QUANTA Flash RNP Do diagnostyki in vitro PRZEZNACZONY TYLKO NA EKSPORT. NIE JEST PRZEZNACZONY DO SPRZEDAŻY W STANACH ZJEDNOCZONYCH.

Transkrypt

1 QUANTA Flash RNP Do diagnostyki in vitro PRZEZNACZONY TYLKO NA EKSPORT. NIE JEST PRZEZNACZONY DO SPRZEDAŻY W STANACH ZJEDNOCZONYCH. Przeznaczenie QUANTA Flash RNP to test chemiluminescencji (CIA) do półilościowego oznaczania przeciwciał przeciwko rybonukleoproteinie (RNP) w surowicy człowieka w analizatorze BIO-FLASH. Obecność przeciwciał anty-rnp może być stosowana w połączeniu z objawami klinicznymi i innymi badaniami laboratoryjnymi może wspomóc diagnostykę tocznia rumieniowatego układowego i powiązanych chorób tkanki łącznej. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) występują w różnorodnych chorobach tkanki łącznej i jako takie stanowią wrażliwy obiekt badania przesiewowego. 1 Surowice ANA-pozytywne reagują z różnymi antygenami jądrowymi, w tymi małymi rybonukleoproteinami jądrowymi (snrnp). snrnp to kompleksy RNA-białko, które łączą niemodyfikowane pre-mrna i różne białka tworząc spliceosom, duży kompleks molekularny RNAbiałko, po czym następuje splicing pre-mrna. snrnp składają się z małego jądrowego RNA (snrna) U1, U2, U4, U5 i U6 oraz grupy białek zwanych rybonukleoproteinami Sm, które razem tworzą stabilny rdzeń Sm kompleksu snrnp. 2,3 Rdzeń Sm kompleksu snrnp obejmuje białka B/B, D1, D2, D3, E, F i G. Przeciwciała anty-rnp reagują swoiście z U1 snrnp i często są określane mianem przeciwciał anty-u1 RNP. Antygeny do których wiążą się przeciwciała anty-u1 RNP to białko o masie 70 kda, białko A i białko C. 2,3 Jednak naturalny antygen U1-RNP zawiera nie tylko epitopy lub miejsca wiążące przeciwciało unikalne dla U1 RNP, ale zawiera także antygeny Sm; w konsekwencji podczas zgłaszania wyników anty-rnp trzeba rozważyć odpowiedź przeciwciał pacjenta wobec izolowanych antygenów Sm. Przeciwciała przeciwko antygenowi RNP występują średnio u 25% pacjentów cierpiących na toczeń rumieniowaty układowy, ale mogą także występować w przypadku innych chorób tkanki łącznej jak zespół Sjögrena, reumatoidalne zapalenie stawów, twardzina układowa i zapalenie wielomięśniowe. 3 5 Wysokie miana (izolowanych) przeciwciał anty-u1 RNP są bardzo charakterystyczne dla mieszanej choroby tkanki łącznej. 6 8 Przeciwciała przeciwko RNP wiążą się ze względnie łagodnym przebiegiem tocznia rumieniowatego układowego z rzadszym występowaniem chorób nerek i ośrodkowego układu nerwowego. 9 Do wykrywania przeciwciał przeciwko RNP stosowano wiele różnych metod, w tym podwójną dyfuzję Ouchterlony i test aglutynacji pasywnej. Opracowano także użyteczne klinicznie testy ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko RNP. QUANTA Flash RNP to wysoce selektywny immunologiczny test chemiluminescencji do wykrywania i pomiaru przeciwciał anty-rnp, który zapewnia półilościowe wyniki w szeroki zakresie pomiarowym z ułatwieniem losowego dostępu, ciągłego ładowania próbki i krótkim czasem oznaczania. 1

2 Zasady badania Natywnym oczyszczonym RNP opłaszcza się paramagnetyczne kulki, które przechowuje się we wkładzie z odczynnikiem w warunkach utrzymujących antygen w jego stanie reaktywnym. Gdy wkład do testu gotowy jest do pierwszego użycia, do probówki zawierającej zakonserwowane kulki dodaje się roztwór buforu i kulki miesza się z buforem. Następnie wkład z odczynnikiem umieszcza się w analizatorze BIO-FLASH. Analizator rozcieńcza próbkę surowicy pacjenta w jednorazowej plastikowej kuwetce. Małe ilości rozcieńczonej próbki surowicy pacjenta, kulki opłaszczone RNP i bufor testowy łączy się w drugiej kuwetce i miesza. Kuwetkę inkubuje się w temperaturze 37 C. Następnie kulki magnetyzuje się i kilkukrotnie płucze. Potem do kuwetki dodaje się przeciwciało przeciwludzkie IgG skoniugowane z izoluminolem i inkubuje w temperaturze 37 C. Ponownie kulki magnetyzuje się i kilkukrotnie płucze. Po dodaniu odczynników ( wyzwalaczy ) do kuwetki koniugat izoluminolu wywołuje luminescencję. Światło wyprodukowane w wyniku tej reakcji mierzy się w umownych jednostkach luminescencji (ang. Relative Light Units RLU) przy użyciu układu optycznego BIO-FLASH. Ilość jednostek RLU odpowiada ilości związanego koniugatu izoluminolu, co z kolei odpowiada ilości przeciwciał przeciwko RNP związanych z kulkami opłaszczonymi RNP. W teście QUANTA Flash RNP wykorzystuje się predefiniowaną, właściwą dla każdej serii testu, krzywą wzorcową (ang. Master Curve), którą analizator odczytuje z kodu kreskowego znajdującego się na wkładzie z odczynnikiem. W oparciu o wyniki uzyskane po oznaczeniu dwóch kalibratorów tworzy się właściwą dla analizatora krzywą roboczą (ang. Working Curve), którą oprogramowanie wykorzystuje do obliczenia liczby jednostek chemiluminescencji (CU) na bazie RLU otrzymanych dla każdej próbki. Odczynniki 1. Wkład z odczynnikiem QUANTA Flash RNP zawiera poniższe odczynniki wystarczające do przeprowadzenia 50 oznaczeń: a. Kulki paramagnetyczne opłaszczone RNP, zakonserwowane przed pierwszym użyciem. b. Bufor testowy zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwanty. c. Środek śledzący IgG przeciwciało przeciwludzkie IgG znakowane izoluminolem, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant. 2. Bufor do odtwarzania, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwanty. Ostrzeżenia 1. Bufor testowy zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%), która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 3. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 4. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. 2

3 Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Tego testu można używać jedynie z analizatorem BIO-FLASH. 3. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury odtwarzania. 4. Po otwarciu, wkład z odczynnikiem musi być przechowywany w karuzeli na odczynniki tego analizatora. Należy uważać, by nie rozlać odczynników w chwili, gdy wkład z odczynnikiem jest umieszczany w analizatorze po raz pierwszy. 5. Zanieczyszczenie chemiczne odczynników może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem analizatora. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, mogą spowodować zaburzenia w teście. Należy stosować się do zaleceń dotyczących procedury czyszczenia analizatora przedstawionych w podręczniku użytkownika BIO-FLASH. Warunki przechowywania 1. Nieotwarte wkłady z odczynnikami oraz bufor do odtwarzania przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Otwarte wkłady z odczynnikami należy przechowywać wewnątrz analizatora. Zachowują one stabilność przez 30 dni, a po tym czasie należy je usunąć. Oprogramowanie BIO-FLASH monitoruje datę przydatności do użycia wkładów oraz serii wkładów z odczynnikami. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Próbki zawierające do 10 mg/dl bilirubiny, 200 mg/dl hemoglobiny, 1000 mg/dl trójglicerydów, 224 mg/dl cholesterolu bądź 500 IU/ml czynnika reumatoidalnego IgM nie powodowały zakłóceń w teście QUANTA Flash RNP. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI H18-A4 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1. Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2. Jeżeli test nie zostanie zakończony w ciągu 8 godzin, próbki należy przechowywać w lodówce w temperaturze 2 8 C. 3. Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Procedura Dostarczone materiały 1 Wkład z odczynnikiem QUANTA Flash RNP 2 Bufor do odtwarzania 3 pipeta do przenoszenia 3

4 Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Analizator BIO-FLASH z obsługującym je komputerem Układ płuczący BIO-FLASH (Numer kat.: ) Wyzwalacze BIO-FLASH (Numer kat.: ) Kuwetki BIO-FLASH (Numer kat.: ) Kalibratory QUANTA Flash RNP (Numer kat.: ) Kontrole QUANTA Flash RNP (Numer kat.: ) Stosowanie analizatora chemiluminescencyjnego BIO-FLASH 1. Szczegółowe instrukcje odnośnie pracy z analizatorem chemiluminescencyjnym i oprogramowaniem BIO-FLASH można znaleźć w podręczniku użytkownika dołączonym do systemu BIO-FLASH. Dodatkowe informacje i pomoc związaną z wykrywaniem i usuwaniem usterek w testach można uzyskać, kontaktując się z działem pomocy technicznej firmy INOVA Diagnostics, Inc. dostępnym pod adresem i numerem telefonu podanym na końcu tej instrukcji. 2. W celu opróżnienia zbiornika na odpady stałe należy otworzyć szufladkę na odpady. Wyjąć zbiornik na odpady stałe i odpowiednio zutylizować zużyte kuwetki. Włożyć z powrotem zbiornik na odpady stałe, zamknąć szufladkę na odpady i kliknąć Yes (Tak) w oknie Empty Waste Drawer (Opróżnij szufladkę na odpady). 3. Aby wymienić wyzwalacze, należy kliknąć przycisk Bulks Inventory F9 (Wykaz materiałów masowych F9) (na górze po prawej stronie). a. Na ekranie Inventory Bulks (Wykaz Materiały masowe) kliknąć przycisk Triggers (Wyzwalacze) po lewej stronie. Zostanie wyświetlone nowe okno zatytułowane Add Triggers Remove old bottles (Dodaj wyzwalacze Wyjmij stare butelki). b. Otworzyć i wyjąć szufladkę na odpady analizatora BIO-FLASH. Zutylizować wszelkie kuwetki znajdujące się w szufladce na odpady. Kliknąć Yes (Tak) w oknie Empty Waste Drawer (Opróżnij szufladkę na odpady). Wyjąć butelki z wyzwalaczami z uchwytów i kliknąć Next (Dalej). Odkręcić stare butelki z wyzwalaczami i zastąpić je nowymi wyzwalaczami. Czynności należy wykonywać po kolei i odpowiednio dopasować oznaczone kolorem zakrętki (biały do białego, czerwony do czerwonego). c. Stosować się do instrukcji w nowym oknie Add Triggers Add Trigger 2 bottle (Dodaj wyzwalacze Dodaj butelkę z 2 wyzwalaczem). Po zaakceptowaniu kodu kreskowego, umieścić wyzwalacz 2 w uchwycie oznaczonym kolorem białym. Kliknąć Next (Dalej). d. Stosować się do instrukcji w oknie Add Triggers Add Trigger 1 bottle (Dodaj wyzwalacze Dodaj butelkę z 1 wyzwalaczem). Po zaakceptowaniu kodu kreskowego, umieścić wyzwalacz 1 w uchwycie oznaczonym kolorem czerwonym. Kliknąć Finish (Koniec). Włożyć z powrotem i zamknąć szufladkę na odpady. 4. Aby wymienić zbiornik układu płuczącego, należy kliknąć przycisk Bulks Inventory F9 (Wykaz materiałów masowych F9) (na górze po prawej stronie). Na ekranie Inventory Bulks (Materiały masowe wykaz) kliknąć przycisk Sys. Rinse (Układ płuczący). W nowym oknie Add System Rinse Remove bottles (Dodaj układ płuczący usuń butelki) kliknąć Next (Dalej). Stosować się do instrukcji w nowym oknie Add System Rinse Add bottle (Dodaj układ płuczący dodaj butelkę). Po zaakceptowaniu kodu kreskowego, kliknąć Finish (Koniec), jeśli będzie to konieczne. 5. W celu opróżnienia pojemnika na odpady płynne, na ekranie Inventory Bulks (Wykaz Materiały masowe) kliknąć przycisk Fluid Waste (Odpady płynne). Usunąć i zutylizować odpady płynne. Kliknąć Next (Dalej). Po zaakceptowaniu kodu kreskowego kliknąć Finish (Koniec). 4

5 Sposób przygotowania Przygotowanie wkładu z odczynnikiem Przy pierwszym użyciu wkładu z odczynnikiem, należy podjąć następujące kroki, by dokładnie umieścić wkład w analizatorze BIO-FLASH. Uwaga: Nie używać wkładu z odczynnikiem, jeśli widoczne są jakiekolwiek ślady uszkodzenia. 1. Umieścić wkład z odczynnikiem na stałym podłożu. Przytrzymać wkład z odczynnikiem w jednej dłoni. Drugą ręką zdecydowanym ruchem chwycić czerwony pasek zabezpieczający z tyłu wkładu z odczynnikiem i wyciągnąć go do końca. 2. Nacisnąć dwa paski po bokach przebijającej zatyczki (część szara) i nacisnąć górną część wkładu z odczynnikiem, aż zatrzaśnie się we właściwej pozycji zablokowania. Paski nie powinny być widoczne. NIE ODWRACAĆ OTWARTEGO WKŁADU. 3. Ponownie zawiesić mikrocząstki RNP: a. Otworzyć fiolkę z buforem odtwarzania i zebrać płyn dostarczoną pipetą. Zostanie użyta cała zawartość fiolki. b. Przesunąć drzwi w pokrywie wkładu z odczynnikiem do pozycji otwartej delikatnie naciskając na wąską stronę wkładu z odczynnikiem i utrzymywać je w takiej pozycji. W sposób analityczny przenieść całą zawartość fiolki do probówki z odczynnikiem zawierającym mikrocząstki przez jeden otwór na górze wkładu z odczynnikiem. c. Zmieszać zawartość probówki z odczynnikiem zawierającym mikrocząstki, zasysając i zawieszając płyn co najmniej 30 razy. Jeśli będą widoczne grudki kulek, należy kontynuować mieszanie roztworu przez kolejne 30 razy. Jeśli nie uda się odtworzyć zawiesiny mikrocząstek, NIE WOLNO UŻYWAĆ WKŁADU. d. Przed wyjęciem pipety z probówki i jej wyrzuceniem, należy upewnić się, że cały płyn został z niej usunięty. 4. Zdjąć naklejkę z górnej części wkładu z odczynnikiem, odsłaniając trzy otwory. 5. Umieścić wkład z odczynnikiem w dowolnym wolnym gnieździe karuzeli na odczynniki analizatora BIO-FLASH. 5

6 Kalibracja badania 1. Każda nowa seria wkładu z odczynnikiem musi zostać skalibrowana przed pierwszym użyciem. Oprogramowanie nie zezwoli na wykorzystanie nowej serii, dopóki nie zostanie skalibrowana. 2. Dokładne wskazówki, jak kalibrować wkład z odczynnikiem, można znaleźć w części zatytułowanej QUANTA Flash RNP Kalibratory w tej instrukcji. 3. Po zatwierdzeniu kalibracji skalibrowana seria wkładu z odczynnikiem jest gotowa do użycia. Programowanie i badanie próbek 1. Nacisnąć przycisk Worklist (Lista działań) na górze ekranu i wybrać przycisk Racks (Statywy) na dole. 2. Wybrać statyw z próbkami do badania, zaznaczając nazwę tego statywu na ekranie lub skanując kod kreskowy za pomocą ręcznego skanera kodów kreskowych. Zeskanować lub wpisać nazwę próbki, wybrać typ próbki, typ pojemnika (probówka/kubeczek) i wybrać opcję RNP z panelu testu. Powtórzyć te kroki dla wszystkich próbek. 3. Umieścić próbki w wybranych pozycjach na statywie na próbki i umieścić go na karuzeli na próbki analizatora. 4. Gdy wszystkie wymagane substancje znajdują się w analizatorze, na górze ekranu zostanie wyświetlona zielona ikona start. Aby rozpocząć badanie, należy nacisnąć ikonę Start F4 (Rozpocznij F4). Kontrola jakości Kontrole testu QUANTA Flash RNP (sprzedawane oddzielnie INOVA, numer produktu ) obejmują zarówno pozytywną, jak i negatywną kontrolę h-rnp. Szczegółowe wskazówki dotyczące metody wprowadzania do oprogramowania wszystkich wymaganych informacji dla każdej kontroli, jak również metody badania kontroli, można znaleźć w części zatytułowanej Kontrole QUANTA Flash RNP instrukcji. Kontrole należy stosować jednokrotnie każdego dnia używania testu, jednak użytkownicy powinni również wziąć pod uwagę krajowe/lokalne wymagania. Obliczanie wyników W INOVA dla każdej nowej serii testu QUANTA Flash RNP tworzona jest pięciopunktowa krzywa wzorcowa. Ta czteroparametryczna krzywa logarytmiczna jest zakodowana w kodzie paskowym każdego wkładu z odczynnikiem. Po skalibrowaniu wkładu z odczynnikiem do przekształcenia jednostek RLU w CU zostanie wykorzystana krzywa robocza właściwa dla analizatora. Reaktywność przeciwciała względem RNP może być następnie sklasyfikowana przy użyciu poniższej tabeli. Reaktywność CU Negatywna <20 Pozytywna 20 Reaktywność w CU jest bezpośrednio związana z mianem przeciwciał w próbce pochodzącej od pacjenta. Wzrosty i spadki stężeń autoprzeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku CU, która to zmiana jest proporcjonalna do ilości przeciwciał. Analityczny zakres pomiarowy (AMR) testu wynosi od 3,5 CU do 643,8 CU. Jeśli próbka od pacjenta da wynik mniejszy niż 3,5 CU, wówczas system BIO-FLASH zaraportuje go jako <3,5 CU. Ponieważ wartość ta jest mniejsza niż 20 CU, wynik ten uznawany jest za negatywny. Jeśli próbka od pacjenta daje wynik większy niż 643,8 CU, wówczas system BIO-FLASH zgłosi go jako >643,8 CU. Wynik ten uznawany jest za pozytywny. Oprogramowanie BIO-FLASH udostępnia opcję automatycznego ponownego przeprowadzenia badania. Po wybraniu tej opcji, analizator automatycznie przebada ponownie każdą próbkę, która dała wynik >643,8 CU, rozcieńczając ją 10-krotnie i obliczając aktualną wartość CU z zastosowaniem współczynnika dodatkowego rozcieńczania. 6

7 Interpretacja wyników Test QUANTA Flash może wykrywać małe różnice w populacjach pacjentów. Każde laboratorium powinno zweryfikować dostarczony przez producenta zakres odniesienia i może ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych kontroli i populacji pacjentów, zgodnie z indywidualnie ustalonymi procedurami. Zaleca się, by wyniki zgłaszane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki uzyskano przy zastosowaniu immunologicznego testu chemiluminescencji INOVA QUANTA Flash RNP. Nie można stosować zamiennie wartości uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego autoprzeciwciała nie zawsze może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Nie u wszystkich pacjentów z SLE występują przeciwciała przeciwko przeciwciałom anty- RNP. 2. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 3. Nieprawidłowe odtworzenie kulek opłaszczonych RNP może doprowadzić do uzyskania niższych wartości niż w przypadku, gdyby kulki odtworzono w sposób prawidłowy. 4. Charakterystyka wyników tego testu nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Zakres odniesienie Wartość odcięcia oznaczenia została określona przez badanie zestawu szkoleniowego 281 scharakteryzowanych klinicznie próbek obejmujących 253 próbki od pacjentów odniesienia oraz 26 próbek od pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym. Wartość odcięcia ustalono przy >99 percentylu wyników uzyskanych dla pacjentów odniesienia i przypisano wartość 20 CU. Spodziewane wartości Stężenia autoprzeciwciał anty-rnp analizowano za pomocą testu QUANTA Flash RNP na panelu 101 zdrowych krwiodawców (71 kobiet/30 mężczyzn w wieku od 18 do 55 lat ze średnią i medianą wieku wynoszącą 34 lata). Przy wartości odcięcia 20 CU jedna (1%) próbka była pozytywna w teście QUANTA Flash RNP. Średnie stężenie wynosiło 5,7 CU, a wartości wahały się od <3,5 do 196,8 CU. Czułość i swoistość kliniczna W badaniu walidacji klinicznej użyto łącznie 350 próbek obejmujących 146 próbek od pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym z dwóch różnych kohort oraz 4 próbki od pacjentów z mieszaną chorobą tkanki łącznej. Jako kontrolę dołączono 130 próbek pochodzących od pacjentów z chorobami reumatycznymi, 2 próbki od pacjentów z autoimmunologiczną chorobą wątroby i 30 od pacjentów z różnymi przeciwciałami chorób zakaźnych. Dodatkowo analizowano 38 próbek odniesienia z College of American Pathologists (CAP) i United Kingdom National External Quality Assessment Service (UKNEQAS), które stosowano jedynie w badaniu porównania metody. Czułość i swoistość kliniczna wobec tocznia rumieniowatego układowego i mieszanej choroby tkanki łącznej (n=150) przy użyciu populacji kontrolnej (n=162) obliczono w tabeli poniżej: 7

8 Czułość i swoistość kliniczna testu ELISA QUANTA RNP wobec tocznia rumieniowatego układowego i mieszanej choroby tkanki łącznej: Analiza kliniczna N=312 QUANTA Flash RNP Toczeń rumieniowaty układowy/ mieszana choroba tkanki łącznej Rozpoznanie Nie toczeń rumieniowaty układowy/ mieszana choroba tkanki łącznej Łącznie Pozytywny 46 7* 53 Negatywny Łącznie Analiza (95% ufności) Czułość = 30,7% (23,4-38,7%) Swoistość = 95,7% (91,3 98,2%) * Sześć próbek od pacjentów z rozpoznaną twardziną było wysoce pozytywne zarówno w teście CIA jaki i predykatowym teście EIA. Siódma próbka pochodziła od pacjenta HIV+. Dystrybucja użytych w badaniu walidacyjnym populacji kontrolnych choroby: Grupa pacjentów N Negatywny Pozytywny Autoimmunologiczna choroba wątroby Twardzina Zespół Sjögrena Reumatoidalne zapalenie stawów Inna układowa choroba reumatyczna Wirusowe zapalenie wątroby HIV Kiła Łącznie Porównanie metody z zastosowaniem analizatora predykatywnego Próbki do przeprowadzenia analizy porównawczej metody obejmowały próbki z badania walidacji klinicznej (pacjenci z toczniem rumieniowatym układowym, mieszaną chorobą tkanki łącznej, innymi chorobami, próbki odniesienia i krwiodawców), których wyniki mieściły się w analitycznym zakresie pomiarowym. Próbki te badano zarówno przy użyciu testu QUANTA Flash RNP, jak i predykatowego testu ELISA. Porównanie metody (N=173) QUANTA Flash RNP CIA RNP ELISA Negatywny Pozytywny Łącznie Negatywny Pozytywny Łącznie Zgodność procentowa (95% ufności) Zgodność wyników pozytywnych = 86,7% (75,4 94,1%) Zgodność wyników negatywnych = 94,7% (88,8 98,0%) Zgodność łączna = 91,9% (86,8 95,5%) 8

9 Precyzja i powtarzalność Wydajność wewnątrzoznaczeniowa była oceniana przez oznaczenie w jednej serii 6 próbek w 10 powtórzeniach i dane przedstawiono poniżej. Wydajność wewnątrzoznaczeniowa testu QUANTA Flash RNP Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Próbka 6 Średnia CU SD 0,5 0,7 0,9 1,5 13,1 3,9 % CV 2,2% 2,2% 1,3% 2,3% 3,5% 1,6% Wydajność międzyoznaczeniowa była oceniana przez oznaczenie w powtórzeniach 6 próbek w dwóch seriach dziennie (jedna rano i jedna popołudniu) przez 3 dni i dane przedstawiono poniżej. Wydajność międzyoznaczeniowa testu QUANTA Flash RNP Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Próbka 6 Średnia CU SD 0,8 1,4 4,3 3,4 19,6 16,5 % CV 3,5% 4,2% 5,8% 5,1% 4,9% 6,1% Granice wykrywania; liniowy i analityczny zakres pomiarowy Według CLSI EP17-A dolna granica wykrywania dla tego testu wynosi w przybliżeniu 1129 RLU, wartości, która znajduje się zdecydowanie poniżej dolnej granicy analitycznego zakresu pomiarowego (3,5 CU). Cały zgłaszany analityczny zakres pomiarowy, od 3,5 CU do 643,8 CU, jest liniowy. Badanie liniowości przeprowadzono zgodnie z CLSI EP6-A używając pięciu próbek o różnych stężeniach przeciwciał anty-rnp. Wszystkie pięć próbek wykazywało liniowość rozcieńczenia i połączone dane dawały następujące wyniki z regresją liniową: Próbka Zakres testu (CU) Nachylenie (95% CI) Przecięcie z osią Y (95% CI) R² 1 od 13,1 do 130,5 1,02 (od 0,98 do 1,06) -5,66 (od -8,84 do -2,48) 0,99 2 od 12,9 do 128,6 1,02 (od 0,98 do 1,06) -2,56 (od -5,37 do 0,25) 1,00 3 od 82,4 do 824,4 1,05 (od 1,01 do 1,09) 30,14 (od -52,06 do -8,22) 0,99 4 od 63,2 do 631,8 1,01 (od 0,98 do 1,05) 15,99 (od -29,12 do -2,86) 1,00 5 od 3,8 do 37,3 1,02 (od 0,97 do 1,08) 0,41 (od -0,88 do 1,69) 0,99 Dane połączone od 3,8 do 824,4 1,00 (od 0,99 do 1,01) -4,83 (od -8,30 do -1,35) 1,00 9

10 QUANTA Flash RNP Kalibratory Do diagnostyki in vitro Przeznaczenie Kalibratory QUANTA Flash RNP są przeznaczone do stosowania z testem chemiluminescencji (CIA) QUANTA Flash RNP w analizatorze BIO-FLASH. Każdy kalibrator ustala punkt odniesienia dla krzywej roboczej, którą wykorzystuje się do określenia ilości jednostek chemiluminescencji (CU) w pomiarach przeciwciał anty-rnp w surowicy. Podsumowanie i zasady badania W teście chemiluminescencji QUANTA Flash RNP wykorzystuje się predefiniowaną, właściwą dla każdej serii testu, krzywą wzorcową (Master Curve), która zakodowana jest w kodzie kreskowym na wkładzie z odczynnikiem. Kalibratory QUANTA Flash RNP opracowano w celu uzyskania właściwej dla analizatora krzywej roboczej na bazie parametrów krzywej wzorcowej, przy czym punkt decyzji zależy od charakterystyki wydajności i oceny klinicznej QUANTA Flash RNP CIA. Przed oceną ich wartości kalibratory przebadano na wielu analizatorach z zastosowaniem wielu serii odczynników. Odczynniki 1. Kalibrator 1 QUANTA Flash RNP: Dwie (2) probówki opisane kodami kreskowymi zawierające 0,3 ml wstępnie rozcieńczonego odczynnika gotowego do użytku. Kalibratory zawierają ludzkie przeciwciała przeciwko RNP w buforze, stabilizatory oraz środki konserwujące. 2. Kalibrator 2 QUANTA Flash RNP: Dwie (2) probówki opisane kodami kreskowymi zawierające 0,3 ml wstępnie rozcieńczonego odczynnika gotowego do użytku. Kalibratory zawierają ludzkie przeciwciała przeciwko RNP w buforze, stabilizatory oraz środki konserwujące. Ostrzeżenia 1. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowaniu kalibratora dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu kalibratory QUANTA Flash RNP należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 3. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Kalibratory QUANTA Flash RNP przeznaczone są do zastosowania z testem QUANTA Flash RNP. 3. Nie przenosić kalibratorów do innych probówek. Kody kreskowe na probówkach wykorzystywane są przez analizator do dopasowania kalibratorów do odpowiedniego typu testu. 10

11 4. Po otwarciu probówki z kalibratorem można go stosować w przez okres do 8 godzin lub można go wykorzystać do 4 kalibracji, następnie odczynnik należy wyrzucić. 5. Zanieczyszczenie chemiczne odczynników może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem analizatora. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, mogą spowodować zaburzenia w teście. Należy stosować się do zaleceń dotyczących procedury czyszczenia analizatora przedstawionych w podręczniku użytkownika BIO-FLASH. Warunki przechowywania 1 Nieotwarte kalibratory przechowywać w temperaturze 2-8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Otwarte kalibratory należy wyrzucić po 8 godzinach. Procedura 1. Każda nowa seria wkładu z odczynnikiem musi zostać skalibrowana przed pierwszym użyciem. Oprogramowanie nie zezwoli na wykorzystanie nowej serii, dopóki nie zostanie skalibrowana. 2. Aby upewnić się, że kalibratory są homogeniczne, należy każdy z nich wymieszać. Należy unikać powstawania piany, ponieważ pęcherzyki mogą zaburzać wykrywanie poziomu płynu przez analizator. Zdjąć zatyczkę z każdej probówki zawierającej kalibrator i umieścić obie z nich w statywie na próbki, przy czym kody kreskowe muszą skierowane być przodem do szczelin w statywie. Umieścić statyw na próbki w karuzeli na próbki analizatora BIO-FLASH i zamknąć drzwiczki. Analizator odczyta kody kreskowe na probówkach zawierających kalibratory i zidentyfikuje potrzebny wkład z odczynnikiem. Szczegółowe instrukcje odnośnie pracy z analizatorem chemiluminescencyjnym i oprogramowaniem BIO-FLASH można znaleźć w podręczniku użytkownika dołączonym do systemu BIO-FLASH. 3. Analizator przebada każdy kalibrator w trzech powtórzeniach. Po przebadaniu kalibratorów oprogramowanie będzie wymagać zatwierdzenia kalibracji. Na ekranie Instrument Summary (Rejestr stanu analizatora) kliknąć przycisk strzałki Choose more options Ctrl-M ( ) (Wybierz więcej opcji Ctrl-M). Wybrać opcję Calibration Ctrl-F3 (Kalibracja Ctrl-F3). W oknie Calibration (Kalibracja) należy zaznaczyć odpowiedni test i kliknąć Details (Szczegóły). 4. W nowym oknie Calibration Details (Szczegóły kalibracji) należy wybrać rodzaj właśnie dokonanej kalibracji. Zostanie wyświetlona krzywa wzorcowa w formie linii przerywanej i nowa krzywa robocza w formie linii ciągłej. Jeśli wyniki kalibracji są ważne, wówczas na dole ekranu po lewej stronie zostanie wyświetlony przycisk zatwierdzenia. Należy kliknąć przycisk Validate Calibration (Waliduj kalibrację). 5. Po zwalidowaniu kalibracji skalibrowana seria wkładu z odczynnikiem jest gotowa do użycia. Zalecane jest, aby kontrole QUANTA RNP (sprzedawane oddzielnie nr produktu ) przebadać po uprzednim skalibrowaniu serii wkładu z odczynnikiem. 11

12 Identyfikowalność Nie ma dostępnej żadnej międzynarodowej surowicy referencyjnej dla przeciwciał anty-rnp, która umożliwia standaryzację testów przeciwciał anty-rnp. Zamiast tego zbadano surowicę referencyjną z Centrum Zwalczania i Zapobiegania Chorób (CDC) dla przeciwciał anty-rnp (przeciwciała anty- U1 RNP U1 małych jądrowych RNP IS2075 ANA nr 4) i stężenie określono na 643,8 CU. Ograniczenia Kalibratory te są przeznaczone do przeprowadzenia 4 kalibracji. Całkowity czas przez jaki probówki z kalibratorem mogą pozostawać otwarte w analizatorze wynosi 8 godzin. Jeśli kalibratory pozostaną otwarte w analizatorze przez dłuższy okres czasu, wówczas należy jej wyrzucić. Stosowanie tych samych probówek z kalibratorami do więcej niż 4 kalibracji i/lub przez czas dłuższy niż 8 godzin może skutkować nieprawidłową kalibracją testu, co z kolei może doprowadzić do uzyskania błędnych wyników. 12

13 QUANTA Flash RNP Kontrole Do diagnostyki in vitro Przeznaczenie Kontrole QUANTA Flash RNP przeznaczone są kontroli jakości zestawu do testu chemiluminescencji (CIA) QUANTA Flash RNP, który przeprowadza się w analizatorze BIO-FLASH. Podsumowanie i zasady badania W skład kontroli testu QUANTA Flash RNP wchodzi kontrola negatywna i kontrola pozytywna. Każda z nich zawiera inną ilość przeciwciał przeciw RNP. Kontrola negatywna ma za zadanie posłużyć do oceny precyzji i dokładności testu przy bardzo małych stężeniach autoprzeciwciał. Kontrola pozytywna ma za zadanie posłużyć do oceny precyzji i dokładności testu przy umiarkowanych i dużych stężeniach autoprzeciwciał. Odczynniki 1. Kontrola negatywna QUANTA Flash RNP: Dwie (2) probówki opisane kodami kreskowymi zawierające 0,5 ml odczynnika gotowego do użytku. Kontrole zawierają ludzkie przeciwciała przeciwko RNP w buforze, stabilizatory oraz środki konserwujące. 2. Kontrola pozytywna QUANTA Flash RNP: Dwie (2) probówki opisane kodami kreskowymi zawierające 0,5 ml odczynnika gotowego do użytku. Kontrole zawierają ludzkie przeciwciała przeciwko RNP w buforze, stabilizatory oraz środki konserwujące. Ostrzeżenia 1. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu kontrole QUANTA Flash RNP należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 3. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Kontrole QUANTA Flash RNP przeznaczone są do zastosowania z testem QUANTA Flash RNP. 3. Nie przenosić kontroli do innych probówek. Kody kreskowe na probówkach używane są przez analizator do identyfikacji kontroli. 4. Po otwarciu, każdą probówkę z kontrolą można używać do 15 razy, przy maksymalnym czasie przebywania w analizatorze wynoszącym 10 minut podczas jej wykorzystania. 5. Zanieczyszczenie chemiczne odczynników może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem analizatora. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, mogą spowodować zaburzenia w teście. Należy stosować się do zaleceń dotyczących procedury czyszczenia analizatora przedstawionych w podręczniku użytkownika BIO-FLASH. 13

14 Warunki przechowywania 1. Nieotwarte kontrole przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Po otwarciu, każdą probówkę z kontrolą można używać do 15 razy, przy maksymalnym czasie przebywania w analizatorze wynoszącym 10 minut podczas jej wykorzystania. Całkowity czas, przez jaki probówki z kontrolą mogą pozostawać otwarte w analizatorze wynosi 2,5 godz. lub 10 minut na wykorzystanie. Jeśli kontrole pozostaną w analizatorze otwarte, łącznie dłużej niż 2,5 godz., kontrole należy wyrzucić. Użytkowanie tych samych probówek z kontrolami ponad 15 razy i/lub przez czas dłuższy niż 2,5 godz. łącznie, może doprowadzić do otrzymania błędnych wyników. 3. Aby zapewnić odpowiednią stabilność, należy usunąć kontrole z systemu natychmiast po zbadaniu próbki i przechowywać je w temperaturze 2 8 C w zamkniętej oryginalnej fiolce. Procedura Tworzenie nowych materiałów KJ do badania RNP: 1. Przed pierwszym użyciem kontroli QUANTA Flash RNP w analizatorze, do oprogramowania należy wprowadzić nazwę, serię, datę przydatności do użycia, wartość (lub dawkę) oraz informację o docelowym odchyleniu standardowym. 2. Na ekranie Instrument Summary (Rejestr stanu analizatora) kliknąć przycisk strzałki Choose more options Ctrl-M ( ) (Wybierz więcej opcji Ctrl-M). Wybrać opcję QC Ctrl-F2 (KJ Ctrl-F2). Kliknąć przycisk New QC Material (Nowy materiał KJ). 3. Do każdego zestawu kontroli dołączony jest arkusz z danymi dotyczącymi tej właśnie serii. W pierwszej kolejności należy wprowadzić do oprogramowania nazwę, numer serii i datę ważności. Następnie kliknąć przycisk Add Assa y (Dodaj badanie). W nowym oknie należy zaznaczyć opcję Show All Assays (Pokaż wszystkie badania). Wybrać badanie RNP z listy i kliknąć Add (Dodaj). Na końcu należy wprowadzić docelową dawkę i docelowe odchylenie standardowe (SD). Kliknąć Save (Zapisz). Procedurę należy przeprowadzić dla obu kontroli. Tworzenie nowej serii dla istniejących materiałów KJ: 1. Przed pierwszym użyciem nowej serii kontroli QUANTA Flash RNP do oprogramowania należy wprowadzić serię, datę przydatności do użycia, wartość (lub dawkę) oraz informację o docelowym odchyleniu standardowym. 2. Na ekranie Instrument Summary (Rejestr stanu analizatora) kliknąć przycisk strzałki Choose more options Ctrl-M ( ) (Wybierz więcej opcji Ctrl-M). Wybrać opcję QC Ctrl-F2 (KJ Ctrl-F2). Zaznaczyć pozycję badanie RNP w kolumnie po lewej stronie. Następnie należy zaznaczyć odpowiedni materiał kontrolny po prawej stronie ( RNPN w przypadku kontroli negatywnej lub RNPN w przypadku kontroli pozytywnej). Kliknąć przycisk New QC Lot (Nowa seria QC). 3. Do każdego zestawu kontroli dołączony jest arkusz z danymi dotyczącymi tej właśnie serii. Wprowadzić informacje z tego arkusza do oprogramowania. Powinno to obejmować numer serii, datę przydatności do użycia, docelową dawkę oraz docelowe odchylenie standardowe. Jeśli to konieczne, kliknąć przycisk Add Assay (Dodaj badanie). W nowym oknie należy zaznaczyć opcję Show All Assays (Pokaż wszystkie badania). Wybrać badanie RNP z listy i kliknąć Add (Dodaj). Kliknąć Save (Zapisz). Procedurę należy przeprowadzić dla obu kontroli. Zalecane jest, aby kontrole QUANTA Flash RNP wykorzystywać jeden raz, każdego dnia kiedy używany jest test; jednak użytkownicy powinni także wziąć pod uwagę krajowe/lokalne wymagania. 14

15 Aby upewnić się, że kontrole są homogeniczne, należy każdą z nich wymieszać przed użyciem. Należy unikać powstawania piany, ponieważ pęcherzyki mogą zaburzać wykrywanie poziomu płynu przez analizator. Zdjąć zatyczkę z każdej probówki zawierającej kontrolę i umieścić obie z nich w statywie na próbki, przy czym kody kreskowe muszą skierowane być przodem do szczelin w statywie. Umieścić statyw na próbki w karuzeli na próbki analizatora BIO-FLASH i zamknąć drzwiczki. Analizator odczyta kody kreskowe na probówkach zawierających kontrole i zidentyfikuje potrzebny wkład z odczynnikiem. Szczegółowe instrukcje odnośnie pracy z analizatorem chemiluminescencyjnym i oprogramowaniem BIO-FLASH można znaleźć w podręczniku użytkownika dołączonym do systemu BIO-FLASH. Identyfikowalność Nie ma dostępnej żadnej międzynarodowej surowicy referencyjnej dla przeciwciał anty-rnp, która umożliwia standaryzację testów przeciwciał anty-rnp. Zamiast tego zbadano surowicę referencyjną z Centrum Zwalczania i Zapobiegania Chorób (CDC) dla przeciwciał anty-rnp (przeciwciała anty- U1 RNP U1 małych jądrowych RNP IS2075 ANA nr 4) i stężenie określono na 643,8 CU. Ograniczenia Kontrole te można wykorzystać 15 razy. Na etykiecie każdej probówki z kontrolą znajduje się szereg 15 pól, które można skreślać, aby śledzić ile razy kontrola została użyta. Całkowity czas, przez jaki probówki z kontrolą mogą pozostawać otwarte w analizatorze wynosi 2,5 godz. lub 10 minut na wykorzystanie. Jeśli kontrole pozostaną otwarte w analizatorze przez dłuższy okres czasu, wówczas należy jej wyrzucić. Użytkowanie tych samych probówek z kontrolami ponad 15 razy i/lub przez czas dłuższy niż 2,5 godz.łącznie, może doprowadzić do uzyskania błędnych wyników. 15

16 Piśmiennictwo 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 1982, 33: Migliorini P, Baldini C, Rocchi V, Bombardieri S: An ti-sm and anti-rnp antibodies. Autoimmunity. 2005, 38(1): Benito-Garcia E, Schur PH, Lahita R: American College of Rheumatology Ad Hoc Committee on Immunologic Testing Guidelines. Guidelines for immunologic laboratory testing in the rheumatic diseases: anti-sm and anti-rnp antibody tests. Arthritis Rheum. 2004, 15;51(6): Egner W: The use of laboratory tests in the diagnosis of SLE. J Clin Pathol. 2000, 53(6): Kavanaugh A, Tomar R, Reveille J, Solomon DH, Homburger HA: Guidelines for clinical use of the antinuclear antibody test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens. American College of Pathologists. Arch Pathol Lab Med. 2000, 124(1): Sharp GC, Irvin WS, LaRoque RL, Velez C, Daly V, Kaiser AD, Holman HR: Association of autoantibodies to different nuclear antigens with clinical patterns of rheumatic disease and responsiveness to therapy. J Clin Invest. 1971, 50(2): Sharp GC, Irvin WS, Tan EM, Gould RG, Holman HR: Mixed connective tissue disease--an apparently distinct rheumatic disease syndrome associated with a specific antibody to an extractable nuclear antigen (ENA). Am J Med. 1972, 52(2): Kasukawa R: Mixed connective tissue disease. Intern Med. 1999, 38(5): Reichlin M and Mattioli M: Correlation of a precipitin reaction to an RNA protein antigen and a low prevalence of nephritis in patients with systemic lupus erythematosus. N Eng J Med 1972, 286: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health,

17 Zastosowane symbole Diagnostyczny analizator medyczny in vitro Przed użyciem należy zapoznać się z instrukcją Ograniczenia temperaturowe Nie wykorzystywać ponownie Zagrożenia biologiczne Kod serii Numer katalogowy Termin przydatności do użycia Producent Autoryzowany przedstawiciel Zawiera ilość wystarczającą do przeprowadzenia < n > testów Kontrola pozytywna Kontrola negatywna Kalibrator 1 Kalibrator 2 Papierowe pudełko nadaje się do recyklingu Tą stroną do góry 17

18 QUANTA Flash jest zarejestrowanym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics Inc. BIO-FLASH jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy Biokit S.A Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowany przedstawiciel na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks: POL Lipiec 2012 Wersja 0 18