. Wypłukać preparaty: Powtórzyć etap Szkiełko nakrywkowe: Procedura nakładania szkiełek nakrywkowych różni się w zależności od laboratorium. Zalecana jest poniższa procedura: a. umieścić szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym. b. nanieść środek do osadzania preparatu w formie ciągłej linii na dolnej krawędzi szkiełka nakrywkowego. 4

5 c. strząsnąć nadmiar buforu PBS i zetknąć dolną krawędź preparatu z krawędzią szkiełka nakrywkowego. Delikatnie opuścić preparat na szkiełko nakrywkowe, w taki sposób, aby środek do osadzania preparatu rozpłynął się do górnej krawędzi preparatu bez formowania pęcherzyków powietrza. Kontrola jakości Kontrola wzoru punktu końcowego miareczkowania ANA i system kontroli negatywnej IFA powinny być oznaczane dla każdego preparatu, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury działają prawidłowo. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze poniżej -70 C. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, wyniki badania powinny być traktowane jako nieważne i badanie powinno zostać powtórzone. 1. Nierozcieńczona kontrola wzoru punktu końcowego miareczkowania ANA musi być > System kontroli negatywnej IFA musi być negatywny. Interpretacja wyników Reakcja negatywna. Próbka jest traktowana jako negatywna, jeśli swoiste zabarwienie jest równe lub mniejsze niż systemu kontroli negatywnej IFA. Próbki mogą wykazywać różny stopień barwienia tła ze względu na przeciwciała heterofilne lub niski poziom autoprzeciwciał skierowanych przeciwko składnikom cytoplazmatycznym, jak białka kurczliwe. Reakcja pozytywna. Próbka jest uznawana za pozytywną, jeżeli obserwowane swoiste barwienie jest większe niż systemu kontroli negatywnej IFA. Ustalić stopień fluorescencji lub intensywności za pomocą tych kryteriów: 4+ Jaskrawo jasnozielona fluorescencja 3+ Jasna jasnozielona fluorescencja 2+ Wyraźnie rozpoznawalna pozytywna fluorescencja 1+ Najniższa swoista fluorescencja, która umożliwia wyraźne odróżnienie barwienia jądrowego i/lub cytoplazmatycznego od fluorescencji tła. Interpretacja wzoru. Mogą występować różne wzory barwienia jądrowego i/lub cytoplazmatycznego w zależności od występujących w próbce rodzajów i względnych ilości autoprzeciwciał. Można obserwować następujące wzory barwienia: Jednorodne: Jednolite barwienie jądra z lub bez widocznego maskowania jąderka. Obecność antygenów jądrowych: dsdna, ssdna, histony Powiązanie z chorobą: Wysokie miana sugerują SLE, niższe miana sugerują SLE lub inne choroby tkanki łącznej. Obwodowe: Jednolite barwienie, głównie wokół zewnętrznego obszaru jądra ze słabszym barwieniem w ierunku środka jądra. Obecność antygenów jądrowych: dsdna, ssdna, DNP, histon Powiązanie z chorobą: Wysokie miana sugerują SLE, niższe miana sugerują SLE lub inne choroby tkanki łącznej. 5

6 Plamy: Widoczne delikatne lub ziarniste barwienie jąderka, na ogół bez barwienia fluorescencyjnego jąderek. Obecność antygenów jądrowych: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B i inne jeszcze nie scharakteryzowane układy antygen / przeciwciało. Powiązanie z chorobą: Wysokie miano wskazujące na SLE (przeciwciało Sm), mieszaną chorobę tkanki łącznej (przeciwciało RNP), twardzinę (przeciwciało Scl-70) lub zespół Sjogrenasuchości (przeciwciało SS-B), niższe miana mogą sugerować inne choroby tkanki łącznej. Jąderkowy: Duże ziarniste nakrapiane plamy w jądrze, zazwyczaj mniej niż 6 na komórkę, z lub bez okazjonalnych drobnych plamek. Obecność antygenów jądrowych: 4-6S RNA i inne nieznane antygeny jądrowe. Powiązanie z chorobą: Wysokie miana występują w twardzinie i zespole Sjogrena. Centromer: Wzór barwienia oddzielnego, plamkowego. Plamki jądrowe są bardzo oddzielone i zwykle są wielokrotnością 46. Obecność antygenów jądrowych: Centromer chromosomalny (kinetochor). Powiązanie z chorobą: W dużym stopniu sugeruje zespół CREST, odmianę postępującej twardziny układowej (PSS). CREST to forma PSS z silnym wapnieniem oraz zjawiskiem Raynauda, zaburzeniami czynności przełyku, ograniczonymi objawami skórnymi (często ograniczonymi do palców lub twarzy) i telangiektazją. Mitochondrialny: Oddzielne plamki cytoplazmy względnie oddalone od obszaru jądra. Obecność antygenu: Różne rodzaje antygenów mitochondrialnych. Powiązanie z chorobą: Wysokie miana wskazują na pierwotną marskość żółciową. Istotne jest ostrzeżenie użytkownika, aby zachować ostrożność podczas określenia swoistości autoprzeciwciał na podstawie wzorów, z wyjątkiem wzorów jąderkowych i centromerowych, w których każdy antygen jest bardzo dobrze określony i ich wzory są charakterystyczne. Ponieważ wiele autoprzeciwciał lub ich kombinacji może indukować wzór jednorodny lub plamisty, zaleca się przeprowadzania na wszystkich próbkach plamistych lub jednorodnych kontrolnych badań autoprzeciwciał swoistych (takich jak dsdna i ENA). Ograniczenia badania 1. Wysokie miana ANA sugerują chorobę tkanki łącznej, ale nie powinny być uznawane za diagnostyczne. Wynik badania ANA powinien być analizowany w połączeniu z innymi wynikami serologicznymi oraz ogólnym wywiadem klinicznym pacjenta. 2. Wzory ANA często zmieniają się, gdy próbka jest miareczkowana do punktu końcowego. Zjawisko to jest spowodowane faktem, że podczas badania bardziej rozcieńczonych próbek niższe miana przeciwciał spadają poniżej czułości systemu. 3. Wiele różnych czynników zewnętrznych ma wpływ na wrażliwość testu, np. typ używanego mikroskopu f luorescencyj nego, m oc i wiek lampy, stosowane powiększenie, syst em f iltr ów oraz badacz. 4. Jeśli zamiast filtra barierowego 515 używany jest filtr środkowoprzepustowy, może wystąpić zwiększone zabarwienie artefaktowe. 5. Do opisywania preparatów należy stosować wyłącznie ołówek. Stosowanie innego przyrządu do pisania może spowodować zabarwienie artefaktowe. 6. Wszystkie barwiacze Coplina stosowane do płukania preparatów nie powinny zawierać żadnych pozostałości barwników. Używanie barwiaczy Coplina zawierających pozostałości barwników może spowodować zabarwienie artefaktowe. 7. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 8. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. 6

7 Preparaty sprzedawane oddzielnie są sklasyfikowane jako odczynniki swoiste wobec analitu. Z yjątkiem elementu zestawu NOVA Lite HEp-2 ANA, charakterystyka analityczna i wydajnościowa nie est ustalona. Spodziewane wartości Za pomocą zestawu NOVA Lite HEp-2 ANA przebadano pacjentów z różnymi chorobami tkanki łącznej oraz 200 losowo wybranych krwiodawców. Wyniki znajdują się poniżej: Grupa pacjentów Liczba zbadanych Liczba pozytywnych SLE Toczeń polekowy Reumatoidalne zapalenie stawów Twardzina Zapalenie skórno-mięśniowe Zespół Sjogrena Prawidłowe

8 Piśmiennictwo 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Gonzalez E and Rothfield N: Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. The New England Journal of Medicine 274: , Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiology Scand. 84: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks: POL Marzec 2012 Wersja 0 NOVA Lite i INOVA Diagnostics, Inc. są zastrzeżonymi znakami handlowymi. C op yr ight 2012 Wszelkie prawa zastrzeżone 8