NOVA Lite Rat Liver, Kidney, Stomach Do diagnostyki In Vitro

Transkrypt

1 NOVA Lite Rat Liver, Kidney, Stomach Do diagnostyki In Vitro Kod produktu: , , , Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie Ten produkt jest przeznaczony do użycia w badaniach przesiewowych i miareczkowaniu obiegowych przeciwciał w ludzkiej surowicy, jako pomoc w diagnozowaniu i leczeniu różnych chorób autoagresyjnych. Cztery główne wykryte autoprzeciwciała to przeciwciała przeciwjądrowe (ANA), przeciwciała przeciwmitochondrialne (AMA), przeciwciała przeciwko mięśniu gładkiemu (ASMA) oraz przeciwciała przeciwko komórkom okładzinowym żołądka (AGPCA). Podsumowanie i wyjaśnienie testu Niebezpośrednia immunofluorescencja jest metodą referencyjną do badań przesiewowych i miareczkowania obiegowych autoprzeciwciał w ludzkiej surowicy. Skrawki tkanki zwierzęcej, np. szczura, są z reguły preferowane zamiast typowo używanych substratów obejmujących skrawki tkanki ludzkiej i preparaty komórkowe. Jest to przede wszystkim spowodowane brakiem interferencji HLA i/lub innych przeciwciał grupy krwi. Użycie trzech różnych tkanek (wątroba, nerka i żołądek) umożliwia łatwiejszą identyfikację autoprzeciwciał, przez porównywanie wyników uzyskanych z każdą tkanką. Określone przeciwciała są powiązane z wieloma różnymi chorobami. ANA prawie zawsze występują z toczeniem rumieniowatym układowym (SLE) ale również często można je znaleźć u pacjentów z chorobami tkanki łącznej i reumatoidalnymi. AMA często występują w przypadku marskości wątroby pierwotnej żółciowej ale można również je wykryć u pacjentów z innymi chorobami wątroby. ASMA są często powiązane z przewlekłym aktywnym zapaleniem wątroby oraz marskością wątroby pierwotną żółciową, ale są również wykrywane w małych stężeniach w różnych innych chorobach. AGPCA występuje w surowicy większości pacjentów z anemią złośliwą. Bardziej szczegółowy opis powiązania poszczególnych przeciwciał z określonymi chorobami można znaleźć w sekcji Wyniki. 1-9 Zasada badania Niebezpośrednia technika immunofluorescencyjna jest używana, gdy próbki pacjenta oraz odpowiednie kontrole są inkubowane z preparatami substratu. 10 Niezwiązane przeciwciała są wypłukiwane i podawane są odpowiednie koniugaty znakowane fluoresceiną. Niezwiązany koniugat jest wypłukiwany i preparaty są oglądane pod mikroskopem fluorescencyjnym. Pozytywne próbki wykazują jasnozielone zabarwienie fluorescencyjne, które odpowiada obszarom skrawka, gdzie związało się autoprzeciwciało. Odczynniki 1. Skrawki wątroby, nerki, żołądka szczura na preparacie z 5 lub 10 dołkami z osuszaczem Tylko zestawy: 2. Wzór homogeniczny ANA, surowica pozytywnej kontroli zawierająca azydek sodu 0,09%. Wstępnie rozcieńczony, gotowy do użycia. 3. Surowica negatywnej kontroli systemu IFA zawierająca azydek sodu 0,09%. Wstępnie rozcieńczony, gotowy do użycia. 4. Koniugat izotiocyjanianu (FITC) fluoresceiny IgG owcy przeciw ludzkiemu IgG (H+L) oczyszczony na kolumnie powinowactwa, zawierający azydek sodu 0,09%. Wstępnie rozcieńczony, gotowy do użycia. 5. Wzór mitochondrialny (AMA), surowica pozytywnej kontroli zawierająca azydek sodu 0,09%. Wstępnie rozcieńczony, gotowy do użycia. 6. Wzór mięśnia gładkiego (ASMA), surowica pozytywnej kontroli zawierająca azydek sodu 0,09%. Wstępnie rozcieńczony, gotowy do użycia. 7. Błękit Evansa 1%, opcjonalny barwnik kontrastowy 8. Bufor fosforanowy (PBS), 40-krotny koncentrat w formie płynnej. 9. Bibułki, do odsączania preparatów po płukaniu 1

2 10. Środek do osadzania preparatu, zawierający czynnik zapobiegający blaknięciu (DABCO), 1, 4 diazabicyklo [2.2.2] oktan 11. Szkiełka nakrywkowe Ostrzeżenia/środki ostrożności Wszyscy dawcy dostarczonej ludzkiej surowicy (tylko zestawy) zostali przebadani na surowicę i stwierdzono, że są negatywni na antygen powierzchniowy zapalenia wątroby typu B i wirusa zapalenia wątroby typu C oraz wirusa ludzkiego niedoboru odporności (HIV 1 i 2). Jednak te badania nie mogą zagwarantować nieobecności czynników infekcyjnych. Należy ustalić odpowiednie metody obsługi i utylizacji wszystkich potencjalnie infekcyjnych materiałów badanych przy użyciu tego produktu. Jedynie personel odpowiednio przeszkolony w zakresie tych metod powinien być upoważniony do wykonywania tych badań. Błękit Evansa oraz kontrole zestawu zawierają azydek sodu 0,09%, pełniący funkcję konserwantu i należy obchodzić się z nim ostrożnie nie połykać i nie dopuszczać do kontaktu ze skórą lub błonami śluzowymi. W razie kontaktu przepłukać dane miejsce dużą ilością wody i zwrócić się o pomoc medyczną. Wybuchowe azydki metalu mogą tworzyć się w przypadku kontaktu z ołowianymi lub miedzianymi elementami instalacji kanalizacyjnej. W przypadku utylizacji odczynnika należy przepłukać instalację dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. Ten produkt powinien być używany wyłącznie przez przeszkolone osoby oraz zgodnie z przeznaczeniem. Zalecane jest przestrzeganie podanej procedury. Warunki przechowywania Nieotwarte zestawy/preparaty powinny być przechowywane w temperaturze 2 8 C i mogą być używane w trakcie podanego terminu ważności. NIE ZAMRAŻAĆ. Gdy preparaty zostaną wyjęte z torebki foliowej, należy ich natychmiast użyć. Rozcieńczony bufor PBS może być przechowywany maksymalnie przez jeden miesiąc w temperaturze 2 8 C. Wszystkie odczynniki powinny być przechowywane w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Próbki krwi powinny być pobierane poprzez wkłucie dożylne, powinny w naturalny sposób skrzepnąć, a surowica powinna zostać jak najszybciej oddzielona, aby nie dopuścić do hemolizy. Surowica przed analizą może być przechowywana w temperaturze 2 8 C do 7 dni 11 lub dłużej, jeśli zostanie podzielona i będzie przechowywana w temperaturze -20 C lub niższej. NIE zamrażać i rozmrażać surowicy więcej niż jeden raz. Unikać surowicy lipemicznej, hemolizowanej lub skażonej bakteryjnie, ponieważ może dojść do obniżenia stężenia lub może wystąpić niewyraźne wybarwienie. Badanie Dostarczone materiały (zestawy) x preparat wątroby, nerki, żołądka szczura (5 dołków) 2. 1 x 1 ml wzór homogeniczny ANA (wstępnie rozcieńczony) 3. 1 x 1 ml systemu kontroli negatywnej IFA (wstępnie rozcieńczona) 4. 1 x 1 ml wzór mitochondrialny (AMA) (wstępnie rozcieńczony) 5. 1 x 1 ml wzór mięśnia gładkiego (ASMA) (wstępnie rozcieńczony) 6. 1 x 7 ml koniugat FITC IgG (H+L) 7. 1 x 3 ml barwnik kontrastowy błękit Evansa 1% 8. 2 x 25 ml bufor PBS (stężenie x40) 9. 1 x 3 ml środka do osadzania preparatu x bibułek x szkiełek nakrywkowych broszura z instrukcjami x preparat wątroby, nerki, żołądka szczura (10 dołków) 2. 1 x 1 ml wzór homogeniczny ANA (wstępnie rozcieńczony) 3. 1 x 1 ml systemu kontroli negatywnej IFA (wstępnie rozcieńczona) 4. 1 x 1 ml wzór mitochondrialny (AMA) (wstępnie rozcieńczony) 5. 1 x 1 ml wzór mięśnia gładkiego (ASMA) (wstępnie rozcieńczony) 6. 1 x 15 ml koniugat FITC IgG (H+L) 7. 1 x 3 ml barwnik kontrastowy błękit Evansa 1% 8. 2 x 25 bufor PBS (stężenie x40) 2

3 9. 1 x 10 ml środka do osadzania preparatu x bibułek x szkiełek nakrywkowych broszura z instrukcjami Dostarczone materiały (preparaty) x preparat wątroby, nerki, żołądka szczura (5 dołków) lub x preparat wątroby, nerki, żołądka szczura (10 dołków) Broszura z instrukcjami Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Woda destylowana lub dejonizowanado rozcieńczania koncentratu PBS Naczynie do buforu PBS Mikropipety i jednorazowe końcówki do przenoszenia próbek pobranych od pacjentów Komora wilgotna do czynności związanych z inkubacją Mikroskop fluorescencyjny z filtrem wzbudzającym 495 nm i filtrem barierowym 515 nm Plastikowa gruszka laboratoryjna do wstępnego płukania w buforze PBS Dodatkowe elementy można zakupić w firmie INOVA Diagnostics: PBS (508002), system kontroli negatywnej IFA (508186), wzór homogeniczny ANA (508101), wzór mitochondrialny (AMA) (504052), wzór mięśnia gładkiego (ASMA) (504053), FITC IgG (H+L) koniugat (504021, ), błękit Evansa 1% (504049) i środek do osadzania preparatu (504046, ). Procedura badania Kontrola jakości Przy każdym badaniu próbek powinna być stosowana kontrola pozytywna i negatywna. 1. Środek do osadzania preparatu. Wyjąć środek do osadzania preparatu z chłodziarki, aby przed użyciem osiągnął temperaturę pokojową (18 28 C). 2. Rozcieńczyć koncentrat PBS. Rozcieńczyć koncentrat PBS wodą destylowaną (1 część koncentratu PBS + 39 części wody destylowanej) i wymieszać. Bufor PBS jest używany do rozcieńczania próbek pacjentów oraz jako bufor do płukania. 3. Rozcieńczyć próbki pobrane od pacjenta. Badanie przesiewowe: Rozcieńczyć próbki pochodzące od pacjenta w stosunku 1/20, dodając 50 µl surowicy do 950 µl buforu PBS. Miareczkowanie: Wykonać serię rozcieńczeń pozytywnie próbek przy użyciu buforu PBS. (np. 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 i 1/320 itp.). Na przykład: 100 µl roztworu w rozcieńczeniu 1/20 zmieszać z 100 µl buforu PBS, aby uzyskać roztwór w rozcieńczeniu 1/40. Powtórzyć z innymi rozcieńczeniami. 4. Preparaty substratu. Preparaty substratu przed wyjęciem z woreczka muszą osiągnąć temperaturę pokojową (18-28 C). Odpowiednio oznaczyć preparaty, umieścić w komorze wilgotnej i dodać jedną kroplę kontroli pozytywnej oraz negatywnej do odpowiednich dołków. Do pozostałych dołków dodać 50 µl rozcieńczonych próbek pochodzących od pacjenta. 5. Inkubacja preparatu. Inkubować preparaty przez 20 minut w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej (18-28 C). 6. Płukanie PBS. Wyjąć preparaty z komory wilgotnej i krótko przepłukać PBS posługując się gruszką laboratoryjną. Nie kierować strumienia bezpośrednio na dołki. Umieścić preparaty w statywie, zanurzyć w buforze PBS i wstrząsać lub mieszać przez 5 10 minut. 7. Dodanie fluorescencyjnego koniugatu.strząsnąć nadmiar buforu PBS i osuszyć przestrzeń wokół dołków za pomocą dostarczonych bibułek. Umieścić preparaty ponownie w komorze wilgotnej i natychmiast przykryć każdy dołek kroplą fluorescencyjnego koniugatu. NIE POZOSTAWIAĆ ODKRYTYCH DOŁKÓW NA CZAS DŁUŻSZY NIŻ 15 SEKUND. Wyschnięcie substratu w poważnym stopniu wpływa na wyniki. 8. Inkubacja preparatu. Inkubować preparaty przez 20 minut w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej (18-28 C). 9. Płukanie PBS. Wypłukać ponownie zgodnie z powyższym opisem. Opcjonalne barwienie kontrastowe. Przed zanurzeniem preparatu dodać 2 3 krople błękitu Evansa 1% na 100 ml buforu PBS. 3

4 10. Osadzanie ze szkiełkiem nakrywkowym. Wyjąć po kolei preparaty z płukanki PBS. Osuszyć szybko obszar wokół dołków i do każdego dołka dodać kroplę środka do osadzania preparatu. Opuścić ostrożnie preparat na szkiełko nakrywkowe. Należy starać się nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza, ale jeśli występują, nie należy ich usuwać. Zetrzeć nadmiar środka do osadzania wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego. 11. Obejrzeć preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym.preparaty mogą być przechowywane do 3 dni w temperaturze 2 8 C, w ciemności, bez istotnej utraty fluorescencji. Wyniki Kontrola jakości Wzór homogeniczny ANA powinien wykazać jasnozielone homogeniczne zabarwienie w jądrze komórki. Wzór mitochondrialny (AMA) powinien wykazać jasnozielone wybarwienie kanalików nerkowych i komórek okładzinowych żołądka. Wzór mięśnia gładkiego (ASMA) powinien wykazać jasnozielone zabarwienie warstwy mięśniowej żołądka. Kontrola negatywna powinna wykazać zgniłozielone zabarwienie we wszystkich tkankach, bez dostrzegalnej fluorescencji. Jeśli powyżej opisane kontrole nie zostaną uzyskane, badanie jest nieprawidłowe i należy je powtórzyć. Interpretacja wyników Wynik negatywny Są one widoczne jako zgniłozielone zabarwienia na wszystkich skrawkach, bez dostrzegalnej fluorescencji. Słabe reakcje powinny być powtórzone przy wyższym rozcieńczeniu (np. 1/40). Jeśli powtórzony wynik będzie podobny do pierwszego, test jest traktowany jako negatywny. Wynik pozytywny Są one widoczne jako znaczna fluorescencja w obszarze określonej tkanki, wykazując jeden lub więcej następujących wzorów: Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) ANA zabarwiają jądra następujących elementów: komórek wątroby, dalszych i bliższych kanalików nerki, komórek głównych i okładzinowych żołądka. Prawie wszyscy pacjenci SLE mają ANA w surowicy, ale ANA można również znaleźć w różnych chorobach tkanki łącznej, w tym również w reumatoidalnym zapaleniu stawów. ANA mogą również występować w przewlekłym aktywnym zapaleniu wątroby i marskości wątroby pierwotnej żółciowej w formie reakcji na określone kuracje lekowe. Dodatkowe informacje można uzyskać na podstawie interpretacji uzyskanych wzorów jądrowych ANA (patrz poniżej). Zalecane jest, aby wszystkie pozytywne próbki ANA były stężane do punktu końcowego w celu zapewnienia wykrycia możliwych mieszanych reakcji, które w przeciwnym razie byłyby pominięte. Zalecane są również dalsze analizy takich próbek dla autoprzeciwciał dwunicowego DNA i ekstrahowalnych antygenów jądrowych (ENA). Wzór Typowe zaangażowane antygeny Powiązanie z chorobą Jednorodny ds DNA, histony SLE Reumatoidalne zapalenie stawów (RA) Mieszana choroba tkanki łączącej Toczeń polekowy Zewnętrzne Natywne/ds DNA SLE (Otoczka) Plamy Ekstrahowalne antygeny jądrowe, Rybonukleoproteina, Scl-70, SSB Twardzina Zespół Sjogrena Mieszana choroba tkanki łączącej SLE Jąderkowy 4-6S srna Twardzina Zespół Sjogrena SLE, RA i postępująca twardzina układowa 4

5 Wzory zabarwienia autoprzeciwciał charakterystyczne dla danej tkanki obejmują: Przeciwciała Powiązana tkanka Główna choroba powiązanie Przeciwmitochondrialne przeciwciała (AMA) Przeciwko mięśniom gładkim przeciwciała (ASMA) Przeciw komórkom okładzinowym żołądka przeciwciała (AGPCA) Przeciwciała przeciwko rektulinie (ARA) Cytoplazma dalszych kanalików nerki i bliższe kanaliki (w mniejszym zakresie). Cytoplazma komórki wątroby (wątroba) i cytoplazma komórki okładzinowej żołądka (żołądek) Warstwy mięśniowe (żołądek) Warstwy mięśni tętniczki (inne tkanki) Komórki okładzinowe (żołądek) Włókna okołokanalikowe i torebki kłębuszka nerkowego (nerka) Błony komórek wątroby, ścianki sinusoidalne (wątroba) Marskość wątroby pierwotna żółciowa i inne choroby wątroby Przewlekłe aktywne zapalenie wątroby Anemia złośliwa Choroba Leśniowskiego-Crohna Celiakia Opryszczkowe zapalenie skóry Uwaga: Każde laboratorium powinno ustalić, na którym etapie wynik pozytywny jest traktowany jako klinicznie istotny. Ograniczenia badania 1. Test ten, gdy przeprowadza się go jako jedyny, nie powinien być rozpatrywany jako diagnostyczny. Muszą zostać uwzględnione wszystkie inne czynniki, w tym historia kliniczna pacjentów oraz inne wyniki serologiczne lub wyniki badań biopsyjnych. 2. Wzory zabarwienia często zmieniają się, gdy próbka jest poddawana zmianom stężenia do punktu granicznego. Jest to najczęściej spowodowane obecnością więcej niż jednego przeciwciała, szczególnie dla ANA. 3. Negatywny wynik w przypadku tego zestaw może być spowodowany ustąpieniem choroby lub obecnością autoprzeciwciał, które nie są wykrywalne za pomocą tej techniki. 4. Źródło światła, filtry i przyrządy optyczne różnych producentów mikroskopów fluorescencyjnych wpływają na wrażliwość badania. Działanie mikroskopu jest w dużym stopniu uzależnione od prawidłowej obsługi/serwisowania. Szczególnie dotyczy to wycentrowania lampy rtęciowej oraz jej wymiany, zgodnie z zaleceniami serwisowymi. 5. Autoprzeciwciała mogą być aktywowane lub wywoływane przez wiele różnych leków, w tym doustne środki antykoncepcyjne i antybiotyki. 6. Na skutek małej odległości pomiędzy dołkami na preparacie 10-dołkowym, może wystąpić krzyżowe zanieczyszczenie próbek i kontroli. Należy zachować ostrożność, szczególnie na etapie płukania, aby do tego nie dopuścić. 7. Przydatność do stosowania z odczynnikami IFA innych producentów nie została sprawdzona, ale stosowanie z takimi odczynnikami nie koniecznie musi być wykluczone. Preparaty sprzedawane oddzielnie są sklasyfikowane jako Odczynniki analityczne. Nie ustalono ich właściwości analitycznych i wynikowych z wyjątkiem uwzględnienia jako składniku zestawu. Oczekiwane wartości i specyficzna charakterystyka wyników Oczekiwane wyniki Normalne Przeciwciała Procent występowania Odniesienie ANA AMA ASMA 3 2 ARA 5 8 AGPCA (u starszych osób) 9 5

6 Nieprawidłowości Diagnoza kliniczna Procent występowania Odniesienie ANA SLE 99 4 Mieszana choroba tkanki łączącej 90 3 Inna choroba autoagresyjna (RA, ,5 twardzina, zespół Sjögrena, zapalenie skórno-mięśniowe) AMA Marskość wątroby pierwotna żółciowa >95 3 ASMA Przewlekłe zapalenie wątroby 70 3 Marskość wątroby pierwotna żółciowa 50 3 ARA Choroba Leśniowskiego-Crohna 24 6 Celiakia ,6 Opryszczkowe zapalenie skóry 22 6 AGPCA Anemia złośliwa 90 9 Badanie porównawcze Badanie porównawcze zostało przeprowadzone na 96 próbkach klinicznych za pomocą zestawu i komercyjnie dostępnej metody referencyjnej. 93 z 96 przetestowanych próbek wykazały identyczne wyniki w ramach obu metod. W przypadku wzorów opisanych w sekcji Wyniki, wrażliwość względna wahała się w zakresie %, swoistość względna wynosiła 100% w każdym przypadku, a zgodność względna wahała się od 93 do 100%. W przypadku próbek, które się różniły, słabe zabarwienie ANA lub pozytywne SMA zostało uzyskane w każdym przypadku jedynie przy użyciu metody referencyjnej, sugerując, że te próbki znajdowały się na granicy wyników określonego wzoru oraz/lub występowały nieznaczne różnice we wrażliwości pomiędzy tymi dwoma metodami. Podsumowanie badania 1. Doprowadzić środek do osadzania preparatu do temperatury pokojowej. 2. Rozcieńczyć bufor PBS wodą destylowaną lub dejonizowana. 3. Rozcieńczyć surowicę pacjenta buforem PBS w stosunku 1/ Doprowadzić preparaty substratu do temperatury pokojowej (18 28 C). 5. Do odpowiednich dołków wlać 50 µl grupy kontrolnej pozytywnej i negatywnej oraz rozcieńczoną surowicę pacjenta. 6. Inkubować w komorze wilgotnej przez 20 minut. 7. Płukać przez 5 10 minut w buforze PBS. 8. Osuszyć obszar wokół każdego dołka i natychmiast pokryć każdy dołek kroplą koniugatu. 9. Inkubować zgodnie z punktem Przepłukać zgodnie z punktem Zamontować. 12. Obejrzeć preparat pod mikroskopem fluorescencyjnym. 6

7 Piśmiennictwo 1. Tan E M (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, Doniach, D, et al. (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic (lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical implications. Clin. Exp. Imm 1: Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H C & Chapel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK Cavallaro, J J, et al (1976). Immunofluorescent detection of autoimmune diseases, Immunology Series No. 7. CDC, Atlanta, GA. 5. Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis herpetiformis and adult coeliac disease. Lancet 1, Seah, P P et al (1973). Antireticulin antibody: Incidence and diagnostic significance. Gut 14, Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary cirrhosis. J. Clin. Path, 19, Rizzeto, M & Doniach, D (1973). Types of reticulin antibodies detected in human sera by immunofluorescence. J. Clin. Path. 26, Bird, A G (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H C & Chapel, H. Publ. IRL Press, Oxford, UK. Pg Weller, TH, Coons, AH (1954). Fluorescent antibody studies with agents of Varicella and Herpes zoster propagated In Vitro. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 86, Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield

8 Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Listopad 2013 Wersja 2 NOVA Lite I INOVA Diagnostics, Inc. jest zastrzeżonym znakiem handlowym Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone 8