5,6. Włączenie badania na przeciwciała IgG jest istotne,

Transkrypt

1 QUANTA Lite Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka R h-ttg IgG ELISA Przeznaczenie To badanie jest przeznaczone do pomiaru in-vitro swoistych autoprzeciwciał IgG przeciw transglutaminazie tkankowej (ttg) obecnej w ludzkiej surowicy, jako pomoc w diagnozowaniu celiakii. Dostarczany jest materiał wystarczający na uzyskanie maksymalnie 41 próbek z duplikatem lub 89 próbek pojedynczych, z krzywą kalibracji i 2 kontrolami. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Celiakia odznacza się brakiem tolerancji glutenu, co prowadzi do przewlekłego zespołu złego wchłaniania na skutek zapalenia błony śluzowej przewodu pokarmowego i spłaszczenia nabłonka 1. Zweryfikowane kryteria 2 diagnozy celiakii, zgodnie z Europejskim Towarzystwem Gastroenterologii Pediatrycznej i Żywienia (ESPGAN) z 1990, wymagają identyfikacji pojedynczej pozytywnej biopsji jelita razem z wykazaniem przynajmniej dwóch z trzech autoprzeciwciał IgA wyszczególnionych poniżej: przeciwciała IgA przeciwko endomysium 3, przeciwciała IgG i IgA przeciwko gliadynie 4 i przeciwciała przeciwko retikulinie. Liczne badania wykazały, że testy IgA przeciwko śródmięsnej wykazują swoistość powyżej 99% w przypadku celiakii przy wyższej czułości niż badania przeciw retikulinie 5,6. Włączenie badania na przeciwciała IgG jest istotne, ponieważ typowi pacjenci z celiakią mają niedobór IgA, co przyczynia się do fałszywych ujemnych wyników u osób z potwierdzeniem za pomocą biopsji jelita 7, 8. Użycie rekombinowanej ludzkiej transglutaminazy tkankowej jako źródła antygenu zostało przedstawione w materiałach referencyjnych 9 i 10, a ocena transglutaminazy tkankowej jako wybranego antygenu została przedstawiona w materiałach referencyjnych 11 i 12. Zasada badania Mikrodołki są wstępnie pokryte rekombinowanym ludzkim antygenem ttg, antygen został wyprodukowany w komórkach bakulowirusa, a ekspresja wykorzystała kodowanie cdna dla długiej połączonej izoformy ludzkiego ttg. Kalibratory, kontrole i rozcieńczone próbki pobrane od pacjenta są dodawane do dołków, a przeciwciała rozpoznające antygen ttg wiążą go podczas pierwszej inkubacji. Po płukaniu dołków w celu usunięcia wszystkich niezwiązanych białek, dodawany jest oczyszczony koniugat kozi przeciw-ludzkiego IgG peroksydazy. Koniugat wiąże się z wychwyconym ludzkim autoprzeciwciałem, a nadmiar niezwiązanego koniugatu jest usuwany dzięki kolejnemu etapowi płukania. Związany koniugat uwidacznia się za pomocą substratu 3,3,5,5 -tetrametylobenzydyny (TMB), który daje niebieski produkt reakcji. Jego intensywność jest proporcjonalna do stężenia autoprzeciwciał w próbce. W celu zatrzymania reakcji do każdego dołka dodawany jest kwas siarkowy. Powoduje to uzyskanie żółtego zabarwienia końcowego, które jest odczytywane przy długości fali 450 nm. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym antygenem rekombinowanym (12-1 x 8 dołków), z uchwytem, w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Negatywna kontrola ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał IgG na ttg, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 3. Kalibratora A ELISA R h-ttg IgG, 1 fiolek buforu zawierającego środek konserwujący i ludzkie przeciwciała 4. Kalibratora B ELISA R h-ttg IgG, 1 fiolka buforu zawierającego środek konserwujący i ludzkie przeciwciała 5. Kalibratora C ELISA R h-ttg IgG, 1 fiolka buforu zawierającego środek konserwujący i ludzkie przeciwciała 6. Kalibratora D ELISA R h-ttg IgG, 1 fiolka buforu zawierającego środek konserwujący i ludzkie przeciwciała 7. Kalibratora E ELISA R h-ttg IgG, 1 fiolka buforu zawierającego środek konserwujący i ludzkie przeciwciała 8. Pozytywna kontrola R h-ttg IgG, 1 fiolka buforu zawierającego środek konserwujący i ludzkie przeciwciała 9. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 2 fiolek zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 10. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 11. Koniugat HRP R h-ttg IgG, przeciwciała przeciw ludzkiemu IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 12. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 13. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0.344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W związku z tym, kontrola R h-ttg IgG, kalibratory R h-ttg IgG od A do E oraz kontrola negatywna ELISA powinny być obsługiwane w taki sam sposób, jak potencjalnie zakaźny materiał. 14 1

2 3. Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Ten produkt może być używany wyłącznie przez odpowiednio przeszkolony personel. 3. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. Wszelkie odchylenia mogą wpłynąć na procedurę testu i wyniki badania. Należy zwrócić uwagę na określone uwagi i ostrzeżenia zamieszczone w tej instrukcji obsługi. 4. Numery serii kalibratora, kontroli, koniugatu i płytki nie są zamienne. Zastąpienie takiego elementu numerem serii, który różni się od podanego w zestawie może spowodować niespójne i nieprawidłowe wyniki. Wszystkie płytki muszą być wzięte z tej samej torebki foliowej. 5. Aby uniknąć zanieczyszczenia odczynnika, należy stosować wyłącznie nowe lub czyste naczynia szklane/plastikowe. Nie wolno wlewać niewykorzystanych odczynników z powrotemdo butelek. 6. Nie pozostawiać otwartych butelek z odczynnikiem. Odparowanie lub zanieczyszczenie spowoduje niespójność wyników. 7. Chromogen TMB nie może być narażony na działanie światła lub wody. 8. Nie używać skażonej bakteryjnie, hemolizowanej lub lipemicznej surowicy ani próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia. 9. Nie można sprawdzić niedokładnego rozcieńczenia próbek, ponieważ kontrole zestawu są gotowe do użycia. Zalecane jest stosowanie skalibrowanych pipet i odpowiednich próbek wewnętrznej QC. 10. Użycie zautomatyzowanych systemów analitycznych, naczyń do rozcieńczania próbek lub innych zautomatyzowanych przyrządów może skutkować rozbieżnością wyników w porównaniu do ręcznej procedury. Odpowiedzialnością każdego z laboratoriów jest pełne zatwierdzenie systemu i dopilnowanie, aby wyniki mieściły się w limitach zdefiniowanych w tym dokumencie oraz powiązanym ateście QC. Atest QC. 11. Wszystkie używane przyrządy muszą być kalibrowane i obsługiwane zgodnie z instrukcjami producenta. Warunki przechowywania 1. Zestaw powinien być przechowywany w temperaturze 2 8 C i nie wolno go zamrażać. Nieodpowiednie temperatury przechowywania będą mieć wpływ na wyniki. 2. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. 3. Termin ważności zestawu jest podany na zewnętrznej etykiecie. Pobieranie próbek 1. Próbki krwi powinny być pobierane poprzez wkłucie dożylne, powinny w naturalny sposób skrzepnąć, a surowica powinna zostać oddzielona. 2. Surowica przed analizą może być przechowywana w temperaturze 2 8 C do 7 dni 13 lub dłużej, jeśli zostanie podzielona i będzie przechowywana w temperaturze -20 C lub niższej. 3. Należy unikać wielokrotnego rozmrażania i zamrażania. 4. Próbki surowicy nie powinny być inaktywowane ciepłem, ponieważ może to dać fałszywie pozytywne wyniki. Badanie Dostarczone materiały Broszura z instrukcjami: Zawiera wszystkie szczegóły badania. Atest QC: Przedstawia oczekiwane wyniki serii. Dołki pokryte ludzką transglutaminazą: 12 rozłączanych 8-dołkowych pasków z rekombinowanym ttg. Każda płytka jest pakowana w torebkę foliową z zamknięciem strunowym, która zawiera dwa woreczki z osuszaczem. Rozcieńczalnik do próbek HRP: 2 butelek zawierających 50 ml buforu do rozcieńczania próbek. Barwa różowa, gotowe do użycia. Koncentrat do płukania HRP: 1 butelka zawierająca 25 ml 40-krotnie stężonego buforu do płukania dołków. Kalibratory R h-ttg IgG: 5 butelek, każda zawierająca 1,2 ml rozcieńczonej surowicy ludzkiej, z następującymi stężeniami autoprzeciwciał IgG przeciwko ttg: 100, 33,3, 11,1, 3,7, 1,23 U/ml. Gotowe do użycia. Pozytywna kontrola R h-ttg IgG: 1 butelka zawierająca 1,2 ml rozcieńczonej surowicy ludzkiej. Oczekiwana wartość jest podana na ateście QC. Gotowe do użycia. 2

3 Kontrola Negatywna ELISA: 1 butelka zawierająca 1,2 ml rozcieńczonej surowicy ludzkiej. Oczekiwana wartość jest podana na ateście QC. Gotowe do użycia. Koniugat HRP R h-ttg IgG: 1 butelka zawierająca 10 ml przeciwciał przeciwko ludzkiemu IgG oczyszczonych peroksydazą. Barwa niebieska. Gotowe do użycia. Chromogen TMB: 1 butelka zawierająca 10 ml chromogenu TMB. Gotowe do użycia. Roztwór zatrzymujący: 1 butelka zawierająca 10 ml kwasu siarkowego 0,344M. Gotowe do użycia. Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Automatyczna myjka do płytek z mikropłytkami: Zalecane, ale płukanie płytek może również być wykonywane ręcznie. Czytnik płytek: Umożliwia pomiar gęstości optycznej przy długości fali 450 nm z odniesieniem powietrznym. Woda destylowana lub dejonizowana: Powinna być najwyższej możliwej jakości Skalibrowane mikropipety: Do dozowania 1000, 100 i 10 µl Pipeta wielokanałowa: Zalecana do dozowania 100 µl koniugatu, substratu i roztworu zatrzymującego. Probówki szklane/plastikowe: Do roztworów próbek Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić zestaw do temperatury pokojowej Zestaw jest przeznaczony do pracy w temperaturze pokojowej (20 24 C). Wyjąć zestaw z miejsca przechowywania i pozostawić w temperaturze pokojowej na około 60 minut. Dołków nie wolno wyjmować z torebki foliowej, dopóki nie osiągną temperatury pokojowej. Uwaga: Zestawy mogą znajdować się w temperaturze pokojowej maks. przez 1 tydzień. 2. Zawartość zestawu Lekko wymieszać każdy składnik zestawu przed użyciem. 3. Roztwór buforu do płukania Dodać 25 ml koncentratu buforu do płukania do 975 ml wody destylowanej (roztwór 1:40) do czystego naczynia i wymieszać. Uwaga: Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C, w związku z tym należy rozcieńczać jedynie odpowiednią ilość. Jeśli bufor ma jakiekolwiek oznaki zanieczyszczenia bakteryjnego lub staje się mętny, należy go wylać i przygotować świeży roztwór. 4. Roztwór próbki Rozcieńczyć 10 µl każdej próbki z 1000 µl rozcieńczalnika do próbek (1:101) i dobrze wymieszać. Uwaga: Rozcieńczona próbka musi być użyta w ciągu 8 godzin. 5. Obsługa paska i ramki Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Ustawić od dołka A1, napełniając kolumny na płytce od lewej do prawej. Podczas wykonywania czynności z płytką należy ścisnąć długie krawędzie ramki, aby uniknąć wypadnięcia dołków. Uwaga: Umieścić jak najszybciej nieużyte dołki w torebce foliowej wraz z dwiema torebkami z osuszaczem i dobrze zamknąć torebkę, aby ograniczyć kontakt z wilgocią. Należy zwrócić uwagę, aby nie rozerwać lub przekłuć torebki foliowej, patrz poniżej. OSTRZEŻENIE: Narażenie dołków na działanie wilgoci lub zanieczyszczenie przez kurz lub inne widoczne zanieczyszczenia spowoduje degradację antygenu, co spowoduje niski poziom precyzji badania i potencjalnie uzyskanie fałszywych wyników. Procedura badania Należy zachować tę samą sekwencję dozowania w całym badaniu. 1. Dodawanie próbki Dodać 100 µl każdego kalibratora, kontroli i rozcieńczonej próbki (1:101) do odpowiednich dołków dostarczonej płytki. Uwaga: Próbki powinny być jak najszybciej umieszczone na płytce, aby ograniczyć odchylenia badania, a po dodaniu ostatniej próbki należy włączyć stoper.inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. 2. Płukanie Procedura płukania jest kluczowym elementem i wymaga szczególnej uwagi. Nieprawidłowo wypłukana płytka da niedokładne wyniki o niskim poziomie precyzji i wysokim poziomie tła. Po inkubacji wyjąć płytę i wypłukać dołki 3 razy przy użyciu µl buforu do płukania na każdy dołek. Wypłukać płytkę za pomocą automatycznej myjki do płytek lub ręcznie, zgodnie z poniższymi wskazówkami. Po przeprowadzeniu końcowego zautomatyzowanego płukania należy odwrócić płytkę i strzepnąć dołki do sucha na bibułę. Płytki można płukać ręcznie w następujący sposób: a. Usunąć zawartość płytki do zlewu. b. Strzepnąć dołki do sucha nad bibułą. c. Napełnić każdy dołek µl buforu do płukania za pomocą pipety wielokanałowej. d. Delikatnie potrząsnąć płytką na płaskiej powierzchni. e. Powtórzyć etapy od a do d dwa razy. f. Powtórzyć etap a i b. 3. Dodawanie koniugatu Dodać 100 µl koniugatu do każdego dołka, osuszyć bibułą górną część dołków, aby usunąć zachlapania. Uwaga: Aby uniknąć zanieczyszczenia, nie wolno umieszczać koniugatu z powrotem w butelce z odczynnikiem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. 4. Płukanie Powtórzyć etap 2. 3

4 5. Dodawanie chromogenu (TMB) Wlać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka, osuszyć bibułą górną część dołków, aby usunąć zachlapania. Uwaga: Aby uniknąć zanieczyszczenia, nie wolno umieszczać nadmiaru TMB z powrotem w butelce z odczynnikiem. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. 6. Zatrzymywanie Wlać 100 µl roztworu zatrzymującego do każdego dołka. Spowoduje to zmianę barwy z niebieskiej na żółtą. 7. Pomiar gęstości optycznej Odczytać gęstość optyczną (OD) każdego dołka przy długości fali 450 nm na czytniku mikropłytek, w ciągu 30 minut od zatrzymania reakcji. Kontrola jakości 1. Kontrola jakości Aby analiza była prawidłowa, muszą zostać spełnione następujące kryteria. Kalibratory oraz kontrole pozytywne i negatywne muszą być uwzględnione w każdej serii. Wartości uzyskane dla kontroli pozytywnych i negatywnych powinny mieścić się w zakresach podanych w ateście QC. Kształt krzywej powinien być podobny do krzywej kalibracji, która jest przedstawiona na ateście QC. Jeśli powyższe kryteria nie są spełnione, analiza będzie nieprawidłowa i należy powtórzyć test. Obliczyć średnie gęstości optyczne (tylko w przypadku badań prowadzonych w formie zdublowanej) W przypadku każdego kalibratora, kontroli i próbki należy obliczyć średnią gęstość optyczną (OD) zdublowanych odczytów. Funkcja Procentowy współczynnik zmienności (% CV) dla każdej gęstości optycznej duplikatu poniżej wynosić mniej niż 15%. 2. Nanieść krzywą kalibracji Krzywa kalibracji może być naniesiona automatycznie lub ręcznie: nanosząc stężenie autoprzeciwciał IgG przeciw ttg na skali logarytmicznej w odniesieniu do gęstości optycznej na skali liniowej dla każdego kalibratora: Automatycznie użyć odpowiednio zatwierdzonego oprogramowania oraz dopasowania krzywej, które najlepiej pasuje do danych. Ręcznie na papierze logarytmicznym/milimetrowym nanieść płynną krzywą przechodzącą przez punkty (ale nie prostą linię od punktu do punktu). 3. Postępowanie w przypadku nietypowych punktów Jeśli jakiś punkt nie leży na krzywej, można go usunąć. Jeśli brak tego punktu spowoduje, że krzywa przybierze kształt nieprzypominający krzywą kalibracji próbki lub jeśli więcej niż jeden punkt okaże się nietypowy, badanie należy powtórzyć. 4. Obliczanie wartości kontrolnych Odczytać poziom autoprzeciwciała IgG przeciwko ttg z krzywej kalibracji. Wartości powinny mieścić się w zakresach określonych w ateście QC. 5. Obliczanie poziomów autoprzeciwciał w rozcieńczonych próbkach Odczytać poziom autoprzeciwciał IgG przeciwko ttg w rozcieńczonych próbkach bezpośrednio z krzywej kalibracji. Uwaga: Wartości kalibratora zostały ustawione przez współczynnik 100, co stanowi roztwór próbki 1:101 i w związku z tym nie są wymagane dalsze konwersje. 6. Kalibracja badania Badanie jest kalibrowane w U/ml zgodnie z kalibratorem dowolnego odniesienia, ponieważ obecnie nie ma dostępnych żadnych międzynarodowych danych odniesienia. Ograniczenia badania 1. Ten zestaw służy wyłącznie do wspomagania diagnozy. Wynik pozytywny sugeruje określone choroby, które muszą być potwierdzone badaniami klinicznymi oraz innymi testami serologicznymi. 2. Wyniki uzyskane w ramach tego badania nie są dowodem diagnostycznym na obecność lub nieobecność choroby. 3. Stosowanie tego badania oraz zakresu normalnego (interpretacja wyników) nie zostało zatwierdzone dla próbek pediatrycznych. 4. Wynik negatywny nie wyklucza celiakii i próbki powinny być również przebadane pod kątem przeciwciał IgA przeciwko ttg. Spodziewane wartości Zakres normalny został określona na podstawie surowicy pochodzącej od 200 normalnych dorosłych krwiodawców. Te zakresy podano jedynie w celach orientacyjnych. Badania ELISA są bardzo wrażliwe i umożliwiają wykrycie niewielkich różnic w populacjach próbek. Zalecane jest, aby każde laboratorium określiło własny zakres normalny, na podstawie stosowanych technik i przyrządów populacyjnych. INTERPRETACJA WYNIKÓW Negatywny <6 U/ml Słabo pozytywna Pozytywna 6 10 U/ml >9 U/ml 4

5 Charakterystyka wyników Precyzja Precyzja w obrębie badania została zmierzona za pomocą sześciu próbek w zakresie krzywej kalibracji. Wartość % CV dla każdej próbki została podana poniżej: PRECYZJA W OBRĘBIE BADANIA n=20 Stężenie (U/ml) CV % Próbka 1 4,5 5,7 Próbka 2 7,5 5,3 Próbka 3 13,5 5,2 Próbka 4 21,9 3,5 Próbka 5 29,3 4,3 Próbka 6 87,9 5,2 Precyzja pomiędzy badaniami została zmierzona przy użyciu sześciu próbek przetestowanych sześć razy jako duplikaty przez trzy dni. Wartość % CV dla każdej próbki została podana poniżej: PRECYZJA POMIĘDZY BADANIAMI n=6 Stężenie (U/ml) CV % Próbka 1 4,3 10,1 Próbka 2 7,8 8,8 Próbka 3 14,4 6,9 Próbka 4 23,7 11,0 Próbka 5 31,9 7,6 Próbka 6 82,2 9,3 CZUŁOŚĆ ANALITYCZNA Czułość badania 1,23 U/ml została potwierdzona przez przebadanie dwóch próbek w wielu powtórzeniach z wartościami 1.4- i 2.2-krotności najniższego punktu kalibratora (1,23 U/ml). Analiza statystyczna testem t Studenta potwierdziła, że te próbki znacznie różniły się między sobą (p<0,0001). ZAKRES POMIAROWY Zakres pomiarowy badania wynosi 1, U/ml. Normalny zakres Poziomy autoprzeciwciał IgG przeciwko ttg były mierzone w surowicy pochodzącej od 200 zdrowych dorosłych dawców krwi. Na podstawie interpretacji wyników wg wytycznych, 0/200 było pozytywnych dla autoprzeciwciał IgG przeciwko ttg. Oprócz tego, 40 próbek pochodzących od pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna (n=21) oraz wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy (n=19) wykazało wynik negatywny w badaniu na autoprzeciwciała IgG przeciwko ttg. Swoistość, czułość, zgodność względna Czułość i zgodność względna zostały ustalone na podstawie wyniku biopsji przy użyciu 35 surowic od pacjentów z celiakią. Biopsja BINDAZYME Anti-IgG ttg EIA a b Czułość względna 78,8% Zgodność względna 74,3% a. 1 z 2 była sklasyfikowana jako słabo pozytywna. b. 2/7 również negatywne z IFA, 5/7 negatywne z alternatywnym zestawem ELISA. Względna swoistość, czułość i zgodność zostały określone na podstawie badania ttg przeciwko IgA i IgG przy użyciu 56 próbek testowych od dawców z potwierdzoną celiakią na podstawie biopsji i od zdrowych dawców krwi. 5

6 BINDAZYME Anti-IgG ttg EIA BINDAZYME EIA ttg przeciwko IgG a b Czułość względna 77,5% Swoistość względna 87,5% Zgodność względna 80,4% a. Pozytywne IgG, negatywne IgA, jedna próbka pochodziła od pacjenta ze znanym niedoborem IgA, stan IgA w przypadku drugiej próbki był nieznany. Użycie badania IgG ttg umożliwia wykrycie tych próbek. b. 8/9 próbek dało wynik silnie pozytywny IgA ttg, a 1/9 próbka dała wynik słabo pozytywny, potwierdzając, że tylko odsetek pacjentów wytwarza przeciwciała IgA. Substancje interferujące Zakres substancji interferujących został wprowadzony do negatywnym i pozytywnym próbkom IgG przeciwko ttg, które następnie zostały przebadane. Metoda użyta do sprawdzenia tych substancji opierała się na Sprawdzaniu Interferencji A plus -Kokusai Shiyaku, Japonia. Substancja Stężenie Bilirubina F (niezwiązana) 19,3 mg/dl Bilirubina C (koniugat) 19,9mg/dl Hemoglobina hemolizowana 485mg/dl Mlecz 1550 jednostek Czynnik reumatoidalny 45 IU/ml Nie stwierdzono interferencji w przypadku żadnej badanej próbki. Liniowość badania Trzy próbki zostały przebadane pod kątem liniowości w zakresie kalibracji, współczynnik regresji R 2 był większy niż w porównaniu z rzeczywistymi i spodziewanymi wartościami w U/ml i średnia wyzdrowienia wynosiła 92%. Badania prozone Trzy pozytywne zostały rozcieńczone 1:6,25 w rozcieńczalniku do próbek (normalny roztwór 1:100) w celu zbadania możliwych efektów prozone. Wszystkie próbki uległy odpowiedniemu rozcieńczeniu, nie stwierdzono żadnych fałszywie negatywnych wartości przy najniższych roztworach próbki i w związku z tym nie stwierdzono efektu prozone. Szablon płytki A B C D E F G H Podsumowanie badania 1. Dodać 100 µl każdego kalibratora, kontroli i rozcieńczonej próbki 1:101 do odpowiednich dołków. Inkubować przez 30 minut. Wypłukać. 2. Dodać 100 µl koniugatu do każdego dołka. Inkubować przez 30 minut. Wypłukać. 3. Dodać 100 µl substratu do każdego dołka. Inkubować przez 30 minut. 4. Dodać 100 µl roztworu zatrzymującego do każdego dołka. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm. 6

7 Piśmiennictwo 1. Trier, JS. Celiac Sprue. The New England Journal of Medicine 1991; 24: Walker Smith J A et al. Revised criteria for the diagnosis of celiac disease: Report of working group of European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN). Arch Diseases of Childhood. 1990; 65: Valdermarsson T et al. Is small bowel biopsy necessary in adults with suspected celiac disease and IgA anti-endomysial antibodies? 100% positive predictive value for celiac disease in adults. Digestive Diseases and Science. 1996; 41: Bürgin-Wolff et al. Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Archives of Disease in Childhood 1991; 66: Volta U et al. IgA anti-endomysial antibody test: A step forward in celiac disease screening. Digestive Diseases and Science. 1991; 36: Grodzinsky E. Hed J, Skogh T. IgA anti-endomysial antibodies have a high predictive value for celiac disease in asymptomatic patients. Allergy. 1994; 49: Collin P et al. Selective IgA deficiency and coeliac disease. Scand J. Gastroenterol 1992; 27(5), Cataldo F. et al. IgG 1 antiendomysium and IgG anti-tissue Transglutaminase (anti-ttg) antibodies in coeliac patients with selective IgA deficiency. Gut. 2000; 47: Sulkane S et al. Tissue Transglutaminase Autoantibody Enzyme linked Immunosorbent Assay in detecting Celiac Disease. Gastroenterology. 1998; 115: Sollid LM and Scott H. New tool to predict Celiac Disease on its Way to the Clinics. Gastroenterology. 1998; 115: Dieterich W et al. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of Celiac Disease. Nature Medicine. 1997; 3: Dieterich W et al. Autoantibodies to Tissue Transglutaminase as Predictors of Celiac Disease. Gastroenterology. 1998; 115: Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 7

8 QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Czerwiec 2011 Wersja 1 8