QUANTA Lite ANA ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite ANA ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: wysoka Przeznaczenie Test QUANTA Lite TM ANA jest to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) w surowicy ludzkiej. W połączeniu z objawami klinicznymi i innymi badaniami laboratoryjnymi, badanie na obecność ANA można wykorzystać do wspomożenia diagnostyki chorób reumatycznych, takich jak toczeń rumieniowaty układowy, zespół Sjogrena, twardzina i mieszana choroba tkanki łącznej. W teście tym wykrywane są łącznie, w jednej studzience, wszystkie przeciwciała ANA przeciwko chromatynie (dsdna i histonom), Sm/RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, centromerom i PCNA jak również przeciwciała przeciwko istotnym z diagnostycznego punktu widzenia antygenom, takim jak Jo-1, mitochondria (M-2) i rybosomalne białko P. Wykryć można również surowice dające wynik pozytywny na obecność niezidentyfikowanych antygenów w tradycyjnym wykrywającym przeciwciała teście immunofluorescencji pośredniej przy użyciu komórek HEp-2. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Obecność ANA jest jedną z charakterystycznych cech autoimmunologicznych chorób układowych. 1-4 Typowo, przeciwciała ANA wykrywano z zastosowaniem techniki immunofluorescencji pośredniej (IFA), wykorzystując do tego celu jako podłoże skrawki nerki mysiej lub komórki HEp-2. 3 Do identyfikacji swoistych autoprzeciwciał w surowicach dających wynik pozytywny na obecność ANA zastosować można dalsze badania z wykorzystaniem testu immunoenzymatycznego (ELISA), testu Western blot lub immunoprecypitacji. 1-4 Ostatnio w testach ELISA do wykrywania ANA wykorzystywano mieszaninę istotnych z diagnostycznego punktu widzenia antygenów wraz z ekstraktem z komórek HEp Przewaga ANA ELISA nad IFA obejmuje łatwość przeprowadzenia testu, brak efektu badacza i efektu urządzenia, otrzymanie wyników półilościowych i zmniejszoną liczbę wyników fałszywie pozytywnych. Wadą testu ELISA w porównaniu z IFA jest niewrażliwość na nieznane antygeny jądrowe i cytoplazmatyczne i brak obrazu ANA jaki od dawna dostępny jest dla testu IFA. Jednakże przydatność diagnostyczna przeciwciał ANA o nieznanej swoistości nie jest obecnie znana, gdyż u wielu zdrowych osób pojawiają się przeciwciała ANA, lecz jednocześnie nie występują u nich autoprzeciwciała istotne z diagnostycznego punktu widzenia Ponadto, po zidentyfikowaniu występowania w surowicy swoistej reaktywności, obraz ANA nie jest już dalej istotny dla diagnozy. Z tego też względu test ANA ELISA znajdzie zastosowanie w laboratorium klinicznym. Zasada badania Wysoko oczyszczone poszczególne antygeny i ekstrakty z jąder i jąderek komórek HEp-2 wiąże się z powierzchnią płytki z mikrodołkami. Antygeny obejmują chromatynę (dsdna i histony), Sm/RNP, SS-A, SS- B, Scl-70, centromer, PCNA, Jo-1, mitochondria (M-2) i rybosomalne białko P, jak również ekstrakty. Ostatnio wykazano, że reaktywność przeciwko chromatynie stanowi zarówno czuły jak i wczesny marker SLE. 13 Wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone surowice pacjentów dodaje się do oddzielnych dołków, co umożliwia związanie się wszelkich występujących w próbce przeciwciał ANA z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta antygenem jądrowym i cytoplazmatycznym (12-1 x 8 dołków), z uchwytem, w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko antygenom jądrowym i cytoplazmatycznym, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Kontrola słabo pozytywna testu ANA ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko antygenom jądrowym i cytoplazmatycznym, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Kontrola silnie pozytywna testu ANA ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko antygenom jądrowym i cytoplazmatycznym, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek ANA, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HS HRP (koziego), przeciwciała przeciw ludzkiego IgG, 1 fiolka zabarwienie purpurowe, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml 1

2 Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną kontrolę testu ANA ELISA, silnie pozytywną kontrolę testu ANA ELISA oraz kontrolę negatywną ELISA należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. 2

3 Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami ANA ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ANA ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu ANA ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek ANA 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu HS HRP IgG, (koziego), przeciw ludzkiego IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:41 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 10 μl próbki do 400 μl rozcieńczalnika do próbek ANA. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu ANA ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu ANA ELISA i kontroli negatywnej ELISA. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. Uwaga: Jeśli to pożądane, w celu potwierdzenia występowania ANA i określenia wzorca ANA próbki rozcieńczone w proporcji 1:41 rozcieńczalnikiem do próbek ANA można pipetować bezpośrednio na podłoże z komórek HEp-2. Próbki dające wynik pozytywny można miareczkować do punktu końcowego, stosując jako rozcieńczalnik standardowy roztwór PBS. Nie poddawano weryfikacji innych próbek od pacjenta niż te, które początkowo rozcieńczono tym buforem do stosunku 1: Ustalenie obecności lub nieobecności ANA z zastosowaniem jednostek umownych wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli oraz jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ANA ELISA, silnie pozytywnej kontroli ANA ELISA, kontroli negatywnej testu ELISA i rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 3

4 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu HS HRP IgG. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą testu ANA ELISA, silnie pozytywną kontrolą testu ANA ELISA i kontrolą negatywną ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola testu ANA ELISA, silnie pozytywna kontrola testu ANA ELISA i kontrola negatywna testu ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze - 20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu ANA ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ANA ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli ANA ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może przekroczyć 0,15. c. Absorbancja słabo pozytywnej kontroli testu ANA ELISA musi być przynajmniej dwukrotnie wyższa od absorbancji kontroli negatywnej testu ELISA lub przekraczać 0,15. d. Kontrola negatywna ELISA i kontrola pozytywna testu ANA ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Silnie pozytywna kontrola testu ANA ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie NCCLS C24-A. Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli testu ANA ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu ANA ELISA, którą można znaleźć na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x słabo pozytywna kontrola testu ANA ELISA (jednostki) Gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu ANA ELISA (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może zostać sklasyfikowana jako negatywna, umiarkowanie pozytywna lub silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywna <20 Średnio pozytywna Silnie pozytywna >60 4

5 1. Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał ANA i świadczy o możliwości wystąpienia chorób reumatycznych, takich jak toczeń rumieniowaty układowy, zespół Sjögrena, twardzina i/lub mieszana choroba tkanki łącznej. 2. Wynik negatywny wskazuje na brak przeciwciał, na obecność których prowadzono badanie lub że ich poziomy są poniżej wartości granicznej testu dla wyniku negatywnego. 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki otrzymano przy wykorzystaniu zestawu INOVA QUANTA Lite ANA ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości ANA uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować zwiększone nieswoiste wiązanie i powodować uzyskanie w tym badaniu wyników fałszywie pozytywnych. 2. Nie u wszystkich pacjentów z chorobami tkanki łącznej występują przeciwciała przeciwjądrowe. 3. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 4. Za pomocą tego testu nie można określić swoistości reaktywnej surowicy. Zaleca się przeprowadzenie dalszych badań na obecność swoistych przeciwciał. 5. Słabo pozytywna kontrola testu ANA ELISA i silnie pozytywna kontrola testu ANA ELISA zawierają surowicę z przeciwciałami przeciwko RNP. Antygen ten jest jednym z najbardziej podatnych na degradację. Zatem kontrole te stanowią również dokładną miarę integralności tego antygenu. W celu monitorowania poziomu innych antygenów zastosować można ponadto inne kontrole, zależnie od uznania poszczególnych laboratoriów. 6. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Normalny zakres Wartość graniczna między wynikiem negatywnym a pozytywnym wynosi 20 jednostek. Przebadano próbki pochodzące od 246 zdrowych ochotników. Populacja ta składała się w około 65% z kobiet w wieku od 18 do 75 lat i średniej wieku 38 lat. Dwadzieścia trzy (9,4%) próbki dały wynik pozytywny, co daje swoistość 90,6%. Jednakże w przypadku 6 próbek, które dały wynik pozytywny w teście ELISA, uzyskano również wynik pozytywny przy zastosowaniu techniki IFA na komórkach HEp-2. Wliczone zostały 2 próbki dające najsilniejszy wynik pozytywny, pochodzące od zdrowych ochotników, w przypadku których uzyskano wynik 40 i 50 jednostek. Biorąc pod uwagę 6 próbek dających wyniki pozytywne pochodzących od zdrowych ochotników uzyskuje się jedynie 6,9% wyników fałszywie pozytywnych. Dla wszystkich pozostałych, pochodzących od zdrowych ochotników próbek dających wynik pozytywny, uzyskano wynik 35 jednostek lub niższy. U około 60% próbek od zdrowych ochotników uzyskano wynik poniżej 10 jednostek. Swoistość i wrażliwość względna Porównanie z innym dostępnym na rynku referencyjnym testem ANA ELISA Zdefiniowane klinicznie próbki przebadano zarówno przy użyciu testu INOVA QUANTA Lite ANA ELISA jak i referencyjnego testu ANA ELISA. Wyniki dla populacji zdrowej oraz pacjentów z SLE, zespołem Sjögrena i twardziną podano w tabelach poniżej. Ponadto przy użyciu testu ELISA przebadano również surowice zawierające przeciwciała reagujące na SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, chromatynę, rybosomalne białko P i M2. Przebadano również próbki dające pozytywne wyniki w testach immunofluorescencji lub Western blot na obecność przeciwciał przeciwko centromerom, koilinie P-80, jąderkom i PCNA. Zestawy te dały prawie identyczne wyniki. Zgodnie z wyliczeniami na podstawie danych zawartych w poniższych tabelach, wrażliwość względna wynosi 89% a swoistość względna - 89%. Porównanie wyników dla osób zdrowych uzyskanych przy użyciu testu INOVA i referencyjnych testów ANA ELISA. Osoby zdrowe n=134 Negatywny 106 6** Referencyjny test ANA ELISA Pozytywna 13* 9*** * Dla próbek tych otrzymano wyniki w zakresie od 1 do 1,6 jednostki referencyjnej, co odpowiadało 20 do 33 jednostkom INOVA. Cztery z tych próbek dały wynik pozytywny na obecność ANA w teście IFA na komórkach HEp-2. ** Dla próbek tych uzyskano wyniki w zakresie od 20 do 25 jednostek INOVA. Dwie próbki dały pozytywny wynik na obecność ANA w teście IFA. *** Trzy z tych próbek dały pozytywny wynik na obecność ANA w teście IFA. Porównanie wyników dla pacjentów z układowymi chorobami reumatycznymi (SRD) uzyskanych przy użyciu testu INOVA i referencyjnych testów ANA ELISA SRD n=100 Negatywny 4* 1 Referencyjny test ANA ELISA Pozytywna 6 89 *Jedna z tych próbek dała wynik negatywny w teście IFA na komórkach HEp-2. 5

6 Porównanie wyników dla próbek o zdefiniowanej reaktywności uzyskanych przy użyciu testu INOVA ANA ELISA i referencyjnego testu ANA ELISA Liczba próbek zdefiniowanych n=74 Negatywny 2* 7*** Referencyjny test ANA ELISA Pozytywna 1** 64 * Była 1 próbka PCNA i 1 próbka Scl-70; obie w teście IFA na komórkach HEp-2 dały wynik pozytywny. ** Przy zastosowaniu testu IFA próbka ta wykazała obecność przeciwciał przeciwjąderkowych. *** Obejmowały one 1 próbkę Scl-70, 1 próbkę RNP, 1 próbkę M2 i 4 próbki Jo-1, z których wszystkie dały wynik słabo lub umiarkowanie pozytywny w teście. Próbki Scl-70 i RNP badane w teście z użyciem komórek HEp-2 wykazały obecność przeciwciał ANA. Pozostałe nie wykazały obecności przeciwciał ANA, lecz jak oczekiwano, w teście IFA dały wynik słabo pozytywny na obecność przeciwciał przeciwcytoplazmatycznych. Porównanie wyników uzyskanych za pomocą testów QUANTA Lite ANA ELISA i IFA na komórkach NOVA Lite HEp-2. Normalne i klinicznie zdefiniowane próbki, które badano przy użyciu testu INOVA QUANTA Lite ANA ELISA przebadano również metodą IFA z zastosowaniem zestawów NOVA Lite HEp-2 firmy INOVA. Aby upewnić się, że uzyskane wyniki nie zostaną obarczone błędem, pracownik techniczny, który odczytywał wyniki testu IFA, nie został poinformowany o zawartości próbek. Jak można zaobserwować, dane zawarte w poniższej tabeli świadczą o tym, że test ANA ELISA daje istotnie mniej wyników pozytywnych potwierdzających występowanie przeciwciał ANA w zdrowej populacji niż technika IFA. Ponadto, jak można zaobserwować, dane zawarte w drugiej tabeli świadczą o tym, że test ELISA jest prawie tak samo czuły jak technika HEp-2 w wykrywaniu ANA u pacjentów z SLE, zespołem Sjögrena i twardziną. Porównanie wyników uzyskanych dla zdrowych ochotników z zastosowaniem testu QUANTA Lite ANA ELISA i komórek NOVA Lite HEp-2 Osoby zdrowe n=134 Negatywny 91 10* IFA z wykorzystaniem komórek HEp-2 Pozytywna 28 5 * Dla wszystkich tych próbek uzyskano wynik 35 jednostek lub niższy. Porównanie wyników uzyskanych dla pacjentów z SRD zastosowaniem testu QUANTA Lite ANA ELISA i komórek NOVA Lite HEp-2 SRD n=100 Negatywny 1 3** IFA z wykorzystaniem komórek HEp-2 Pozytywna 9* 87 * Były 3 próbki, po jednej od pacjenta z SLE, zespołem Sjögrena i twardziną o różnych obrazach ANA w IFA, głównie o niewielkiej intensywności świecenia ANA. ** Wszystkie pochodziły od pacjentów z SLE; jedna z nich dała silny sygnał fluorescencyjny w obrębie cytoplazmy a w teście ELISA dała pozytywny wynik na obecność przeciwciał przeciwko rybosomalnemu białku P. Porównanie buforów do wykrywania ANA metodą IFA z wykorzystaniem komórek HEp-2 Oczekuje się, że niektóre laboratoria będą stosować test QUANTA Lite ANA ELISA do przeprowadzenia testów przesiewowych w celu wyłączenia próbek dających wynik negatywny a następnie potwierdzą wynik dla próbek pozytywnych konwencjonalnym testem IFA na obecność ANA. Dla ułatwienia zatem rozcieńczalnik do próbek ANA nadaje się do zastosowania również w tradycyjnych metodach IFA. Podzestaw próbek testowanych pod kątem ANA z zastosowaniem zestawu NOVA Lite HEp-2 przebadano również na obecność ANA metodą IFA z wykorzystaniem komórek HEp-2, stosując do rozcieńczenia próbek rozcieńczalnik do próbek ANA zamiast rozcieńczalnika PBS dostarczanego wraz z zestawem NOVA Lite. Uzyskane przy zastosowaniu dwóch różnych rozcieńczalników wyniki dla pacjentów z SLE, zespołem Sjögrena i twardziną były w zasadzie takie same. Jedynie 5 z 97 próbek dało wynik niezgodny. Rozcieńczalnik do próbek ANA spowodował zmniejszenie wiązania niespecyficznego i w 3 przypadkach spowodował uzyskanie wyniku pozytywnego w próbkach, które uprzednio dały wynik negatywny ze względu na spadek stanowiącego tło wybarwienia cytoplazmy, co umożliwiło ujawnienie się obrazu ANA. Dwukrotnie próbki, które uprzednio dały wynik słabo pozytywny, dały wynik negatywny, co spowodowane jest zmniejszeniem wybarwienia jądra. Jak oczekiwano, w grupie próbek pochodzących od osób zdrowych wystąpiło więcej niezgodnych wyników, ponieważ wyniki słabo pozytywne lub negatywne uzyskane w teście IFA są trudniejsze do określenia niż wyniki silnie pozytywne. Przy zastosowaniu rozcieńczalnika PBS, dla 33% zdrowych ochotników uzyskano wynik pozytywny, natomiast przy zastosowaniu rozcieńczalnika ANA ELISA pozytywnych wyników było 26%. Ostatnie doniesienia literaturowe świadczą o tym, że przy rozcieńczeniu 1:40, w populacji normalnych zdrowych osób uzyskuje się 30% wyników pozytywnych na obecność ANA. 11 6

7 Miana przeciwciał dla czterech próbek pozytywnych określono, rozcieńczając seryjnie rozcieńczalnikiem PBS próbki, które oryginalnie miały zostać rozcieńczone rozcieńczalnikiem ANA,w rozcieńczeniu 1:41. Te miana punktów końcowych mieściły się w obrębie 1 podwójnego rozcieńczenia próbek, które początkowo rozcieńczano NOVA Lite PBS. Nie poddawano weryfikacji innych próbek od pacjenta niż te, które początkowo rozcieńczono tym rozcieńczalnikiem do próbek ANA do stosunku 1:41. Swoistość i wrażliwość kliniczna Próbki dające wynik pozytywny w teście INOVA ANA ELISA Grupa pacjentów Całkowita liczba # % Zdrowi ochotnicy % Pacjenci zdefiniowani klinicznie SLE % Zespół Sjögrena % Twardzina % Pacjenci zdefiniowani pod względem antygenowym* % * Przebadano od 4 do 9 próbek zawierających przeciwciała przeciwko SS-A, SS-B, Sm, RNP, ScL-70, Jo-1, chromatynie, rybosomalnemu białku P i M2. Przebadano również próbki dające pozytywne wyniki w testach immunofluorescencji lub Western blot na obecność przeciwciał przeciwko centromerom, koilinie P-80, jąderkom i PCNA. W oparciu o powyższe badanie stwierdzono, że wrażliwość kliniczna testu ANA ELISA dla SLE wynosi 93% a swoistość kliniczna - 91%. Odsetek próbek od pacjentów z SLE wskazujących na obecność ANA zgodny jest z danymi z literatury. 1-4 Należy zauważyć, że niektórzy z tych pacjentów w momencie, w którym pobierano surowice leczeni byli kortykosteroidami. Wiadomo, że u pacjentów z zespołem Sjögrena i twardziną test IFA na obecność ANA daje wynik pozytywny. Co interesujące, liczba próbek dających wynik fałszywie pozytywny w teście ELISA w populacji osób zdrowych była znacznie mniejsza niż ta, którą obserwowano przy zastosowaniu testu IFA z wykorzystaniem komórek HEp-2, która ogólnie wynosi 20-30%. 11,12 Precyzja i powtarzalność W ramach badania W celu wyznaczenia precyzji w ramach badania dla testu QUANTA Lite ANA ELISA, przebadano 5 próbek 12 razy na jednej płytce ELISA. Wyniki przedstawiono w tabeli poniżej. Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Średnio 31 U 51 U 54 U 144 U 172 U SD 1,3 3,4 6,0 9,6 6,5 CV 4 % 7 % 11 % 7 % 4 % Pomiędzy badaniami W celu wyznaczenia precyzji pomiędzy badaniami badano 4 pozytywne próbki i 1 silnie negatywną jeden raz dziennie w ciągu 6 dni. Wyniki przedstawiono w tabeli poniżej. Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Średnio 16 U 27 U 31 U 47 U 160 U SD 1,6 2,4 2,2 5,1 22,6 CV 10 % 9 % 7 % 11 % 14 % 7

8 Piśmiennictwo 1. Von Muhlen CA and Tan EM: Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum 24: (1995). 2. Tan EM: Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv Immunol 44: (1989). 3. Van Venrooj WJ and Maini RN, editors: Manual of Biological Markers of Disease, section B: Autoantigens. Kluwer Academic Publishing, Boston (1994). 4. Tan EM, et al: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 25: (1982). 5. Jaskowski TD, et al: Screening for antinuclear antibodies by enzyme immunoassay. Am J Clin Pathol 105: (1996). 6. Woodruff E and O Neil L: Clinical significance of antinuclear antibodies: comparison of detection with immunofluorescence and enzyme-linked immunosorbent assays. Arth Rheum 40: (1997). 7. Carey JL: Enzyme immunoassays for antinuclear antibodies. Clin Lab Med 17: (1997). 8. Homburger HA, et al: Detection of antinuclear antibodies: comparative evaluation of enzyme immunoassay and indirect immunofluorescence methods. Arch Pathol Lab Med 122: (1998). 9. Gniewek RA, et al: Comparison of antinuclear antibody testing methods: immunofluorescence assay versus enzyme immunoassay. Clin Diagn Lab Immunol 4: (1997). 10. Vlachoyiannopoulos PG, et al: Clinical features and evolution of antinuclear antibody positive individuals in a rheumatology outpatient clinic. J Rheumatol 25: (1998). 11. Tan EM, et al: Range of antinuclear antibodies in healthy individuals. Arthritis Rheum 40: (1997). 12. Lipscomb MF, et al: Comparison of substrates for the detection of antinuclear antibodies in normals and in patients with connective tissue and other diseases. Diagn Immunol 2: (1984). 13. Amoura Z, et al: The key role of nucleosomes in lupus. Arthritis Rheum 42: (1999). 14. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. QUANTA Lite i NOVA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Maju 2011 Wersja 0 8