QUANTA Lite RNA Pol III Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite RNA Pol III Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite TM RNA Pol III ELISA to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowej detekcji przeciwciał IgG przeciw polimerazie RNA III w surowicach pacjentów. Obecność tych przeciwciał można użyć w połączeniu z wynikami klinicznymi i innymi testami laboratoryjnymi do wspomagania diagnozy twardziny układowej (twardziny skóry) ze zwiększonym objęciem skóry oraz przełomem nerkowym. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Autoprzeciwciała przeciw antygenowi RNA Pol III występują u 11% do 23% pacjentów z twardziną układową. 1-8 Pacjenci z pozytywnym wynikiem przeciwciał RNA Pol III nie mają innych przeciwciał zazwyczaj występujących u pacjentów z twardziną układową, jak przeciwciała przeciwcentromerowe, anty-scl-70 lub anty-pm/scl. 6 Dlatego stanowią oni odrębną grupę serologiczną. Liczne badania wykazały, że u takich pacjentów występuje zwiększone ryzyko rozproszonej postaci skórnej twardziny skóry oraz wysokie prawdopodobieństwo objęcia skóry i nadciśnieniowej choroby nerek. 1-8 U pacjentów z twardziną układową występują przeciwciała przeciw kilku różnym rodzajom polimeraz RNA. 4,5 Zidentyfikowano i sklonowano immunodominujący epitop na RNA Pol III. 3 Rekombinowany immunodominujący epitop RNA Pol III może zostać użyty w teście ELISA o wysokiej swoistości do wykrywania przeciwciał anty-rna Pol III u pacjentów z rozproszoną postacią skórną twardziny układowej i wysoką częstością zajęcia skóry. 1 Zasada badania Oczyszczony rekombinowany fragment immunodominującego antygenu RNA Pol III jest wiązany w dołkach polistyrenowej płytki z mikrodołkami. Wstępnie rozcieńczone kontrole oraz surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków umożliwiając związanie wszelkich występujących przeciwciał anty-rna Pol III z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowe płytki z mikrodołkami ELISA pokryte oczyszczonym antygenem RNA Pol III (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna testu ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez przeciwciał ludzkich skierowanych przeciwko RNA Pol III, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia 1,2 ml 3. Kontrola niska pozytywna testu ELISA RNA Pol III, 1 fiolka buforu zawierającego środek konserwujący oraz przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko RNA Pol III, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia, 1,2 ml 4. Kontrola wysoka pozytywna testu ELISA RNA Pol III, 1 fiolka buforu zawierającego środek konserwujący oraz przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko RNA Pol III, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego powodu kontrola niska pozytywna testu ELISA RNA Pol III, kontrola wysoka pozytywna testu ELISA RNA Pol III i kontrola negatywna testu ELISA powinny być oznaczane w taki sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny. 9 1

2 3. Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/ dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. 10 2

3 Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami testu ELISA RNA Pol III (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej i gotowej do użycia kontroli negatywnej testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej i gotowej do użycia kontroli niskiej pozytywnej testu ELISA RNA Pol III 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej i gotowej do użycia kontroli wysokiej pozytywnej testu ELISA RNA Pol III 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20 26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ kontroli niskiej pozytywnej kontroli niskiej testu ELISA RNA Pol III, kontroli wysokiej pozytywnej testu ELISA RNA Pol III i kontroli negatywnej testu ELISA. 4. Oznaczenie obecności lub braku przeciwciał anty-rna Pol III z wykorzystaniem jednostek dowolnych wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli lub jednego bądź dwóch dołków dla każdej próbki pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Dodać do dołków 100 µl wstępnie rozcieńczonej kontroli niskiej pozytywnej testu ELISA RNA Pol III, kontroli wysokiej pozytywnej testu ELISA RNA Pol III, kontroli negatywnej testu ELISA oraz rozcieńczonych próbek pacjenta. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. 3

4 Kontrola jakości 1. Z każdą serią próbek należy oznaczać kontrolę niską pozytywną testu ELISA RNA Pol III, kontrolę wysoką pozytywną testu ELISA RNA Pol III i kontrolę negatywną testu ELISA, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury są prawidłowe 2. Proszę zwrócić uwagę, że ponieważ kontrola niska pozytywna testu ELISA RNA Pol III, kontrola wysoka pozytywna testu ELISA RNA Pol III oraz kontrola negatywna testu ELISA są wstępnie rozcieńczone, nie kontrolują one metod proceduralnych związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli wysokiej pozytywnej testu ELISA RNA Pol III musi być wyższa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej kontroli niskiej pozytywnej testu ELISA RNA Pol III, która musi być wyższa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA. b. Wstępnie rozcieńczona kontrola wysoka pozytywna testu ELISA RNA Pol III musi mieć absorbancję wyższą niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej nie może przekraczać 0,2. c. Absorbancja kontroli niskiej pozytywnej testu ELISA RNA Pol III musi być przynajmniej dwukrotnie wyższa niż kontroli negatywnej testu ELISA lub przekraczać 0,25. d. Kontrola negatywna testu ELISA oraz kontrola wysoka pozytywna testu ELISA RNA Pol III mają monitorować występowanie poważnych nieprawidłowości związanych z odczynnikami. Kontrola wysoka pozytywna testu ELISA RNA Pol III nie zapewni precyzji na poziomie wartości granicznej testu. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QA można znaleźć w dokumencie CLSI (NCCLS) C24-A3. 11 Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność dla każdej próbki można następnie obliczyć dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną kontroli niskiej pozytywnej testu ELISA RNA Pol III. Wynik jest mnożony przez liczbę jednostek przypisanych do kontroli niskiej pozytywnej testu ELISA RNA Pol III występującej na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x kontrola niska pozytywna testu ELISA RNA Pol III (jednostki) Gęstość optyczna kontroli niskiej (jednostki) pozytywnej testu ELISA RNA Pol III Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić seryjne badanie próbek otrzymanych od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, średnio pozytywna lub silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywna <20 Słabo pozytywna Średnio pozytywna Silnie pozytywna >80 1. Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał RNA Pol III i sugeruje możliwość występowania twardziny układowej (SSc). 2. Wynik negatywny wskazuje brak przeciwciał RNA Pol III lub ich poziom poniżej wartości granicznej testu. 4

5 Ograniczenia badania 1. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu. 2. Nie wszyscy pacjenci z twardziną układową mają wyniki pozytywne RNA Pol III. Badania immunoprecypitacji i ELISA wykazały, że tylko 11% do 23% pacjentów z twardziną układową ma przeciwciała RNA Pol III. 3. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 4. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Zdolność testu ELISA QUANTA Lite RNA Pol III do wykrywania przeciwciał anty-rna Pol III oceniano przeprowadzając szereg badań z udziałem pacjentów zdefiniowanych klinicznie i porównując dostępne w handlu testy ELISA polimerazy RNA III. Porównanie wyników z piśmiennictwa oraz testu ELISA QUANTA Lite RNA Pol III, patrz tabela poniżej. Tabela 1. Występowanie przeciwciał anty-rna Pol III w różnych chorobach Piśmiennictwo 1,2,5 8 INOVA RNA Pol III ELISA Liczba pozyt. anty- RNA Pol III Liczba pozyt. anty- RNA Pol III Choroba Liczba łącznie % Pozyt. Liczba łącznie % Pozyt. Wszystkie SSc 1,2, % % SLE 1, % % MCTD % ND PM/DM % ND RA % % Pierwotna SSc % ND UCTD 2, % ND NBD 1,2, % ,4% Nucleolar % ND ID ND % Wszystkie kontrole % % Skróty: Pozyt.=Pozytywny; SSc=twardzina układowa; SLE=liszaj rumieniowaty układowy; MCTD=mieszana choroba tkanki łącznej; PM/DM=zapalenie wielomięśniowe/zapalenie skórno-mięśniowe; RA=reumatoidalne zapalenie stawów; UCTD=nieokreślone zaburzenie tkanki łącznej; NBD=zdrowy krwiodawca; Nucleolar=jąderkowy wzorzec immunofluorescencyjny; ID=choroba zakaźna. Źródła 1 i 5 stosowały ELISA, 2 stosowało Western blot, a 6, 7 i 8 stosowały radioimmunoprecypitację. Tabela 2. Występowanie objawów u pacjentów mających pozytywne wyniki dla anty-rna Pol III Liczba pozyt. Liczba % Liczba % Liczba % anty-rna Pol III rozproszonych skórnych ograniczonych lub nakładających się przełomów nerkowych % 55 17% 86 27% Ze źródeł 1, 2, 5 8. Normalny zakres Pięćset dwadzieścia siedem losowych krwiodawców mieszkających na terenie USA zbadano pod kątem występowania przeciwciał przeciw RNA Pol III. Tylko 2 próbki (0,4%) przekraczały 20-jednostkową wartość graniczną z wynikami 27 i 39 jednostek. Średnia wartość tych 527 próbek wyniosła 3,4 jednostki. Standardowe odchylenie próbek wyniosło 2,6 jednostki. Średnia wartość wynosi 6,4 standardowych odchyleń poniżej 20-jednostkowej wartości granicznej. Specyficzna charakterystyka wyników Porównanie z urządzeniami predykatowymi Łącznie pięćdziesiąt jeden próbek zbadano w dwóch laboratoriach klinicznych stosując zarówno test ELISA INOVA QUANTA Lite TM RNA Pol III oraz dostępne w handlu testy ELISA polimerazy RNA III. Wyniki te przedstawiono poniżej. N = 51 Dostępny w handlu test ELISA przeciwciał anty-polimeraza RNA III. INOVA QUANTA Lite Pozyt. Negat. RNA Pol III Pozyt Negat Procentowa zgodność wyników pozytywnych: 32/34 (94%; 95% CI=80 99%) Procentowa zgodność wyników negatywnych: 17/17 (100%; 95% CI=80 100%) Ogólna zgodność: 49/51 (96%) 5

6 Badania kliniczne Wykonywano dwa rodzaje badań klinicznych. W jednym badaniu 1319 pacjentów z twardziną układową oraz 37 zdrowych krwiodawców badanych pod kątem anty-rna Pol III metodą radioimmunoprecypitacji (RIP) zbadano za pomocą testu ELISA QUANTA Lite RNA Pol III. Test ELISA wykazywał 96% zgodność pozytywną i 98% zgodność negatywną w porównaniu z oznaczeniem radioimmunoprecypitacyjnym. Procent zgodności pozytywnych i negatywnej testu ELISA RNA Pol III w porównaniu z RIP Wszystkie próbki N=1356 RNA Pol III metodą RIP % zgodności pozytywnej (95% CI) % zgodności negatywnej (95% CI) Zgodność = 97,5% + - RNA Pol III metodą * 96% (93-98%) ELISA - 14** % (97-99%) * U wszystkich 20 z nich rozpoznano SSc **U wszystkich 14 z nich rozpoznano SSc Dodatkowe 418 pacjentów oraz 629 krwiodawców lub osób z chorobami zakaźnymi lub autoimmunologicznymi zbadano wyłącznie za pomocą testu ELISA QUANTA Lite RNA Pol III w celu uzyskania danych do obliczenia czułości i swoistości klinicznej. Czułość i swoistość kliniczna testu ELISA QUANTA Lite anty-rna Pol III RNA Pol III Swoistość kliniczna Czułość kliniczna N=2403 metodą ELISA (95% CI) + - Wszystkie kontrole N = % (98,5-99,8%) Wszystkie SSc N = % (20,7-24,7%) Swoistość kliniczna dla testu ELISA RNA Pol III wynosi ponad 99%. Czułość kliniczna wynosi 23% zapewniając dobrą zgodność z opublikowanym piśmiennictwem. Reaktywność krzyżowa W celu oceny potencjalnych problemów związanych z reaktywnością krzyżową z innymi autoprzeciwciałami, za pomocą testu ELISA Lite TM RNA Pol III oznaczono szereg próbek o wysokim mianie autoprzeciwciał. Obejmowały one SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, chromatynę, Ribo-P, CCP i różne choroby zakaźne. Nie było dowodów żadnej reaktywności krzyżowej. Precyzja i powtarzalność Wydajność w obrębie badania testu ELISA QUANTA Lite TM RNA Pol III oceniano testując 9 próbek po 9 razy każdą na 2 seriach zestawów. Poniżej zostały przedstawione wyniki reprezentatywne. Wydajność w obrębie badania testu ELISA QUANTA Lite TM RNA Pol III P2 P3 P4 P5 MP773 int 148 Średnia 22 U 31 U 26 U 90 U 58 U 2 U SD 0,7 1,3 0,6 1,5 1,5 0,1 CV % 3% 4% 2% 2% 3% 5% Zmienność między badaniami oceniono testując przynajmniej 12 próbek na 2 seriach zestawów w przynajmniej 5 różnych oznaczeniach. Poniżej zostały przedstawione wyniki reprezentatywne. Wydajność między badaniami testu ELISA QUANTA Lite TM RNA Pol III P2 P3 P4 P5 MP773 int 148 Średnia 23 U 32 U 27 U 91 U 62 U 3 U SD 0,5 1,6 1,2 3,5 1,4 0,2 CV % 2% 5% 4% 4% 2% 5% 6

7 Piśmiennictwo 1. Kuwana M, et al.: Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of anti-rna polymerase III antibody: analytical accuracy and clinical associations in systemic sclerosis. Arthritis Rheum 52: , Okano Y, Steen VD, Medsger Jr.TA: Autoantibody reactive with RNA polymerase III in systemic sclerosis. Ann Intern Med 119: , Kuwana M, Kimura K, Kawakami Y.: Identification of an immunodominant epitope on RNA polymerase III recognized by systemic sclerosis sera: application to enzyme-linked immunosorbent assay. Arthritis Rheum 46: , Steen VD and Medsger TA:. Long term outcomes of scleroderma renal crisis. Ann Intern Med 133: , Chang M, et al.: Analysis of autoantibodies against RNA polymerases using immunoaffinitypurifed RNA polymerase I, II, and III antigen in an enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Immunol Immunopathol. 19: 71-78, Bunn CC, et al.: Anti-RNA polymerases and other autoantibody specificities in systemic sclerosis. Br J Rheumatol. 37: 15-20, Harvey GR, et al.: Clinical and serological associations with anti-rna polymerase antibodies in systemic sclerosis. Clin Exp Immunol 117: , Meyer OC, et al.: Disease subsets, antinuclear antibody profile, and clinical features in 127 French and 247 US adult patients with systemic sclerosis. J Rheumatol 34: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, 2007 Fifth Edition. 10. CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24 (38), CLSI (NCCLS). Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures: Principles and Definitions; Approved Guideline- 3 rd edition NCCLS Document C24-A3, Vol. 26 (25),

8 QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Marzec 2011 Wersja 0 8