NOVA Lite ANCA Cytoplazmatyczne Odczynniki do oznaczania cytoplazmatycznych autoprzeciwciał antyneutrofilowych Do diagnostyki in vitro

Transkrypt

1 NOVA Lite ANCA Cytoplazmatyczne Odczynniki do oznaczania cytoplazmatycznych autoprzeciwciał antyneutrofilowych Do diagnostyki in vitro Kody produktów: , , , , , , Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie NOVA Lite ANCA jest pośrednim immunofluorescencyjnym badaniem przesiewowym oraz pół-ilościowego oznaczania przeciwciał przeciwko cytoplaźmie neutrofilów (ANCA) w ludzkiej surowicy. Obecność przeciwciał przeciwko cytoplaźmie neutrofilów może być wykorzystane w połączeniu z innymi wynikami badań serologicznych oraz objawów klinicznych w odniesieniu do pomocy w ocenie różnych układowych zapaleń naczyń. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Badanie w kierunku obecności przeciwciał przeciwko cytoplaźmie neutrofilów (ANCA) zrewolucjonizowało diagnostykę i leczenie różnych powstałych na tle zaburzeń autoimmunologicznych zapaleń naczyń. 1-4 Autoprzeciwciała okołojądrowe lub panca oraz autoprzeciwciała cytoplazmatyczne lub canca okazały się być przydatne do wykrywania takich chorób jak ziarniniak Wegenera i kłębkowe zapalenie nerek z tworzeniem półksiężyców. Istnieje co najmniej sześć określonych antygenów ANCA i wiele z nich jest niezidentyfikowanych. 1,5 Większość tych antygenów wydaje się być enzymami przebywającymi w pierwotnych ziarnistościach neutrofilów. Enzymy te obejmują mieloperoksydazę (MPO), proteazę seryny 3 (PR3), elastazę, laktoferynę, katepsynę G i białko kationowe 57 (CAP-57). Badania ELISA, które zostały opracowane do wykrywania wielu ważnych przeciwciał przeciwko neutrofilom. Większość ekspertów w dziedzinie autoimmunologicznego zapalenia naczyń nadal zaleca testu immunofluorescencji (IFA) jako sposób, który może być wykorzystywany jako wstępne badanie przesiewowe. Dwa wzorce ANCA są wykrywalne przy użyciu standardowej procedury ANCA IFA. Klasyczny wzór ANCA pojawia się jako ziarnista, fluorescencja cytoplazmy. Ten wzór, sugerując w ziarniniaka Wegenera oraz w mniejszym stopniu mikroskopowe zapalenie, został wyznaczony canca. 6 Drugi wzór ANCA został opisany 7,8 który barwi okołojądrowy obszar neutrofilów utrwalonych w alkoholu. Ten wzór został wyznaczony panca. Wzór panca jest związany z bardziej ograniczonym do narządów zapaleniem naczyń, a zwłaszcza z kłębuszkowym szybko postępującym zapaleniem nerek z tworzeniem półksiężyców. 9 Korelacja canca i ziarniniaka Wegenera została ustalona. 3,10 Ziarniniak Wegenera cechuje się martwiczym procesem zapalnym z tworzeniem ziarniniaków i zapaleniem naczyń, które pierwotnie obejmuje górne i dolne drogi oddechowe oraz nerki. Ta triada kliniczna uważana jest za cechę charakterystyczną ziarniniaka Wegenera. canca jest obecny nawet u 96% pacjentów z ziarniniakiem Wegenera z aktywnym uogólnionym schorzeniem, ale zmniejsza się do 65% w aktywnych ograniczonych postaciach choroby i występuje u 30-40% chorych w okresie remisji. Miano canca pozwala na monitorowanie miana choroby, przy czym miano zmniejsza się przy remisji choroby, rosnąc przy nawrocie schorzenia. 4,12 W przeciwieństwie do canca i jego związek z chorobą ogólnoustrojową, głównie ziarniniakiem Wegenera, panca często wiąże się z martwicze zapalenie kłębuszków nerkowych. panca nie jest typowe dla systemowego zespołów. Najczęściej docelowym antygenem związanym z panca jest MPO, ale wykryto także reaktywność elastazy i laktoferyny. Prawie 90% surowic panca pozytywnych pacjentów z kłębuszkowym zapaleniem nerek reagują z mieloperoksydazą, jednak u pacjentów z chorobami innymi niż zapalenie kłębuszków nerkowych, które również mają panca dużo mniejszy odsetek reaguje z mieloperoksydazą. 11,13 Oznaczałoby to, że wiele antygenów jest wykrywanych jako barwienie okołojądrowe utrwalanych alkoholem neutrofili, w tym surowice, które zawierają przeciwciała przeciwjądrowe. Możliwe jest potwierdzenie wzorów okołojądrowych wykrywanych w utrwalanych alkoholem neutrofilach jako panca wykonując IFA na neutrofilach utrwalonych w formalinie. Głównym cel antygenu panca, mieloperoksydazy, pozostaje w cytoplazmie komórek utrwalonych w formalinie, podczas gdy w komórkach utrwalonych etanolem antygenu migruje do jądra powodując wystąpienie wzoru okołojądrowego. Zasada badania W przypadku pośredniej techniki immunofluorescencji próbki są inkubowane z substratem antygenu, a przeciwciała, które nie weszły w reakcję, są wypłukiwane Substrat jest inkubowany ze swoistym koniugatem znakowanym fluoresceiną, a następnie niezwiązany odczynnik jest wypłukiwany. Próbki zawierające autoprzeciwciała obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym będą wykazywać jasnozieloną fluorescencyjną barwę w miejscach komórki lub jądra, gdzie nastąpiło związanie autoprzeciwciał. Odczynniki 1. Preparaty ANCA, utrwalonych alkoholem ludzkich substratów neutrofili, 6 lub 12 dołków/preparatów z osuszaczem 1

2 Tylko zestawy 2. Koniugat IgG przeciw-ludzkich (kozi), znakowany fluoresceiną w buforze zawierającym błękit Evansa i 0,09% azydku sodu 3. canca pozytywne, 1 fiolka buforu zawierającego 0,09% azydku sodu i ludzkie przeciwciała w surowicy przeciwko canca, wstępnie rozcieńczone 4. panca pozytywne, 1 fiolka buforu zawierającego 0,09% azydku sodu i ludzkie przeciwciała w surowicy przeciwko panca, wstępnie rozcieńczone 5. Negatywna kontrola systemu IFA, 1 fiolka buforu zawierającego 0,09% azydku sodu i ludzkie przeciwciała w surowicy przeciwko ANCA, wstępnie rozcieńczone 6. Koncentrat PBS II (40x) 7. Środek do osadzania preparatu, azydek sodu 0,09% 8. Szkiełka nakrywkowe Ostrzeżenia 1. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Dlatego system kontroli pozytywnej, canca pozytywny oraz systemy negatywnej kontroli IFA powinny być traktowane w taki sam sposób jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 3. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 4. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niekompletne lub nieskuteczne wypłukanie dołków IFA może spowodować wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, moc lampy używanego mikroskopu, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Z czasem koniugat IgG przeciw-ludzkiej może zmienić kolor z powodu ekspozycji na światło. Jednak zmiana barwy nie ma wpływu na wynik badania. 7. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. Warunki przechowywania 1. Przechowywać wszystkie odczynniki zestawu w temperaturze 2-8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Rozcieńczony bufor do płukania jest stabilny przez 4 tygodnie w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (uprzednio NCCLS) H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeżeli test nie zostanie zakończony w ciągu 8 godzin, próbki należy przechowywać w lodówce w temperaturze 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. 2

3 Badanie Dostarczone materiały (zestawy) dołkowe płytki ANCA substratu ludzkich neutrofili utrwalonych w etanolu 1 4ml FITC koniugat przeciwko-ludzkiej IgG 1 0,5 ml canca Pozytywne 1 0,5 ml panca, pozytywny 1 0,5 ml negatywna kontrola systemu IFA 1 25 ml koncentrat PBS II (40x) 1 7 ml środek do osadzania preparatu 1 10 szkiełek nakrywkowych dołkowe płytki ANCA substratu ludzkich neutrofili utrwalonych w etanolu 1 15 ml FITC koniugat przeciwko-ludzkiej IgG 1 0,5 ml canca Pozytywne 1 0,5 ml panca Pozytywne 1 0,5 ml negatywna kontrola systemu IFA 2 25 ml koncentrat PBS II (40x) 1 7 ml środek do osadzania preparatu 1 20 szkiełek nakrywkowych dołkowe płytki ANCA substratu ludzkich neutrofili utrwalonych w etanolu 1 15 ml FITC koniugat przeciwko-ludzkiej IgG 1 0,5 ml canca Pozytywne 1 0,5 ml panca Pozytywne 1 0,5 ml negatywna kontrola systemu IFA 2 25 ml koncentrat PBS II (40x) 1 7 ml środek do osadzania preparatu 1 20 szkiełek nakrywkowych dołkowe płytki ANCA substratu ludzkich neutrofili utrwalonych w etanolu 1 4 ml FITC koniugat przeciwko-ludzkiej IgG 1 0,5 ml canca Pozytywne 1 0,5 ml panca Pozytywne 1 0,5 ml negatywna kontrola systemu IFA 1 25 ml koncentrat PBS II (40x) 1 7 ml środek do osadzania preparatu 1 10 szkiełek nakrywkowych Dostarczone materiały (preparaty) x płytek ANCA substratu ludzkich neutrofili utrwalonych w etanolu (6 dołków) ,20 20 x płytek ANCA substratu ludzkich neutrofili utrwalonych w etanolu (12 dołków) ,20 20 x płytek ANCA substratu ludzkich neutrofili utrwalonych w etanolu (12 dołków) ,10 10 x płytek ANCA substratu ludzkich neutrofili utrwalonych w etanolu (6 dołków) Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety o pojemności µL Woda destylowana lub dejonizowana Gruszki laboratoryjne lub pipety Pasteura Komora wilgotna Pojemnik 1 l (do rozcieńczania PBS II) Barwiacz Coplina Mikroskop fluorescencyjny z filtrem wzbudzającym 495 nm i filtrem barierowym 515 nm Materiały dodatkowe dostępne osobno ANCA (utrwalone w formalinie ludzkie neutrofile) preparat 6 dołkowy, Katalog nr INOVA ANCA (utrwalone w formalinie ludzkie neutrofile) preparat 12 dołkowy, Katalog nr INOVA Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat PBS II: WAŻNE: Rozcieńczyć koncentrat PBS II w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu PBS do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej i dokładnie wymieszać. Bufor PBS jest używany do rozcieńczania próbek pacjentów oraz jako bufor do płukania. Rozcieńczony bufor może być przechowywany maksymalnie przez 4 tygodnie w temperaturze 2-8 C. 3

4 3. Rozcieńczyć próbki pobrane od pacjenta: a. Wstępne badanie przesiewowe: Rozcieńczyć próbki pochodzące od pacjenta w stosunku 1:20 rozcieńczonym buforem PBS (IItj. dodać 50 µl surowicy do 950 µl buforu PBS II). b. Miareczkowanie: Z początkowego rozcieńczenia przesiewowego dla wszystkich próbek pozytywnych wykonać serię 2-krotnych rozcieńczeń za pomocą rozcieńczonego buforu PBS II(tj. 1:40, 1:80,... 1:1280). Procedura badania 1. Przygotować preparat substratu: Preparaty substratu przed wyjęciem z woreczka muszą osiągnąć temperaturę pokojową. Oznaczyć ołówkiem i umieścić w odpowiedniej komorze wilgotnej. Dodać 1 kroplę (20 25 µl) nierozcieńczonej kontroli pozytywnej i negatywnej, odpowiednio do dołka 1 i 2. Dodać 1 kroplę (20 25 µl) rozcieńczonej próbki pacjenta do pozostałych dołków. 2. Inkubacja preparatu: Inkubować preparat przez 30 ± 5 minut w komorze wilgotnej (zwilżony ręcznik papierowy włożony na płasko na spodzie zamkniętej torebki lub szklanego pojemnika zapewni odpowiednie warunki wilgotności). Nie dopuścić do wyschnięcia substratu podczas badania. 3. Wypłukać preparaty: Po inkubacji użyć plastikowej gruszki laboratoryjnej lub pipety, aby delikatnie przepłukać surowicę rozcieńczonym buforem PBS II. Ustawić preparat oraz strumień bufora PBS II w taki sposób, aby ograniczyć wypłukiwanie próbek między dołkami. Unikać kierowania strumienia bezpośrednio na dołki, aby nie dopuścić do uszkodzenia substratu. Jeśli jest to wymagane, można umieścić preparaty na maks. 5 minut w barwiaczu Coplina z rozcieńczonym buforem PBS II. 4. Dodanie koniugatu fluorescencyjnego: Strząsnąć nadmiar buforu PBS II. Umieścić preparat z powrotem w komorze wilgotnej i natychmiast przykryć każdy dołek kroplą koniugatu fluorescencyjnego. Inkubować preparaty przez dodatkowe minut. 5. Wypłukać preparaty: Powtórzyć etap Szkiełko nakrywkowe: Procedura nakładania szkiełek nakrywkowych różni się w zależności od laboratorium. Zalecana jest poniższa procedura: a. Umieścić szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym. b. Nanieść środek do osadzania preparatu w formie ciągłej linii na dolnej krawędzi szkiełka nakrywkowego. c. Strząsnąć nadmiar buforu PBS II i zetknąć dolną krawędź preparatu z krawędzią szkiełka nakrywkowego. Delikatnie opuścić preparat na szkiełko nakrywkowe, w taki sposób, aby środek do osadzania preparatu rozpłynął się do górnej krawędzi preparatu bez formowania pęcherzyków powietrza. Kontrola jakości System pozytywnej kontroli canca oraz system negatywnej kontroli IFA powinny być przeprowadzone na każdym preparacie, aby zapewnić, że wszystkie odczynniki i procedury są wykonane poprawnie. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -70 o C. A b y w yn iki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, wyniki badania powinny być traktowane jako nieważne i badanie powinno zostać powtórzone. 1. Nierozcieńczone pozytywne canca musi być > System kontroli negatywnej IFA musi być negatywny. Interpretacja wyników Reakcja negatywna. Próbka jest traktowana jako negatywna, jeśli swoiste zabarwienie jądrowe lub cytoplazmatyczne jest równe lub mniejsze niż systemu negatywnej kontroli IFA. Próbki mogą wykazywać różny stopień barwienia tła ze względu na przeciwciała heterofilne lub niski poziom autoprzeciwciał skierowanych przeciwko składnikom cytoplazmatycznym, jak białka kurczliwe. Reakcja pozytywna. Próbkę uznaje się za pozytywną, jeśli określone barwienie jądrowe i/lub cytoplazmatyczne, jak opisano poniżej jest większe niż kontrola negatywna i intensywność zabarwienia 1 + lub więcej. Ustalić stopień fluorescencji lub intensywności za pomocą tych kryteriów: 4+ Jaskrawo jasnozielona fluorescencja 3+ Jasna jasnozielona fluorescencja 2+ Wyraźnie rozpoznawalna pozytywna fluorescencja 1+ Najniższa swoista fluorescencja, która umożliwia wyraźne odróżnienie barwienia jądrowego i/lub cytoplazmatycznego od fluorescencji tła Interpretacja wzoru. Różnorodność wzorów barwienia materiałów jądrowych i cytoplazmatycznych może być przedstawiana w zależności od rodzaju i względnej ilości autoprzeciwciał obecnych w próbce. Mogą być obserwowane następujące rodzaje wzorów barwienia: barwienie canca lub cytoplazmatyczne: Ten wzór ogólnie prezentuje duże ziarnistą, plamistą fluorescencję cytoplazmy często z akcentowaną fluorescencją w lub wokół płatów jądra. Zazwyczaj wykrywa się, że ten wzór wytwarza przeciwciała reagujące z enzymem ziarnistości pierwotnych proteazą serynową 3 (PR3). 4

5 Barwienie panca lub okołojądrowe: Ten wzór zazwyczaj pojawia się jako jednorodne barwienie płatów jądra, często z akcentacją okołojądrową. Ponieważ niektóre przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) mogą również reagować z jądrami utrwalonych etanolem ludzkich neutrofili, zaleca się, żeby te próbki również był y badane na obecność ANA. Ponadto, te próbki mogą być badane na neutrofilach człowieka utrwalonych w formalinie zamiast etanolu. Formalina, będąc utrwalaczem sieciującym, niszczy większość antygenów jądrowych i zmieniając wzór barwienia z okołojądrowego na cytoplazmatyczny, jeżeli próbka zawiera panca. Utrwalone w tym celu w formalinie preparaty są dostępne osobno. Ograniczenia badania 1. Dezaktywowane ciepłem, hemolizowane, skażone mikrobiologicznie lub niekompletnie odwłóknione próbki może powodować wysokie zabarwienie tła, co powoduje, że interpretacja staje się trudna. Uzyskać świeżą próbkę i zbadać ponownie. Dodatek 2% albuminy lub surowicy bydlęcej do buforu fosforanowego używany do rozcieńczenia próbki może zmniejszyć barwienie tła problematycznych próbek. 2. Dodatnie próbki ANA mogą reagować z neutrofilami utrwalonymi etanolem. Próbki z dodatnimi jądrami powinny być badane w kierunku obecności ANA i/lub poddane badaniu skrawków utrwalonych formaliną. 3. Ponieważ wiadomo, że utrwalone etanolem neutrofile ludzkie, zawierają wiele antygenów ziarnistości pierwotnych, takich jak elastaza, laktoferyna, katepsyna G, białko kationowe 57 i ewentualnie innych niezidentyfikowane jeszcze antygenów neutrofilów, próbki pojawiające się jako p lub canca dodatnie nie zawsze mogą dać dodatni test na specyficzne przeciwciała mieloperoksydazy (MPO) i proteazy serynowej 3 (PR3). 4. Poza ANA, niektórych innych autoprzeciwciał mogą reagować z utrwalonymi etanolem ludzkimi neutrofilami. Przeciwciała te obejmują przeciwciała przeciwko mięśniom gładkim (aktynie) oraz pewne alloprzeciwciała takie jak Mart lub NB1. 15 Przeciwciała przeciwko aktynie lub komórkom mięśni gładkich reagują z cytoplazmą neutrofili, ale bardziej przy wzorcu jednorodnym niż wzorze ziarnistoplamistym, jak przy typowym canca. Alloprzeciwciała pojawiają się również jako wzór cytoplazmatyczny, ale ze znacznie delikatniejszą w porównaniu do canca plamistością i tylko niewielki odsetek komórek (zazwyczaj 40% lub mniej) będzie wykazywał fluorescencję. 5. Czasami można zobaczyć próbki z więcej niż jednym autoprzeciwciałem. Na przykład, C i P ANCA lub ANCA oraz ANA. 6. Niektórzy pacjenci z chorobą zapalną jelit lub wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego mają przeciwciała reagujące z neutrofilami. 16 Próbki te pojawiają się jako typ wzoru panca na utrwalonych alkoholem neutrofilach z bardzo zaakcentowanym barwieniem okołojądrowym. Zazwyczaj próbki te pojawiają się jako negatywne lub słabo homogenne, z cytoplazmatyczną fluorescencją na utrwalanych formaliną preparatach neutrofili. 7. Nieprawidłowe postępowanie z preparatami podczas procedury barwienia, szczególnie do suchej slajdów umożliwia między kroków może doprowadzenie preparatów do wysuszenia pomiędzy poszczególnymi etapami, może powodować "wyprany" wygląd wzoru i wysoki poziom zabarwienie tła. 8. Użycie odczynników z innych rodzajów zestawów przeciwciał fluorescencyjnych (zwłaszcza koniugatu) może mieć negatywny wpływ na czułość i swoistość etanolu utrwalone alkoholem substratów neutrofili. 9. Wiele różnych czynników zewnętrznych ma wpływ na wrażliwość testu, np. typ używanego mikroskopu fluorescencyjnego, moc i wiek lampy, stosowane powiększenie, system filtrów oraz badacz. 10. Jeśli zamiast filtra barierowego 515 używany jest filtr środkowo-przepustowy, może wystąpić zwiększone zabarwienie artefaktowe. 11. Do opisywania preparatów należy stosować wyłącznie ołówek. Stosowanie innego przyrządu do pisania może spowodować zabarwienie artefaktowe. 12. Wszystkie barwiacze Coplina stosowane do płukania preparatów nie powinny zawierać żadnych pozostałości barwników. Używanie barwiaczy Coplina zawierających pozostałości barwników może spowodować zabarwienie artefaktowe. 13. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 14. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. 15. Preparaty sprzedawane oddzielnie są sklasyfikowane jako Odczynniki analityczne. Z wyjątkiem uwzględnienia jako składnika zestawu NOVA Lite ANCA charakterystyka analityczna nie są ustalone. Spodziewane wartości Sto piętnaście losowo dobranych prawidłowych próbek było badanych na preparatach utrwalanych alkoholem NOVA Lite ANCA. Przedstawione próbki wykonywano jako badania wstępne do pracy lub przy badaniach lekarskich pracowników i jako takie nie mogły obejmować osób starszych lub dzieci. Próbki te stanowiły losową mieszaninę próbek mężczyzn i kobiet. Wszystkie 115 próbek było negatywnych w przesiewowym rozcieńczeniu 1:20. Także badanych było 45 przypadków ziarniniaka Wegenera, 39 przypadków mikroskopowego zapalenie wielu tętnic oraz 20 pacjentów z kłębuszkowym zapaleniem nerek z tworzeniem półksiężyców jak też pacjentów z różnymi chorobami tkanki łącznej. Wyniki zostały podsumowane w następującej tabeli. 5

6 Grupa pacjentów Liczba pacjentów % Pozytywny Losowo wybrani zdrowi Ziarniniak Wegenera (wszyscy canca) Mikroskopowe zapalenie wielu tętnic (all panca) Zapalenie kłębuszków nerkowych z tworzeniem półksiężyców (wszyscy panca) SLE 27 7 (zarówno panca jak canca) Zespół Sjogrena 21 0 Twardzina 15 0 Zapalenie wielomięśniowe 6 0 Preparaty NOVA Lite ANCA porównano ze sobą stosując odwirowane roztwory neutrofilów stosowane rutynowo w uniwersyteckim centrum referencyjnym ANCA. Badanych było pięćdziesiąt pięć pozytywnych surowic (23 canca, 28 panca, 4 nietypowe) i 14 ANCA próbek negatywnych. Z 55 próbek pozytywnych, 54 wytworzyło identyczny wzór barwienia na preparatach NOVA Lite ANCA. Jedna próbka canca z niskim mianem dała wynik negatywny na preparacie INOVA. Wszystkie 14 ujemnych próbek ANCA było podobnie negatywne na preparatach NOVA Lite ANCA. Miareczkowanie 55 pozytywnych próbek dodatnich na obu podłożach dało ten sam wynik wyprodukował taki sam wynik lub jedną różnicę podwojenia rozcieńczenia z 53 badanych próbek. Pozostałe 2 próbki różniły 2 dwukrotnymi rozcieńczeniami. Czterdzieści osiem losowych próbek surowicy przedstawionych w głównym laboratorium referencyjnym w USA wykonującym badania ANCA było badanych jednocześnie w kierunku ANCA przy użyciu preparatów NOVA Lite ANCA, a także w kierunku swoistych przeciwciał przeciwko MPO i PR-3 stosując zestawy INOVA QUANTA Lite ELISA. Wyniki zostały podsumowane w następującej tabeli. Wynik IFA ilość próbek % pozytywnych ELISA MPO PR3 negatywne panca canca c i panca Atypowe Osiem próbek było ANC Anegatywne metodą immunofluorescencji. Wszystkie osiem próbek negatywnych d l a M P O i P R -3 metodą ELISA. Wyniki M P O i P R -3 wyniki wahały się od 1-5 jednostek, znacznie poniżej 20 jednostek wartości granicznej. Trzynaście próbek zostało ocenionych jako panca pozytywne przez IFA. Jedenaście z nich było MPO pozytywne i żaden z nich nie był PR-3 pozytywny. Dwadzieścia jeden próbek było canca pozytywne metodą immunofluorescencji. Żadna z tych próbek nie była MPO pozytywna, a 20 z 21 próbek było PR-3 pozytywne. Pięć próbek wydawało się, że wykazują wzory rodzaju p i c ANCA przy badaniu IFA. Cztery z nich było MPO pozytywne i żaden z nich nie był PR-3 pozytywny. Jedna próbka została oceniona jako nietypowa panca. Ten nietypowa próbka panca była negatywna zarówno w zestawach MPO i PR3. Zgodność wyników ANCA - ELISA vs IFA Podczas gdy mieloperoksydaza (MPO) i PR3 są głównymi antygenami, które można identyfikować jako p i c ANCA, użytkownik powinien mieć świadomość, że przeciwciała przeciwko kilku innym enzymom pierwotnych ziarnistości neutrofilów może także powodować wzory c i panca metodą immunofluorescencji na neutrofilach utrwalanych etanolem. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku przeciwciał panca, gdzie co najmniej 3 inne autoprzeciwciała z antygenami innymi niż mieloperoksydaza (MPO) może wytwarzać rodzaj wzoru IFA panca. Aby zilustrować tę tezę, próbki z wyżej wymienionego ziarniniaka Wegenera, mikroskopowe zapalenia wielu tętnic oraz grup zapalenia kłębuszków nerkowych z wytwarzaniem półksiężyców jak również zebrane zostało 48 próbek przedstawionych do rutynowych badań serologicznych. Zarówno utrwalane etanolem ludzkie neutrofile ocenione metodą immunofluorescencyjną jak i metodą ELISA przedstawiono poniżej. QUANTA Lite PR-3 IgG Względna czułość 90,9% canca IFA Swoistość względna 98,8% Zgodność 95,4% QUANTA Lite MPO IgG Względna czułość 61,0% panca IFA Swoistość względna 100% Zgodność 80,3% Z 66 próbek dodatnich canca IFA, 6 negatywnych dla PR3 i 1 próbkę ELISA pozytywny jeszcze negatywnie oceniona przez IFA. Spośród 77 próbek dodatnich panca IFA, 30 było negatywnych przy badaniu swoistym MPO ELISA. Brak panca, negatywne próbki IFA stwierdzono, że są pozytywne przy MPO ELISA. 6

7 Piśmiennictwo 1. Goeken JA, Antineutrophil cytoplasmic antibody - a useful serological marker for vasculitis. J Clin Immunol 11: , Specks U, et. al., Anticytoplasmic autoantibodies in the diagnosis and follow-up of Wegener s granulomatosis. May Clin Proc 64:28-36, van der Woude FJ, et. al., Autoantibodies against neutrophils and monocytes: tools for diagnosis and marker of disease activity in Wegener s granulomatosis. Lancet , Cohen-Tervaert JW, et. al., Association between active Wegener s granulomatosis and anticytoplasmic antibodies. Arch Intern Med 149: , Cambridge, et. al., Antineutrophil antibodies in inflammatory bowel disease: prevalence and diagnostic role. Gut 33: , Nolle B, et. al., Anticytoplasmic autoantibodies: their immunodiagnostic value in Wegener s granulomatosis. Ann Int Med 111:28-40, Charles LA, Falk RJ, Jennette JC, Clin Immunol Immunopathol 53: , Falk RJ, Jennette JC, Anti neutrophil cytoplasmic autoantibodies with specificity for myeloperoxidase in patients with systemic vasculitis and idiopathic necrotizing and crescentic glomerulonephritis. N Engl J Med 318: , Jennette JC, Wilkman AS, Falk RJ, Am J Path 135: , Gross WL, Ludemann G, et. al., Lancet 1:806, Cohen-Tervaert JW, et. al., Association of autoantibodies to myeloperoxidase with different forms of vasculitis. Arth and Rheum 33(8): , Cohen-Tervaert JW, et. al., Autoantibodies against myeloid lysosomal enzymes in crescentic glomerulonephritis. Kidney Int 37: , Cohen-Tervaert JW, et. al., Detection of autoantibodies against myeloid lysosomal enzymes: a useful adjunct to classification of patients with biopsy proven necrotizing arteritis. Am J Med 91:59-66, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, Stroncek DF, et. al., Neutrophil alloantibodies react with cytoplasmic antigens: a possible cause of false-positive indirect immunofluorescence assays for antibodies to neutrophil cytoplasmic antigens. Am J Kidney Dis 21: , Hardarson S, et. al., Antineutrophil cytoplasmic antibody in inflammatory bowel and hepatobiliary diseases. Clinical Microbiology and Immunology 99: No. 3,

8 Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Grudzień 2012 Wersja 1 NOVA Lite, QUANTA Lite i INOVA Diagnostics, Inc.są zastrzeżonym znakiem handlowym firmy Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone 8