ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M1551

Transkrypt

1 Sanquin Reagents Plesmanlaan 5 0 CX Amsterdam The Netherlands Phone: Fax: reagents@sanquin.nl Website: M55/ November 007 ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M55 Zestaw do ilościowego oznaczania podklas ludzkiej immunoglobuliny G w surowicy krwi metodą ELISA (pl) Ab BLACK BUF CAL CONJ CONTROL pl Przeciwciała skierowane przeciwko Czarne Bufor Surowica kalibracyjna Koniugat Surowica kontrolna DIL GREEN HRP HUM HO MOU pl Rozcieńczający Zielone HRP Ludzka Nadtlenek wodoru Mysie RED SEALS STOCK STOP SUB SUBS pl Czerwone Folie samoprzylepne Koncentrat Zatrzymujący reakcję Podklasy Substrat WASH WELL YELLOW pl Płuczący Studzienki Żółte Zakres ELISA REF PeliClass ELISA kit M800 x8 WELL aigg, aigg RED BLACK M80 x8 WELL aigg, aigg YELLOW GREEN M80 0. ml CAL M80 0. ml CONTROL M80 0. ml HRP MOU Ab HUM IgG CONJ M ml BUF WASH STOCK :0 M80 0 ml BUF DIL STOCK :0 M808 5 ml BUF SUBS STOCK :0 M80.0 ml ABTS STOCK :50 M ml HO STOCK :00 M807 0 ml BUF STOP SEALS

2 pl I. WSTĘP Ludzka immunoglobulina G (IgG) występuje w czterech podklasach: IgG, IgG, IgG oraz IgG. Biochemiczne właściwości podklas immunoglobuliny G zostały już szeroko opisane ( 5). Różnice między podklasami immunoglobuliny G przejawiają się w wielu ważnych funkcjach organizmu, takich jak rozpoznawanie antygenów, aktywacja dopełniacza czy wiązanie z receptorami na powierzchniach komórek. W toku licznych badań ustalono, iż nieprawidłowe stężenia określonych podklas immunoglobuliny G w surowicy krwi mogą wskazywać na różne stany chorobowe. Szczególnie obszernie udokumentowano związek między selektywnym niedoborem podklasy IgG a zwiększoną podatnością na infekcje wirusowe i bakteryjne ( 5). Niskie stężenia podklas IgG i IgG odnotowywano natomiast u pacjentów z nawracającymi infekcjami górnych i dolnych dróg oddechowych. W innych badaniach wykazano związek między bardzo niskimi stężeniami podklasy IgG a nawracającymi infekcjami zatokowopłucnymi (). Nieprawidłowe stężenia podklas IgG zaobserwowano także w przypadku chorób autoimmunologicznych, zaburzeń neurologicznych oraz infekcji wirusem HIV (). II. ZASADA DZIAŁANIA Zestaw PeliClass do oznaczania podklas ludzkiej immunoglobuliny G metodą ELISA służy do przeprowadzania testów immunoenzymatycznych typu sandwich. Składa się on z pasków z mikrostudzienkami pokrytymi wysoce reaktywnymi przeciwciałami monoklonalnymi, z których każde jest swoiste względem jednej podklasy ludzkiej immunoglobuliny G. Próbki badanego materiału oraz surowicy kalibracyjnej i kontrolnej inkubuje się w wyznaczonych studzienkach. Oznaczana podklasa immunoglobuliny G jest wiązana z fazą stałą, a niezwiązaną immunoglobulinę G usuwa się podczas przepłukiwania. Następnie do każdej studzienki dodaje się antysurowicę z przeciwciałem skierowanym przeciwko ludzkiej immunoglobulinie G, skoniugowaną z peroksydazą chrzanową, a niezwiązany koniugat usuwa się w ramach przepłukiwania. Po zainkubowaniu przy użyciu roztworu substratu (ABTS) oraz nadtlenku wodoru (HO) reakcję zatrzymuje się przy użyciu kwaśnego buforu. Na zakończenie ustala się absorbancję zielonego produktu reakcji i określa stężenie podklasy immunoglobuliny G w badanym materiale na podstawie wartości podanych na krzywej referencyjnej. W celu potwierdzenia wiarygodności krzywych kalibracyjnych oraz precyzyjności oznaczeń podklas immunoglobuliny G przeprowadza się reakcje przy użyciu surowicy kontrolnej z podklasami immunoglobuliny G. Stężenia podklas immunoglobuliny G w surowicy kalibracyjnej ustalono przy użyciu preparatu porównawczego otrzymanego zgodnie ze standardem nr 7/97 Światowej Organizacji Zdrowia. Zastosowano przy tym zalecane wartości docelowe wynoszące 5,0 g/l w przypadku podklasy IgG,, g/l w przypadku podklasy IgG, 0, g/l w przypadku podklasy IgG oraz 0,5 g/l w przypadku podklasy IgG (7). III. PRZECHOWYWANIE I UTRZYMYWANIE STABILNOŚCI Zestaw PeliClass do oznaczania podklas ludzkiej immunoglobuliny G należy przechowywać pionowo w temperaturze 8 C i zużyć przed upływem daty ważności widocznej na etykiecie. Wszystkie składniki zestawu pozostaną stabilne przez tydzień po otwarciu opakowania, pod warunkiem że będą przechowywane w temperaturze 8 C. Warunki panujące w trakcie transportu mogą się różnić od warunków przechowywania. IV. ZAWARTOŚĆ ZESTAWU Składniki zestawu wyszczególniono w tabeli na początku niniejszej ulotki. Zestaw PeliClass do oznaczania podklas ludzkiej immunoglobuliny G metodą ELISA zawiera odczynniki wystarczające do przeprowadzenia 8 oznaczeń każdej podklasy, w tym surowicę kalibracyjną i kontrolną oraz ślepe próbki. Przeciwciała monoklonalne oczyszczono z podłoża hodowli tkankowej przy zastosowaniu chromatografii kolumnowej (chromatografii jonowymiennej i powinowactwa). Surowice kalibracyjna i kontrolna są płynnymi surowicami ludzkimi. V. DODATKOWE WYMAGANE MATERIAŁY Woda destylowana do rozcieńczenia buforów płuczącego, rozcieńczającego i substratu Urządzenia pipetujące do precyzyjnego dozowania materiałów Inkubator (7 C ± C) Standardowa płuczka do oznaczeń wykonywanych metodą ELISA lub plastykowa tryskawka o pojemności 500 ml, do automatycznego lub ręcznego przepłukiwania pasków Standardowy czytnik do oznaczeń wykonywanych metodą ELISA, do obliczania absorbancji przy absorpcji fal o długości nm lub 05 nm Papier logarytmiczny z podziałką liniową VI. POSTĘPOWANIE Z BADANYM MATERIAŁEM Zestaw może być używany wyłącznie do badania próbek surowicy. Próbki powinny być jak najświeższe lub zamrożone aż do momentu użycia w ramach badania. Przed użyciem próbki należy ręcznie rozcieńczyć (patrz część Vll, PROTOKÓŁ TESTU). VII. PROTOKÓŁ TESTU Ogrzać wszystkie odczynniki tak, aby osiągnęły temperaturę pokojową (8 5 C), i dokładnie je wymieszać. Wyeliminować pęcherzyki powietrza i pianę. Przygotować podwójne (zalecenie) próbki wszystkich badanych materiałów oraz surowic kontrolnej i kalibracyjnej.. PŁYTKA DO MIKROMIARECZKOWANIA Zestaw PeliClass do oznaczania podklas ludzkiej immunoglobuliny G metodą ELISA umożliwia ograniczenie rozmiaru płytki wykorzystywanej podczas jednego testu. Przed otwarciem plastykowego opakowania należy określić liczbę pasków niezbędnych do zbadania wymaganej liczby próbek, przy czym należy uwzględnić studzienek przeznaczonych na zbadanie podwójnych próbek ślepych oraz podwójnych próbek surowic kalibracyjnej i kontrolnej. Paski, które nie będą używane, należy zdjąć z ramki, z powrotem umieścić w plastykowym opakowaniu zawierającym środek osuszający i przechowywać w temperaturze 8 C.. PRZYGOTOWYWANIE BUFORÓW Bufor płuczący: Bufor płuczący przygotowuje się, mieszając całą zawartość butelki z koncentratem buforu płuczącego z 950 ml wody destylowanej. Rozcieńczony bufor płuczący musi być przechowywany w temperaturze 8 C i w takich warunkach pozostaje stabilny przez tydzień.

3 Uwaga: Skoncentrowany bufor może zawierać kryształki soli. Przed przygotowaniem buforu o stężeniu wymaganym do przeprowadzenia testu skoncentrowany bufor należy poddać KRÓTKIEMU podgrzewaniu, tak aby osiągnął on temperaturę 7 C i by kryształki soli się rozpuściły. Bufor rozcieńczający: Należy obliczyć wymaganą ilość buforu rozcieńczającego (ok. ml nierozcieńczonego buforu na jeden pasek mikrostudzienek) i przygotować roztwór o stężeniu wymaganym do przeprowadzenia testu, rozcieńczając bufor wodą destylowaną w stosunku :0.. PRZYGOTOWYWANIE SUROWIC KALIBRACYJNEJ I KONTROLNEJ Informacje o stężeniach znajdują się w tabelach i w załączonej ulotce informacyjnej. Surowica kalibracyjna: (patrz tabela w załączonej ulotce informacyjnej) Należy oznaczyć jedną probówkę o pojemności 0 ml napisem :500 oraz osiem probówek o pojemności ml stosownymi napisami od Cal do Cal8. Za pomocą urządzenia pipetującego w probówce o pojemności 0 ml należy umieścić,99 ml buforu rozcieńczającego, a następnie należy dodać do niego 0 µl surowicy kalibracyjnej (wstępne rozcieńczenie :500). Za pomocą urządzenia pipetującego w probówce oznaczonej napisem Cal należy umieścić,9 ml buforu rozcieńczającego, a w probówkach oznaczonych napisami od Cal do Cal8 po,0 ml buforu rozcieńczającego. Za pomocą urządzenia pipetującego w probówce oznaczonej napisem Cal należy umieścić 00 µl surowicy kalibracyjnej rozcieńczonej w stosunku :500, a następnie należy dodać,0 ml zawartości tej probówki do buforu rozcieńczającego w probówce oznaczonej kolejnym numerem po napisie Cal i analogicznie każdorazowo wymieszać zawartość następnej probówki (aż do probówki oznaczonej napisem Cal8 ) z,0 ml zawartości poprzedniej probówki w kolejności. Do badania należy wybrać roztwory surowicy kalibracyjnej o stężeniach odpowiednich do oznaczanej podklasy IgG: w przypadku podklasy IgG powinny to być stężenia od : do : , a w przypadku podklas IgG, IgG oraz IgG powinny to być stężenia od :0 000 do : Surowica kontrolna: Należy oznaczyć jedną probówkę napisem :500 oraz dwie probówki o pojemności ml stosownymi napisami :0 000 (do oznaczenia podklas IgG, IgG oraz IgG) i :0 000 (do oznaczenia podklasy IgG). Za pomocą urządzenia pipetującego w probówce oznaczonej napisem :500 należy umieścić,99 ml buforu rozcieńczającego oraz 0 µl surowicy kontrolnej. Za pomocą urządzenia pipetującego w probówce oznaczonej napisem :0 000 należy umieścić 885 µl buforu rozcieńczającego oraz 5 µl surowicy kontrolnej rozcieńczonej w stosunku :500. Za pomocą urządzenia pipetującego w probówce oznaczonej napisem :0 000 należy umieścić 875 µl buforu rozcieńczającego oraz 5 µl surowicy kontrolnej rozcieńczonej w stosunku : Jedną probówkę o pojemności ml, przeznaczoną na materiał do ślepych próbek, należy wypełnić ml buforu rozcieńczającego.. PRZYGOTOWYWANIE PRÓBEK BADANEGO MATERIAŁU Próbki badanego materiału należy rozcieńczyć buforem rozcieńczającym w taki sam sposób, jak surowicę kontrolną. Wyniki badania niemieszczące się w podanych zakresach (patrz tabela w załączonej ulotce informacyjnej) stanowią wskazanie do powtórzenia testu przy użyciu innych stężeń badanego materiału. 5. PIERWSZE PRZEPŁUKIWANIE Wymagane mikrostudzienki umieszczone na ramce należy przepłukać cztery razy buforem płuczącym. W celu przeprowadzenia ręcznego przepłukiwania należy całkowicie napełnić studzienki (> 00 µl) buforem płuczącym, a następnie je z niego opróżnić; procedurę tę należy powtórzyć trzykrotnie. Po zakończeniu przepłukiwania studzienki powinny być całkowicie puste. Kolejne odczynniki należy nakładać natychmiast; studzienki nie mogą pozostawać zbyt długo suche.. PIERWSZA INKUBACJA W odpowiednich studzienkach należy umieścić po 00 µl rozcieńczonych surowic badanej, kalibracyjnej i kontrolnej, a także roztworu do ślepych próbek. Płytkę należy pokryć folią samoprzylepną i delikatnie nią potrząsnąć, poklepując jej krawędź przez kilka sekund, w celu wymieszania zawartości poszczególnych studzienek. Inkubacja próbek powinna trwać godzinę w temperaturze 7 C. Tuż przed kolejnym płukaniem należy przygotować następny odczynnik w celu przeprowadzenia inkubacji zgodnie z opisem w punkcie DRUGIE PRZEPŁUKIWANIE Należy zebrać nasącza ze studzienek i przepłukać płytkę zgodnie z opisem w punkcie INKUBACJA Z PRZECIWCIAŁEM SKIEROWANYM PRZECIWKO LUDZKIEJ IMMUNOGLOBULINIE G, SKONIUGOWANYM Z PEROKSYDAZĄ CHRZANOWĄ (HRP) Koniugat należy rozcieńczyć w stosunku :500 za pomocą urządzenia pipetującego, dodając 0 µl koniugatu do,97 ml buforu rozcieńczającego. Następnie należy jeszcze bardziej rozcieńczyć koniugat do uzyskania stosunku: :000, dodając, ml koniugatu rozcieńczonego w stosunku :500 do,0 ml buforu rozcieńczającego. :000, dodając,0 ml koniugatu rozcieńczonego w stosunku :500 do,0 ml buforu rozcieńczającego. :000, dodając,5 ml koniugatu rozcieńczonego w stosunku :500 do,5 ml buforu rozcieńczającego. Następnie należy umieścić: 00 µl koniugatu rozcieńczonego w stosunku :500 w antyigg paski microwell. 00 µl koniugatu rozcieńczonego w stosunku :000 w antyigg paski microwell. 00 µl koniugatu rozcieńczonego w stosunku :000 w antyigg paski microwell. 00 µl koniugatu rozcieńczonego w stosunku :000 w antyigg paski microwell Płytkę należy pokryć folią samoprzylepną i delikatnie nią potrząsnąć, poklepując jej krawędź przez kilka sekund, w celu wymieszania zawartości poszczególnych studzienek. Inkubacja próbek powinna trwać godzinę w temperaturze 7 C. Tuż przed kolejnym płukaniem należy przygotować następny odczynnik w celu przeprowadzenia inkubacji zgodnie z opisem w punkcie TRZECIE PRZEPŁUKIWANIE Należy zebrać nasącza ze studzienek i przepłukać płytkę zgodnie z opisem w punkcie INKUBACJA Z SUBSTRATEM (ABTS) Należy obliczyć wymaganą ilość roztworu substratu (w przybliżeniu 0,9 ml na jeden pasek mikrostudzienek). Do 0 ml buforu substratu o stężeniu wymaganym do przeprowadzenia testu ( ml koncentratu substratu na 8 ml wody destylowanej) należy dodać 00 µl roztworu nadtlenku wodoru i 00 µl roztworu ABTS; w przypadku innej ilości buforu substratu należy obliczyć odpowiednie objętości dodawanych roztworów. We wszystkich studzienkach należy umieścić po 00 µl roztworu substratu. Następnie należy delikatnie potrząsnąć płytką, poklepując jej krawędź przez kilka sekund, w celu wymieszania zawartości poszczególnych studzienek. Inkubacja powinna trwać 0 minut w temperaturze pokojowej (8 5 C).. ZATRZYMYWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNEJ Dodać 50 µl roztworu zatrzymującego do wszystkich pasków microwell.

4 . ODCZYT Z PŁYTKI Wyniki testu w zakresie fal o długości nm (zalecenie) lub 05 nm należy odczytać z czytnika do oznaczeń wykonywanych metodą ELISA w ciągu godziny. VIII. WYNIKI I INTERPRETACJA DANYCH Należy zarejestrować odpowiadające poszczególnym studzienkom wartości absorbancji w zakresie fal o długości nm (zalecenie) lub 05 nm i uśrednić wartości z podwójnych próbek. Wartości odpowiadające próbkom tego samego materiału nie powinny odbiegać od wartości uśrednionej o więcej niż 5%. Jeśli jest inaczej, test należy powtórzyć. Na papierze logarytmicznym z podziałką liniową sporządzić wykres zależności średnich wartości absorbancji surowicy kalibracyjnej (oś y) od wartości stężeń (w ng/ml) powiązanej podklasy (oś x), rysując przy tym jak najbardziej dopasowaną krzywą. Stężenia podklas IgG w surowicy kontrolnej powinny się mieścić w zakresach podanych w tabeli w załączonej ulotce informacyjnej. Nanieść średnie wartości absorbancji poszczególnych próbek na krzywą referencyjną. Próbki badanego materiału, w przypadku których wartości absorbancji nie mieszczą się w zakresie podanym na krzywej referencyjnej, należy odpowiednio rozcieńczyć. W celu oceny stężenia podklasy IgG w badanym materiale należy porównać otrzymane wartości z prawidłowymi wartościami stężeń podklas IgG (patrz część X, ZAKRESY REFERENCYJNE). IX. ZAKRESY OBOWIĄZUJĄCE W TRAKCIE TESTU Informacje o zakresach wartości obowiązujących w trakcie testu znajdują się w tabeli w załączonej ulotce informacyjnej. X. ZAKRESY REFERENCYJNE Podane wartości stanowią zakresy referencyjne stężeń podklas IgG w surowicy krwi (w g/l) zdrowych osób rasy białej (8). W przypadku innych populacji obowiązują inne zakresy referencyjne. Wiek IgG IgG IgG IgG 0 ½ 9 > ½ miesiąc miesiące miesięcy miesięcy roku, 0,,8,7,8 7,0,0 7,7,5 8,,9 8,5, 9,0,5 9.,7 0,0,0 0,8,0,5,7,8,9, 0,87, 0,8, 0,, 0,, 0,8, 0,5, 0,5,8 0,,0 0,7, 0,85, 0,98,8,0,,50, 0, 0,55 0, 0,70 0,5 0,80 0,5 0,97 0,5,07 0,5, 0,,0 0,, 0,, 0,, 0,5,9 0,8, 0,0,0 0,0 0,5 <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0,79 <0,0,0 <0,0,7 <0,0,58 <0,0,89 0,0,0 0,0,0 0,08,0 XI. a SWOISTA CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA TESTU Powtarzalność Stężenie podklasy IgG IgG IgG IgG IgG Zmienność wewnątrzseryjna (%) Zmienność międzyseryjna (%) 7 7 b Porównanie wyników działania zestawu PeliClass do oznaczania podklas ludzkiej immunoglobuliny G z wynikami odczynów Manciniego Stężenia podklas IgG, IgG, IgG oraz IgG w surowicy krwi określono w ramach testu wykonanego metodą ELISA i porównano z odpowiednimi wartościami uzyskanymi w ramach testu wykonanego metodą Manciniego. Ustalono następujące współzależności: Podklasa IgG Prosta regresji liniowej Zależność IgG Y = 0,90X 0,9 0,97 IgG Y =,0X 0,7 0,9 IgG Y = 0,9X + 0,00 0,99 IgG Y = 0,9X 0,0 0,98 Uwaga: Wartości przytoczone w ramach swoistej charakterystyki działania testu stanowią typowe wyniki jego działania, lecz nie stanowią danych technicznych zestawu.

5 XII. OGRANICZENIA. Użytkownik powinien być zaznajomiony z metodą ELISA i procedurą przeprowadzania testów tą metodą oraz powinien być przeszkolony w zakresie przeprowadzania testów tą metodą.. Zestawu nie można używać do badania surowicy mocno zhemolizowanej lub z nadmiarem lipidów. W przypadku próbek, które zawierają czynnik reumatoidalny lub inny krążący kompleks immunologiczny albo charakteryzują się wysokimi stężeniami bilirubiny, wyniki testu mogą być niemiarodajne. Takie próbki należy zbadać inną metodą.. W razie uzyskania wyników niemieszczących się w podanych zakresach, np. w przypadku występowania paraprotein, materiał należy zbadać ponownie, stosując inne stężenia.. Stwierdzenie obniżonego stężenia jednej podklasy IgG nie może w żadnym wypadku stanowić podstawy do ostatecznej diagnozy. Obniżenie takie prawdopodobnie oznacza jednak zaburzenia w działaniu układu odpornościowego i stanowi wskazanie do dalszych badań diagnostycznych. 5. Wiarygodność krzywych kalibracyjnych należy zawsze sprawdzać przy użyciu surowicy kontrolnej. Jeśli wyniki analizy surowicy kontrolnej nie mieszczą się w podanych zakresach, wyniki analizy badanego materiału nie są wiarygodne. W takim wypadku test należy powtórzyć.. Nie można łączyć ze sobą odczynników z różnych partii produkcyjnych. 7. Pozostałości odczynników (np. objętości martwych) nie wolno mieszać z zawartością nowo otwartych fiolek. 8. Nie wolno pomieszać zatyczek fiolek. Do zamykania poszczególnych fiolek należy używać odpowiednich zatyczek. 9. Chociaż surowice kalibracyjną i kontrolną przetestowano pod kątem markerów swoistych czynników chorobotwórczych zgodnie z aktualnymi wytycznymi Unii Europejskiej dotyczącymi Dobrej Praktyki Wytwarzania (Good Manufacturing Practice) i stwierdzono ich niereaktywność w zakresie tych markerów, wszystkie składniki zestawu ludzkiego pochodzenia należy uważać za potencjalnie zakaźne. 0. Konserwant: Thiomersal 0,00%.. Aby uniknąć zakażenia krzyżowego, wszystkie etapy oznaczania wykonywanego metodą ELISA obejmujące inkubację/opłaszczanie należy przeprowadzać przy użyciu nowych folii samoprzylepnych. Nie należy stosować folii aluminiowej.. Aby uniknąć zakażenia krzyżowego, należy używać jednorazowych końcówek pipet.. Każde oddzielne zastosowanie zestawu wymaga sporządzenia nowych roztworów surowicy kalibracyjnej, koniugatu i buforów.. Wolno używać wyłącznie odczynników i pasków do mikromiareczkowania znajdujących się w zestawie. 5. Azydek sodu dezaktywuje peroksydazę chrzanową, nie wolno stosować roztworów zawierających azydek sodu ani dodawać azydku sodu do buforów znajdujących się w zestawie.. Zużyte materiały należy zutylizować zgodnie z regulaminem obowiązującym w laboratorium. XIII. PIŚMIENNICTWO. Shakib, F. (Editor), Monograph in Allergy, Karger A.G., 9 (98).. Shakib, F. (Editor), The human IgG subclass, Pergamon Press (990).. Vlug, A. et al., Eur. Clin. lab., 8: (989).. Jefferis, R. et al Clin.Exp.Immunol. 8:57 (990). 5. Hamilton, R.C., Clin. Chem., :707 (987).. Beck, C.S. and Heiner, D.C., Am. Rev. Respir. Dis., :9 (98). 7. Klein, F et al., Clin. Chem. Acta., 50 9 (985). 8. Vlug, A. et al., Ann. Biol. Clin. 5:57 (99). 5