QUANTA Lite Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka. C1q CIC ELISA

Transkrypt

1 QUANTA Lite Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka C1q CIC ELISA Przeznaczenie To badanie jest przeznaczone do pomiaru in-vitro krążących kompleksów odpornościowych (CIC), które wiążą C1q występujące w ludzkiej surowicy. Badanie to służy do określania obecności CIC w surowicy pacjentów z różnymi chorobami autoagresyjnymi oraz innych chorobami związanymi z CIC i jest ono stosowane w powiązaniu z innymi wynikami klinicznymi. Dostarczany jest materiał wystarczający na uzyskanie maksymalnie 41 próbek z duplikatem lub 89 próbek pojedynczych, z krzywą kalibracji oraz pozytywną i negatywną kontrolą. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Interakcje pomiędzy antygenami i przeciwciałami mogą powodować powstawanie kompleksów odpornościowych. Jest to standardowa i ciąga funkcja immunologiczna organizmu. Antygeny mogą być osadzone w tkance lub mogą poruszać się swobodnie w osoczu lub innych płynach ustrojowych, tworząc krążące kompleksy odpornościowe. Z reguły CIC są usuwane bezboleśnie przez układ siateczkowośródbłonkowy. Jednak duże pokłady kompleksów odpornościowych w strukturach naczyniowych z następczą aktywacją szlaków zapalnych, takich jak kaskada układu dopełniacza, mogą doprowadzić do stanu chorobowego kompleksu odpornościowego z towarzyszącym uszkodzeniem tkanki. Przeznaczenie tych kompleksów zależy od wielu zmiennych, w tym od natury antygenu i klasy przeciwciał, rozmiaru kompleksu, ich wartości produkcji oraz spójności funkcjonalnej układu fagocytarnego. Ze względu na patogeniczną rolę CIC w wielu chorobach, zostały opracowane specjalne metody umożliwiające ich wykrywanie. Wykorzystują one specyficzne fizykochemiczne właściwości CIC oraz ich umiejętność do przyłączania się do powierzchni komórek, np. komórek Raji oraz płytek krwi albo cząsteczek takich jak C1q 1, 2, 3. W rzeczywistości badania Światowej Organizacji Zdrowia zalecają przeprowadzanie pomiarów CIC z użyciem przynajmniej dwóch odmiennych metod badawczych Pomiar stężeń surowicy CIC wiążącej C1q w ramach ELISA jest prognostycznie istotny 5. Jest on szczególnie istotny do monitorowania poziomów CIC u pacjentów z toczeniem rumieniowatym układowym, gdzie poziomy różnią się w zależności od aktywności choroby oraz upośledzonych odpowiedzi dopełniacza 6. Zasada badania Mikrodołki są wstępnie pokryte oczyszczonym ludzkim C1q. Kalibratory, kontrole i rozcieńczone próbki pobrane od pacjenta są dodawane do dołków, a kompleksy odpornościowe C1q są przyłączane przez C1q podczas pierwszej inkubacji. Po płukaniu dołków w celu usunięcia wszystkich niezwiązanych białek, dodawany jest oczyszczony koniugat kozi przeciw-ludzkiego IgG peroksydazy. Koniugat wiąże się z wychwyconym kompleksem odpornościowym, a nadmiar niezwiązanego koniugatu jest usuwany dzięki kolejnemu etapowi płukania. Związany koniugat uwidacznia się za pomocą substratu 3,3,5,5 -tetrametylobenzydyny (TMB), który daje niebieski produkt reakcji. Jego intensywność jest proporcjonalna do stężenia autoprzeciwciał w próbce. W celu zatrzymania reakcji do każdego dołka dodawany jest kwas siarkowy. Powoduje to uzyskanie żółtego zabarwienia końcowego, które jest odczytywane przy długości fali 450 nm. Stężenie CIC w próbce jest odczytywane z krzywej kalibracji, a wyniki są wyrażane jako skupione odpowiedniki ludzkiego IgG na ml (μg Eq/ml). Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta ludzkim antygenem C1q (12-1 x 8 dołków), z uchwytem, w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Negatywna kontrola ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko C1q, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Kalibrator C1q CIC ELISA A, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i skupione ludzkie IgG 4. Kalibrator C1q CIC ELISA B, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i skupione ludzkie IgG 5. Kalibrator C1q CIC ELISA C, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i skupione ludzkie IgG 6. Kalibrator C1q CIC ELISA D, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i skupione ludzkie IgG 7. Kalibrator C1q CIC ELISA E, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i skupione ludzkie IgG 8. Kontrola pozytywna C1q CIC, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i skupione ludzkie IgG 9. Rozcieńczalnik do próbek typu III, 2 fiolki barwa żółta, zawierający Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 10. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS,Tween 20 oraz konserwant, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 4. 1

2 11. Koniugat HRP C1q CIC IgG, 1 fiolka barwa niebieska, zawierająca bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 12. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 13. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0.344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. Rozcieńczalnik do próbek zawiera Proclin 150. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W związku z tym, kontrola pozytywna C1q CIC, kalibratory C1q CIC od A do E oraz kontrola negatywna ELISA powinny być obsługiwane w taki sam sposób, jak potencjalnie 8 zakaźny materiał. 3. Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP C1q CIC IgG zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Ten produkt może być używany wyłącznie przez odpowiednio przeszkolony personel. 3. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. Wszelkie odchylenia mogą wpłynąć na procedurę testu i wyniki badania. Należy zwrócić uwagę na określone 'uwagi i ostrzeżenia zamieszczone w tej instrukcji obsługi. 4. Odczynniki z innych numerów serii zestawów NIE są wymienne między sobą. W przypadku wykonywania dużej liczby testów należy dopilnować, aby wszystkie odczynniki pochodziły z TEJ SAMEJ serii. Wszystkie używane płytki muszą być wyjęte z tej samej torebki foliowej. Zastąpienie jakiegokolwiek komponentu może prowadzić do nieprawidłowych wyników. 5. Aby uniknąć zanieczyszczenia odczynnika, należy stosować wyłącznie nowe lub czyste naczynia szklane/plastikowe. Nie wolno wlewać nieużytych odczynników z powrotem do butelek. 6. Nie pozostawiać otwartych butelek z odczynnikiem. Odparowanie lub zanieczyszczenie spowoduje niespójność wyników. 7. Substrat TMB nie może być narażony na działanie światła lub wody. 8. Nie używać skażonej bakteryjnie, hemolizowanej lub lipemicznej surowicy ani próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia. 9. Nie można sprawdzić niedokładnego rozcieńczenia próbek, ponieważ kontrole zestawu są gotowe do użycia. Zalecane jest stosowanie skalibrowanych pipet i odpowiednich próbek wewnętrznej QC. 10. Użycie zautomatyzowanych systemów analitycznych, naczyń do rozcieńczania próbek lub innych zautomatyzowanych przyrządów może skutkować rozbieżnością wyników w porównaniu do ręcznej procedury. Obowiązkiem laboratorium jest pełne zatwierdzenie systemu i dopilnowanie, aby wyniki mieściły się w limitach zdefiniowanych w tym dokumencie oraz powiązanym ateście QC. 11. Wszystkie używane przyrządy muszą być kalibrowane i obsługiwane zgodnie z instrukcjami producenta. Warunki przechowywania 1. Zestaw powinien być przechowywany w temperaturze 2 8 C i nie wolno go zamrażać. Nieodpowiednie temperatury przechowywania będą mieć wpływ na wyniki. 2. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. 3. Termin ważności zestawu jest podany na zewnętrznej etykiecie. 2

3 Pobieranie próbek 1. Próbki krwi powinny być pobierane poprzez wkłucie dożylne, powinny w naturalny sposób skrzepnąć, a surowica powinna zostać oddzielona. 2. Surowica przed analizą może być przechowywana w temperaturze 2 8 C do 7 dni 7 lub dłużej, jeśli zostanie podzielona i będzie przechowywana w temperaturze -20 C lub niższej. 3. Należy unikać wielokrotnego rozmrażania i zamrażania. 4. Próbki surowicy nie powinny być inaktywowane ciepłem, ponieważ może to dać fałszywie pozytywne wyniki. Badanie Dostarczone materiały Broszura z instrukcjami: Zawiera wszystkie szczegóły badania. Atest QC: Przedstawia oczekiwane wyniki serii. Dołki pokryte C1q: 12 rozłączanych 8-dołkowych pasków pokrytych ludzkimi C1q. Każda płytka jest pakowana w torebkę foliową z zamknięciem strunowym, która zawiera dwa woreczki z osuszaczem. Kontrola Negatywna ELISA: 1 butelka zawierająca 1,2 ml rozcieńczonej surowicy ludzkiej. Oczekiwana wartość jest podana na ateście QC. Gotowe do użycia. Kalibratory C1q CIC: 5 butelek, każda zawierająca 1,2 ml rozcieńczonego skupionego ludzkiego IgG, z następującymi stężeniami kompleksu odpornościowego: 100, 33,3, 11,1, 3,7, 1,23 µg Eq/ml. Gotowe do użycia. Kontrola pozytywna C1q CIC: 1 butelka zawierająca 1,2 ml rozcieńczonego skupionego ludzkiego IgG. Oczekiwana wartość jest podana na ateście QC. Gotowe do użycia. Rozcieńczalnik do próbek typu III: 2 butelek zawierających 50 ml buforu do rozcieńczania próbek. Barwa żółta, gotowe do użycia. Koncentrat do płukania HRP: 1 butelka zawierająca 25 ml 40-krotnie stężonego buforu do płukania dołków. Koniugat HRP C1q CIC IgG: 1 butelka zawierająca 10 ml przeciwciał przeciwko ludzkiemu IgG oczyszczonych peroksydazą. Barwa niebieska. Gotowe do użycia. Chromogen TMB: 1 butelka zawierająca 10 ml chromogenu TMB. Gotowe do użycia. Roztwór zatrzymujący HRP: 1 butelka zawierająca 10 ml kwasu siarkowego 0,344M. Gotowe do użycia. Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Automatyczna myjka do płytek z mikropłytkami: Zalecane, ale płukanie płytek może również być wykonywane ręcznie. Czytnik płytek: Umożliwia pomiar gęstości optycznej przy długości fali 450 nm z odniesieniem powietrznym. Woda destylowana lub dejonizowana: Powinna być najwyższej możliwej jakości Skalibrowane mikropipety: Do dozowania 1000, 100 i 10 µl Pipeta wielokanałowa: Zalecana do dozowania 100 µl koniugatu, substratu i roztworu zatrzymującego. Probówki szklane/plastikowe: Do roztworów próbek Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić zestaw do temperatury pokojowej Zestaw jest przeznaczony do pracy w temperaturze pokojowej (20 24 C). Wyjąć zestaw z miejsca przechowywania i pozostawić w temperaturze pokojowej na około 60 minut. Dołków nie wolno wyjmować z torebki foliowej, dopóki nie osiągną temperatury pokojowej. 2. Zawartość zestawu Lekko wymieszać każdy składnik zestawu przed użyciem. 3. Roztwór buforu do płukania (koncentrat 40x) Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej.jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 4. Rozcieńczanie próbki Rozcieńczyć 10 µl każdej próbki z 1000 µl rozcieńczalnika do próbek (1:101) i dobrze wymieszać. Uwaga: Rozcieńczona próbka musi być użyta w ciągu 8 godzin. 3

4 5. Obsługa paska i ramki Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Ustawić od dołka A1, napełniając kolumny na płytce od lewej do prawej. Podczas wykonywania czynności z płytką należy ścisnąć długie krawędzie ramki, aby uniknąć wypadnięcia dołków. Uwaga: Umieścić jak najszybciej nieużyte dołki w torebce foliowej wraz z dwiema torebkami z osuszaczem i dobrze zamknąć torebkę, aby ograniczyć kontakt z wilgocią. Należy zwrócić uwagę, aby nie rozerwać lub przekłuć torebki foliowej, patrz poniżej. OSTRZEŻENIE: Narażenie dołków na działanie wilgoci lub zanieczyszczenie przez kurz lub inne widoczne zanieczyszczenia spowoduje degradację antygenu, co spowoduje niski poziom precyzji badania i potencjalnie uzyskanie fałszywych wyników. Procedura badania 1. Dodawanie próbki Dodać 100 µl kalibratora, kontroli badania i rozcieńczonej próbki (1:101) do odpowiednich dołków dostarczonej płytki. Uwaga: Próbki powinny być jak najszybciej umieszczone na płytce, aby ograniczyć odchylenia badania, a po dodaniu ostatniej próbki należy włączyć stoper.inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. 2. Płukanie Procedura płukania jest kluczowym elementem i wymaga szczególnej uwagi. Nieprawidłowo wypłukana płytka da niedokładne wyniki o niskim poziomie precyzji i wysokim poziomie tła. Po inkubacji wyjąć płytę i wypłukać dołki 3 razy przy użyciu µl buforu do płukania na każdy dołek. Wypłukać płytkę za pomocą automatycznej myjki do płytek lub ręcznie, zgodnie z poniższymi wskazówkami. Po przeprowadzeniu końcowego zautomatyzowanego płukania należy odwrócić płytkę i strzepnąć dołki do sucha na bibułę. Płytki można płukać ręcznie w następujący sposób: a. Usunąć zawartość płytki do zlewu. b. Strzepnąć dołki do sucha nad bibułą. c. Napełnić każdy dołek µl buforu do płukania za pomocą pipety wielokanałowej. d. Delikatnie potrząsnąć płytką na płaskiej powierzchni. e. Powtórzyć etapy od a do d dwa razy. f. Powtórzyć etap a i b. 3. Dodawanie koniugatu Dodać 100 µl koniugatu do każdego dołka, osuszyć bibułą górną część dołków, aby usunąć zachlapania.uwaga: Aby uniknąć zanieczyszczenia, nie wolno umieszczać koniugatu z powrotem w butelce z odczynnikiem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. 4. Płukanie Powtórzyć etap Dodawanie substratu (TMB) Wlać 100 µl substratu TMB do każdego dołka, osuszyć bibułą górną część dołków, aby usunąć zachlapania.uwaga: Aby uniknąć zanieczyszczenia, nie wolno umieszczać nadmiaru TMB z powrotem w butelce z odczynnikiem. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. 6. Zatrzymywanie Wlać 100 µl roztworu zatrzymującego do każdego dołka. Spowoduje to zmianę barwy z niebieskiej na żółtą. 7. Pomiar gęstości optycznej Odczytać gęstość optyczną (OD) każdego dołka przy długości fali 450 nm na czytniku mikropłytek, w ciągu 30 minut od zatrzymania reakcji. Kontrola jakości 1. Kontrola jakości Aby analiza była prawidłowa, muszą zostać spełnione następujące kryteria. Kalibratory oraz kontrole pozytywne i negatywne muszą być uwzględnione w każdej serii. Wartości uzyskane dla wszystkich kontroli powinny mieścić się w zakresach podanych w ateście QC. Kształt krzywej powinien być podobny do krzywej kalibracji, która jest przedstawiona na ateście QC. Jeśli powyższe kryteria nie są spełnione, analiza będzie nieprawidłowa i należy powtórzyć test. 2. Obliczyć średnie gęstości optyczne (tylko w przypadku badań prowadzonych w formie zdublowanej) W przypadku każdego kalibratora, kontroli i próbki należy obliczyć średnią gęstość optyczną (OD) zdublowanych odczytów. Funkcja Procentowy współczynnik zmienności (% CV) dla każdej gęstości optycznej duplikatu poniżej wynosić mniej niż 15%. 3. Nanieść krzywą kalibracji Krzywa kalibracji może być naniesiona automatycznie lub ręcznie: nanosząc stężenie kompleksu odpornościowego w µg Eq/ml na skali logarytmicznej w odniesieniu do gęstości optycznej na skali liniowej dla każdego kalibrator: Automatycznie użyć odpowiednio zatwierdzonego oprogramowania oraz dopasowania krzywej, które najlepiej pasuje do danych. Ręcznie na papierze logarytmicznym/milimetrowym nanieść płynną krzywą przechodzącą przez punkty (ale nie prostą linię od punktu do punktu). 4

5 4. Postępowanie w przypadku nietypowych punktów Jeśli jakiś punkt nie leży na krzywej, można go usunąć. Jeśli brak tego punktu spowoduje, że krzywa przybierze kształt nieprzypominający krzywą kalibracji próbki lub jeśli więcej niż jeden punkt okaże się nietypowy, badanie należy powtórzyć. 5. Obliczanie poziomów CIC w kontrolach i próbkach Odczytać poziom wiązania kompleksu odpornościowego w kontrolach i rozcieńczonych próbkach bezpośrednio zkrzywa kalibracji. Wartości powinny mieścić się w zakresie określonym w ateście QC. Uwaga: wartości kalibratora zostały ustawione przez współczynnik 100, co stanowi roztwór próbki 1:101.Dalsze korekcje nie są wymagane. 6. Kalibracja badania Badanie jest skalibrowane w µg Eq/ml przy użyciu wewnętrznych kalibratorów odniesienia, których wartości były przydzielone w badaniu skalibrowanym za pomocą referencyjnego skupionego preparatu ludzkiego IgG WHO. Ograniczenia badania 1. Ten zestaw służy wyłącznie do wspomagania diagnozy. Wynik pozytywny sugeruje określone choroby, które muszą być potwierdzone badaniami klinicznymi oraz innymi testami serologicznymi. 2. Wyniki uzyskane w ramach tego badania nie są dowodem diagnostycznym na obecność lub nieobecność choroby. 3. Należy zwrócić uwagę, że surowica może zawierać substancje interferujące, takie jak odczynniki chelatujące, DNA, autoprzeciwciała przeciwko C1q, czynnik reumatoidalny lub immunoglobulinę monomeryczną. Spodziewane wartości Standardowy zakres został określony przy użyciu surowicy pochodzącej od 200 zdrowych dorosłych dawców krwi i zostały uzyskane następujące wartości wyrażone w odpowiedniku μg na ml (μg Eq/ml). Poniższe zakresy podano jedynie w celach orientacyjnych. Badania ELISA są bardzo wrażliwe i umożliwiają wykrycie niewielkich różnic w populacjach próbek. Zalecane jest, aby każde laboratorium określiło własny zakres normalny, na podstawie stosowanych technik i przyrządów populacyjnych. Spodziewane wartości < 4,4 µg Eq/ml wynik negatywny 4,4 - < 10,8 µg Eq/ml Niejednoznaczne 10,8 µg Eq/ml Wynik pozytywny Normalny zakres Poziomy C1q-CIC zostały zbadane w surowicy pochodzącej od 200 zdrowych krwiodawców, a wyniki zostały przedstawione na poniższym wykresie. C1q-CIC znajdują się sporadycznie u normalnej populacji na skutek infekcji i mogą być również zwiększane po jedzeniu. Aby uzyskać logiczną wartość graniczną dla prawdziwych zdrowych, zwiększone próbki zostały wyeliminowane przez trzy cykle iteracyjne. Dzięki temu wartość graniczna wynosi 4,4 µg Eq/ml. Zakres niejednoznaczny został ustawiony pomiędzy 4,4 i 10,8 µg Eq/ml, gdzie wartości pozytywne wynoszą 10,8 µg Eq/ml. Na tej podstawie 9/200 zdrowych próbek wykazało pozytywny wynik z wartościami pomiędzy 11,6 13,5µg Eq/ml. Ten zakres normalny został podany jedynie w celach orientacyjnych. Zalecane jest, aby każde laboratorium samodzielnie ustaliło swój zakres normalny. 5

6 Charakterystyka wyników Precyzja Precyzja w obrębie badania oraz pomiędzy badaniami została zmierzona za pomocą trzech próbek w zakresie badania. Poniżej została podana wartość średnia i % CV dla każdej próbki: PRECYZJA POMIĘDZY BADANIAMI n=3 Stężenie (μg Eq/ml) % CV Próbka 1 5,4 13,0 Próbka 2 28,7 7,1 Próbka 3 50,7 3,9 PRECYZJA W OBRĘBIE BADANIA n=16 Stężenie (μg Eq/ml) % CV Próbka 4 5,3 7,2 Próbka 5 24,0 5,5 Próbka 6 67,4 7,5 Wrażliwość analityczna Czułość została określona jako średnie stężenie + 2 SD wykazane przez 20 wskazań rozcieńczonej próbki i została uzyskana wartość 0,1 μg Eq/ml. Specyficzność, wrażliwość, zgodność względna Względna swoistość, czułość i zgodność zostały ustalone na podstawie alternatywnego zestawu CIC- C1q EIA, przy użyciu 48 próbek testowych, w tym 29 próbek od dorosłych dawców krwi i 12 od pacjentów z potwierdzonym SLE. Alternatywna EIA + Niejednoznaczna BINDAZYME Niejednoznaczna C1q-CIC EIA Wrażliwość względna 95,0% Swoistość względna 75,0% Zgodność względna 83,3% W przypadku obliczania względnej czułości, swoistości i zgodności wartości niejednoznaczne są traktowane jako pozytywne. Współzależność wartości z dwóch zestawów wykazała R 2 wynoszące 0,80. Substancje interferujące Negatywne i pozytywne próbki CIC wiążącego C1q zostały przebadane w celu sprawdzenia możliwego efektu substancji interferujących. Metoda użyta do sprawdzenia tych substancji opierała się na zestawie sprawdzania Interferencji A plus -Kokusai Shiyaku, Japonia. Substancja Bilirubina F (niezwiązana) Bilirubina C (koniugat) Hemoglobina hemolizowana Mlecz Czynnik reumatoidalny Stężenie 18,3mg/dl 19,0mg/dl 490mg/dl 1930 jednostek 500 IU/ml Nie stwierdzono interferencji przy wyższych stężeniach bilirubiny, hemoglobiny lub mleczu. Jednak czynnik reumatoidalny (RF) wprowadza interferencje i próbki, co do których istnieje podejrzenie, że zawierają czynnik reumatoidalny, przed określaniem C1q CIC, powinny być przebadane przy użyciu odpowiedniego testu. Zakres pomiarowy Zakres pomiarowy tego zestawu wynosił 1,23-100µg Eq/ml. 6

7 Szablon płytki A B C D E F G H Podsumowanie badania 1. Dodać 100 µl każdego kalibratora, kontroli i rozcieńczonej próbki 1:101 do odpowiednich dołków. Inkubować przez 30 minut. Wypłukać. 2. Dodać 100 µl koniugatu do każdego dołka. Inkubować przez 30 minut. Wypłukać. 3. Dodać 100 µl substratu do każdego dołka. Inkubować przez 30 minut. 4. Dodać 100 µl roztworu zatrzymującego do każdego dołka. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm 7

8 Piśmiennictwo 1. Hay FC et al.: Routine assay for the detection of immune complexes of known immunoglobulin class using solid phase C1q. Clin. Exp. Immunol., 1976; 24: Stanilova SA, Slavov ES: Comparative study of circulating immune complexes quantity detection by three assays - CIF-ELISA, C1q-ELISA and anti-c3 ELISA. J. Immunol. Meth, 2001; 253: Van Hoeyveld E, Bossuyt X: Evaluation of seven commercial ELISA kits compared with the C1q solidphase binding RIA for detection of circulating immune complexes. Clin. Chem, 2000; 46: Lambert PH: WHO collaborative study for the evaluation of immune complexes in serum. Clin Lab Immunol., 1978; 1: Espinoza LR and Osterland CK.: Circulating immune complexes. Their clinical significance. Future publishing Co., Abrass CK et al.: Correlation and Predictive Accuracy of Circulating Immune Complexes with Disease Activity in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum., 1980; 23: Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Czerwiec 2012 Wersja 1 8