QUANTA Lite CCP3 IgG ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite CCP3 IgG ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite CCP3 IgG ELISA jest to immunoenzymatyczny test do półilościowego oznaczania przeciwciał IgG przeciwko CCP3 (cykliczny peptyd zawierający cytrulinę 3) w surowicy pacjenta, osoczu cytrynianowym lub osoczu z EDTA. W połączeniu z innymi wynikami klinicznymi i laboratoryjnymi, do diagnozowania reumatoidalnego zapalenia stawów wykorzystać można badanie na obecność wspomnianych przeciwciał. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Reumatoidalne zapalenie stawów (RA) jest jedną z najczęstszych systemowych chorób autoimmunologicznych, która dotyka około 0,5% populacji światowej. 1 Diagnoza zależy głównie od manifestacji klinicznej choroby. Do niedawna, jedynym testem serologicznym stosowanym rutynowo był test na obecność czynnika reumatoidalnego (RF), który to czynnik występuje u około 50 90% takich pacjentów. 1,2 Jednakże, RF występuje również u ludzi, u których rozwinął się stan zapalny, osób cierpiących na inne choroby autoimmunologiczne oraz u niektórych zdrowych osób. 1,2 W leczeniu choroby istotne jest, aby jak najszybciej zdiagnozować i rozpocząć leczenie pacjentów cierpiących na RA. 3 Od wielu lat wiadomo było, że u osób cierpiących na RA występują autoprzeciwciała przeciwokołojądrowe, zwane również autoprzeciwciałami przeciwkeratynowymi. 4 Ostatnio odkryto, że przeciwciała te rozpoznają epitop zawierający deimidowaną formę argininy zwaną cytruliną. 5,6 Stwierdzono, że cykliczny peptyd zawierający cytrulinę, zwany CCP (Cyclic Citrullinated Peptide) jest lepiej się sprawdza w odróżnianiu pacjentów z RA od innych pacjentów, niż test na obecność przeciwciał przeciwokołojądrowych, czy test na obecność czynnika reumatoidalnego. 4,7-9 Z przeglądu opublikowanej literatury 6 wynika, że 77% pacjentów z RA wykazuje obecność przeciwciał przeciwko CCP, przy czym średnio 3% pacjentów nie cierpiących na tę chorobę posiada takie przeciwciała. Test ELISA przygotowany z użyciem pierwotnie opisanej sekwencji CCP 6 nie był powszechnie dostępny. Jednakże, test anty-ccp drugiej generacji (nazywany przez niektóre firmy CCP2) jest dostępny powszechnie i wykazuje lepsze działanie niż test oparty na oryginalnym peptydzie. 10 INOVA nazwała test drugiej generacji testem CCP IgG ELISA. Przeciwciała niektórych pacjentów cierpiących na RA, lecz nie wykazujących przeciwciał przeciwko CCP2, reagują na inne białka cytrulinowe 4,7,8 co sugeruje, że występują tu dodatkowe epitopy, które nie występują w sekwencji antygenu CCP drugiej generacji. Peptyd trzeciej generacji CCP3 stosowany w tym teście ELISA opracowano, testując próbki pochodzące od dużej liczby pacjentów z RA i pacjentów stanowiących kontrolę, w obecności wielu różnych peptydów cytrulinowych. Test ELISA na bazie CCP3 charakteryzuje się około 5% większą czułością w wykrywaniu RA u pacjentów niż jest to w przypadku CCP2 drugiej generacji, zachowując bardzo dużą swoistość. Dodatkowymi ulepszeniami CCP3 ELISA są dające się oddzielić zaznaczone kolorem dołki i możliwość użycia w badaniu próbek surowicy bądź osocza pacjenta. Zasada badania Antygenem zastosowanym w teście QUANTA Lite CCP3 IgG ELISA jest syntetyczny, cykliczny peptyd zawierający cytrulinę, o którym wiadomo, że charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością w wykrywaniu przeciwciał u pacjentów cierpiących na RA. Ten antygen jest związany z powierzchnią płytki z mikrodołkami. Rozcieńczone wstępnie próbki kontrolne i rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów dodaje się do oddzielnych dołków, co umożliwia związanie się wszelkich występujących w próbce przeciwciał IgG przeciwko CCP z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciwludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z wszelkimi przeciwciałami pacjenta, które związały się z mikrodołkami. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym, syntetycznym antygenem CCP3 (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacz 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał IgG przeciwko CCP, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Słabo pozytywna kontrola CCP3 IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała IgG surowicy ludzkiej przeciwko CCP, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Wysoko pozytywna kontrola/kalibrator A CCP3 IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała IgG surowicy ludzkiej przeciwko CCP, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 5. Kalibrator B CCP3 IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała IgG surowicy ludzkiej przeciwko CCP, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 1

2 6. Kalibrator C CCP3 IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała IgG surowicy ludzkiej przeciwko CCP, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 7. Kalibrator D CCP3 IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała IgG surowicy ludzkiej przeciwko CCP, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 8. Kalibrator E CCP3 IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała IgG surowicy ludzkiej przeciwko CCP, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 9. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 10. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 11. Koniugat HRP CCP3 IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 12. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 13. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną kontrolę CCP3 IgG ELISA, wysoko pozytywną kontrolę/kalibrator A CCP3 IgG ELISA, kalibratory B-E CCP3 IgG i kontrolę negatywną ELISA należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 2

3 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Procedurę tę należy przeprowadzać z użyciem próbek surowicy lub osocza cytrynianowego bądź próbek osocza z EDTA, ponieważ dają one identyczne wyniki. Nie powinno być stosowane osocze z litem i heparyną, ponieważ mogą one przynieść wyniki inne niż surowica. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po zebraniu, surowica powinna być oddzielona od skrzepu lub osocze powinno być przechowywane w sposób opisany poniżej. Dokument CLSI (uprzednio NCCLS) H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami CCP3 IgG ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli CCP3 IgG ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli/kalibratora A CCP3 IgG ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora B CCP3 IgG ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora C CCP3 IgG ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora D CCP3 IgG ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora E CCP3 IgG ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu HRP CCP3 IgG, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli CCP3 IgG ELISA, wysoko pozytywnej kontroli CCP3 IgG ELISA i kontroli negatywnej ELISA. 4. W celu stwierdzenia obecności lub braku przeciwciał przeciwko CCP3 z zastosowaniem jednostek arbitralnych, potrzebne są po dwa dołki na każdą z trzech kontroli i jeden do dwóch dołków na każdą próbkę pochodzącą od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. 3

4 5. Jeśli to pożądane, wyniki można określić ilościowo z zastosowaniem 5-punktowej krzywej wzorcowej. W celu wykreślenia 5-punktowej krzywej wzorcowej, dla uzyskania punktów A -E, należy zastosować WSTĘPNIE ROZCIEŃCZONE kalibratory A-E CCP3 pobrane bezpośrednio z fiolki. Pięciopunktowa krzywa wzorcowa ma następujące wartości: Punkt Jednostki A Wstępnie rozcieńczony kalibrator A CCP3 IgG 250,0 B Wstępnie rozcieńczony kalibrator B CCP3 IgG 125,0 C Wstępnie rozcieńczony kalibrator C CCP3 IgG 62,5 D Wstępnie rozcieńczony kalibrator D CCP3 IgG 31,25 E Wstępnie rozcieńczony kalibrator E CCP3 IgG 15,62 Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli CCP3 IgG ELISA, wysoko pozytywnej kontroli CCP3 IgG ELISA, kalibratorów B-E, jeśli to pożądane, kontroli negatywnej ELISA i rozcieńczonych próbek pochodzących od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu HRP CCP3 IgG. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą CCP3 IgG ELISA, wysoko pozytywną kontrolą CCP3 IgG ELISA i kontrolą negatywną ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola CCP3 IgG ELISA, wysoko pozytywna kontrola CCP3 IgG ELISA i kontrola negatywna ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli CCP3 IgG ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli CCP3 IgG ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Gęstość optyczna wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli CCP3 IgG ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli CCP3 IgG ELISA musi być ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej ELISA lub być większa niż 0,25. d. Kontrola negatywna ELISA i wysoko pozytywna kontrola CCP3 IgG ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Wysoko pozytywna kontrola CCP3 IgG ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI (uprzednio NCCLS) C24-A3. 4

5 Półilościowa analiza wyników metoda wskaźnikowa W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli CCP3 IgG ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli CCP3 IgG ELISA, którą można znaleźć na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x słabo pozytywna kontrola CCP3 IgG ELISA (jednostki) gęstość optyczna słabo pozytywnej (jednostki) kontroli CCP3 IgG ELISA Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Opcjonalna metoda obliczeń: wyników półilościowych z zastosowaniem krzywej wzorcowej Obliczanie wyników z opcjonalną krzywą wzorcową 1. Ustalić wartość średnią wszystkich zdublowanych odczytów. 2. Nanieść średnią absorbancję (gęstość optyczną) próbek na krzywej wzorcowej w odniesieniu do ich wartości w jednostkach. Do narysowania krzywej użyć liniowo/liniowej funkcji sklejanej (splajnu) stopnia 3 lub łamanej łączącej punkty. 3. Odczytując odpowiednią absorbancję na osi X wyznaczyć szukane stężenie CCP3 w jednostkach z osi Y. Obliczyć nieznane jednostki. 4. Uwaga: Wartości obliczone za pomocą metody wskaźnikowej będą różnić się od wartości obliczonych według krzywej wzorcowej. Wyższe wartości będą różnić się w większym stopniu niż wartości niższe. Przy zastosowaniu metody proporcjonalnej wysoko pozytywna kontrola CCP3 IgG nie daje wartości 250 jednostek. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, średnio pozytywna lub wysoko pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywna <20 Słabo pozytywna Średnio pozytywna Silnie pozytywna Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał IgG przeciwko CCP3 i sugeruje możliwość wystąpienia reumatoidalnego zapalenia stawów. 2. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała przeciwko CCP3, lub że ich poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania. 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki otrzymano przy wykorzystaniu zestawu INOVA QUANTA Lite CCP3 IgG ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości przeciwciał przeciwko CCP uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywie pozytywne wyniki w tym badaniu. 2. Nie u wszystkich pacjentów z RA występują przeciwciała przeciwko CCP. 3. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 4. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica, osocze z EDTA i osocze cytrynianowe. 5. Wartość diagnostyczna testu anty-ccp3 u pacjentów z młodzieńczym reumatoidalnym zapaleniem stawów nie została ustalona. 6. Substancje interferujące: Wysoki poziom hemoglobiny, bilirubiny, cholesterolu lub triglicerydów nie prowadzi do uzyskania wyników fałszywie pozytywnych bądź fałszywie negatywnych. 5

6 Oczekiwane wartości z próbek klinicznych Zdolność testu QUANTA Lite CCP3 IgG ELISA do wykrywania przeciwciał IgG CCP3 oceniono, porównując wyniki dla 521 próbek z wynikami uzyskanymi przy użyciu testu ELISA wykrywającego przeciwciała IgG przeciwko CCP z tych próbek pochodziło od pacjentów z klinicznie zdiagnozowanym reumatoidalnym zapaleniem stawów. Przebadano również próbki pochodzące od 166 losowo wybranych dawców krwi. Z 146 próbek, dla których dostępne były dane na temat wieku i płci, 59 pochodziło od kobiet, a średnia wieku dawców wynosiła 38,3 roku. W jednym dużym badaniu wewnętrznym wykorzystano próbki pochodzące od chorych stanowiących kontrolę osoby z innymi chorobami reumatycznymi (ORD), takimi jak toczeń rumieniowaty układowy (78), choroba Mikulicza- Radeckiego (11) oraz twardzina (24); wykorzystano również 86 dodatkowych próbek z przeciwciałami przeciwko chorobom zakaźnym (ID), takim jak zapalenie wątroby typu C (62), opryszczka pospolita (8), cytomegalia (8), toksoplazmoza (6) i różyczka (2). Swoistość i wrażliwość kliniczna W poniższej tabeli podsumowano wyniki wszystkich naszych badań klinicznych. Próbki N=521 CCP3 ELISA CCP IgG ELISA RA (N=156) Łączna liczba próbek kontrolnych (N=365) Dawcy krwi (N=166) ORD (N=113) Choroba zakaźna (N=86) Wrażliwość kliniczna [(95% przedział ufności (CI)] = CCP3 = 74% (67-81%) CCP = 69% (61 76%) Swoistość kliniczna (95% CI) = CCP3 = 96% (93-98%) CCP = 98% (96-99%) Reaktywność krzyżowa Aby ocenić potencjalne reakcje krzyżowe antygenu CCP3 z innymi autoprzeciwciałami, zestaw QUANTA Lite CCP3.1 ELISA oceniano z 16 próbkami, z których wszystkie charakteryzują się wysokim poziomem różnych innych autoprzeciwciał. Ta grupa zawierała 2 próbki, z których każda poddawała się reakcji z SS-A, SS-B, Sm, RNP, ScL-70, Jo-1, Ribo-P i dsdna. Wszystkie próbki były negatywne dla anty-ccp3. Powyższe badanie nie wykazuje znaczącej reaktywności krzyżowej antygenu CCP3 z wieloma różnymi autoprzeciwciałami. Precyzja i powtarzalność Mierzono zmienność pomiędzy przebiegami testu, przeprowadzając pojedyncze badanie próbek negatywnych, słabo pozytywnych, silnie pozytywnych w ramach 6 oddzielnych testów w okresie 4 różnych dni. Zmiany w obrębie przebiegu testu mierzono poprzez przeprowadzenie 9 próbek 8 lub 9 razy na tej samej płytce ELISA. Poniżej zostały przedstawione wyniki reprezentatywne. Zmienność pomiędzy seriami Negatywne 1 Niskie 1 Niskie 2 Wysokie 1 1 pkt* 5 pkt** 1 pkt 5 pkt 1 pkt 5 pkt 1 pkt 5 pkt Średnia 5 U 0 U 28 U 31 U 35 U 42 U 110 U 226 U SD CV% 4% 0% 6% 8% 3% 4% 4% 4% Zmienność w obrębie serii Negatywne 1 Niskie 1 Niskie 2 Wysokie 1 1 pkt 5 pkt 1 pkt 5 pkt 1 pkt 5 pkt 1 pkt 5 pkt Średnia 5 U 0 U 26 U 28 U 32 U 37 U 114 U 226 U SD CV% 3% 0% 3% 3% 5% 7% 1% 3% * Wyniki badań metodą wskaźnikową ** Wyniki badań metodą krzywej wzorcowej 6

7 Piśmiennictwo 1. Wener MH: Rheumatoid Factors. Manual of Clinical Laboratory Immunology, NR Rose et al eds, American Society for Microbiology Press, (2002). 2. Borretzen M et al: Rheumatoid Factors. Autoantibodies, Peter JB and Shoenfeld Y, eds, Elsevier Science B.V., (1996). 3. Kim JK and Weisman MH: When does rheumatoid arthritis begin and why do we need to know? Arthritis Rheum 43: (2000). 4. van Jaarsveld CHM et al: The prognostic value of the antiperinuclear factor, anti-citrullinated peptide antibodies and rheumatoid factor in early arthritis. Clin Exp Rheum 17: (1999). 5. Vossenaar ER and Van Venrooj WJ: Anti-CCP antibodies, a highly specific marker for (early) rheumatoid arthritis. Clin Applied Immunol Rev 4: (2004). 6. Schellekens GA et al: Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest. 101: (1998). 7. Vittecoq O et al: Autoantibodies recognizing citrullinated rat filaggrin in an ELISA using citrullinated and non-citrullinated recombinant proteins as antigens are highly diagnostic for rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol 135: (2004). 8. Saraux A et al: Value of antibodies to citrulline-containing peptides for diagnosing early rheumatoid arthritis. J Rheumatol 30: (2003). 9. Vencovsky J et al. Autoantibodies can be prognostic markers of an erosive disease in early rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 62: (2003). 10. van Gaalen FA et al: A comparison of the diagnostic accuracy and prognostic value of the firstand second anti-cyclic citrullinated peptide autoantibody (CCP1 and CCP2) tests for rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis epub ahead of print (2005). 11. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institute of Health, 5 th Edition,

8 QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Marzec 2011 Wersja 0 8