Norma do 5 mg/l Ostre zapalenie- wzrost kilkadziesiat/ kilkaset razy (rzs) Wartości bliskie zeru w t.r.u., (nawet w czynnym okresie choroby)

Transkrypt

1 DIAGNOSTYKA CHORÓB REUMATYCZNYCH

2 BIAŁKA OSTREJ FAZY Oznaczanie ilościowe: CRP Norma do 5 mg/l Ostre zapalenie- wzrost kilkadziesiat/ kilkaset razy (rzs) Wartości bliskie zeru w t.r.u., (nawet w czynnym okresie choroby) Oznaczanie ilościowe i jakościowe pozostałe białka AGP (Alfa-1-kwaśna glikoproteina) ACT, (Anty-chymotrypsyna) AT (anty-trypsyna) transferyna

3 ZASTOSOWANIE DIAGNOSTYCZNE OZNACZEŃ ILOŚCIOWYCH CRP 1. badanie przesiewowe (wykrywanie chorób o podłoŝu organicznym : stany zapalne, infekcje, choroby nowotworowe) 2. ocena aktywności stanu zapalnego i monitorowanie przebiegu leczenia np. r.z.s., łuszczycowe zapalenie stawów, dna moczanowa 3. monitorowanie przebiegu leczenia u chorych na infekcje bakteryjne 4. wykrywanie zakaŝeń bakteryjnych np. infekcji wewnątrzmaciczych z przedwczesnym pęknięciem pęcherza płodowego, wtórnych zakaŝeń w przebiegu tocznia układowego (tu konieczna znajomość poziomu CRP w okresie przed infekcją) 5. wczesne wykrywanie powikłań u chorych w okresie pooperacyjnym

4 ANA - METODY WYKRYWANIA Immunofluorescencja pośrednia (kom. Hep-2010, Hep-2000,Hep-2, 2, skrawki wątroby szczura lub małpy) Określamy miano p-ciwciał i ew. typ świecenia + Westrenblot Określamy rodzaj p-ciał Testy immunoenzymatyczne (ELISA) Określamy rodzaj p-ciał oraz jego stęŝenie

5 TYPY FLUORESCENCJI Antygeny jądra komórkowego Wzór fluorescencji Polinukleotydy dwuniciowy DNA jednoniciowy DNA homogenny homogenny Histony: H1,H2A, H2B, H3,H4 homogenny

6

7 AUTOPRZECIWCIAŁA W TOCZNIU RUMIENIOWATYM UKŁADOWYM Dwuniciowy DNA Jednoniciowy DNA RNA Histony U1-nRNP Sm SS-A (Ro) SS-B (La) Cyklina Ku rrnp Hsp-90 Kardiolipina Nukleosomy (ANuA) ANTYGEN CZESTOŚĆ WYSTĘPOWANIA %

8 ssdna/ dsdna *Antygen jednoniciowe, zdenaturowane DNA dwuniciowe, natywne DNA *Funkcje dsdna reagują z epitopami które leŝą w szkielecie DNA na zewnątrz, zaś ssdna wiąŝa się z epitopami w obszarze zasad purynowych i pirymidynowych *Występowanie ssdna: choroby reumatyczne (tru-80%, zespół Sjogrena 40%, Scleroderma 44%) dsdna: TRU (60-90%)

9 Histony *Antygen są zasadami, związanymi z DNA białkami. RozróŜnia się 5 typów histonów H1, H2A, H2B, H3, H4 (głównie H1 oraz H2B) *Funkcje stabilizacja podwójnej spirali DNA *Występowanie toczeń indukowany lekami 95%, t.r.u. bez genezy jatrogennej (40-80%) r.z.s. (15-50%) 50%)

10 TYPY FLUORESCENCJI Antygeny jądra komórkowego Wzór fluorescencji Rybonukleoprote- iny nukleoplazmy Antygeny jąderkowe Centromery U1-nRNP Sm SS-A SS-B U3-nRNP RNA-Polimeraza I PM-Scl Białka kinetochoru Gruboziarnisty, jaderka negatywne Gruboziarnisty, jaderka negatywne Ziarnisty ziarnisty Ziarniste jąderka Ziarniste jąderka Jąderka homogenne Typowe b. drobne ziarnistości

11

12 AUTOPRZECIWCIAŁA W PIERWOTNYM ZESPOLE SJÖGRENA ANTYGEN CZESTOŚĆ WYSTĘPOWANIA % SS-A (Ro) SS-B (La) Jednoniciowy DNA RANA Przewody wyprowadzające ślinianek

13 PRZECIWCIAŁA PRZECIWKO SS-A SS-A *Antygen mała rybonukleoproteina składająca się z jednej cząsteczki RNA (Y1-, Y3-, Y4-, Y5-RNA) oraz dwóch róŝnych białek *Funkcja przekształcanie mrna w cząstkę aktywną translacyjnie *Występowanie zespół Sjogrena (40-90%) t.r.u. (20-60%), pierwotna Ŝółciowa marskość wątroby (20%), toczeń noworodkowy (100%), mogą powodować wrodzony blok serca u noworodka

14 PRZECIWCIAŁA PRZECIWKO SS-B *Antygen fosfoproteina SS-B *Funkcja *Występowanie białko wspomagające RNA-polimerazę III, zespół Sjogrena (40-90%) głównie u kobiet (29:1) toczeń rozsiany (10-20%)

15 AUTOPRZECIWCIAŁA W ZAPALENIU SKÓRNO- MIĘSNIOWYM I WIELOMIĘŚNIOWYM PM-Scl, Jo-1 ANTYGEN CZESTOŚĆ WYSTĘPOWANIA % Mi-1 Mi-2 Ku Jednoniciowy DNA PL-7 (syntetaza treonylowa-trna) trna) PL-12 (syntetaza alanylowa trna)

16 PRZECIWCIAŁA PRZECIWKO PM-Scl PM-Scl (PM-1) *Antygen kompleks 16 polipeptydów *Funkcja nie wyjaśniona *Występowanie zespół nakładania (overlap syndrom) (50-70%) 0%) łączący objawy zapalenia wieomięśniowego, zapalenia skórno-mięśniowego i postępującej twardziny uogólnionej

17 PRZECIWCIAŁA PRZECIWKO Jo-1 Jo-1 *Antygen syntetaza histydylowa-trnatrna *Funkcja *Występowanie dołącza w cytoplazmie aminokwas histydynę do odpowiedniego trna polymyositis ze śródmiąŝszowym zwłoknieniem płuc (25-35%)

18 AUTOPRZECIWCIAŁA W MIESZANEJ CHOROBIE TKANKI ŁĄCZNEJ U1-nRNP ANTYGEN Jednoniciowy DNA CZESTOŚĆ WYSTĘPOWANIA %

19 AUTOPRZECIWCIAŁA W POSTĘPUJĄCEJ TWARDZINIE UOGÓLNIONEJ (POSTAĆ ROZSIANA) fibrillaryna ANTYGEN PM-Scl, włącznie z zespołem nakładania Scl-70 RNA-polimeraza I RNP NOR-90 (organizator jąderka) CZESTOŚĆ WYSTĘPOWANIA % rzadkie Rzadkie AUTOPRZECIWCIAŁA W POSTĘPUJĄCEJ TWARDZINIE UOGÓLNIONEJ (POSTAĆ OGRANICZONA) Centromery 80-95

20

21 Wzór fluorescencji Organo-niespecyficzne niespecyficzne przeciwciała cytoplazmatyczne Ziarnisty drobno,gęsty siatkowo-ziarnisty kroplisty wiązki włókien drobnowłóknisty filamenty Organelle komórkowe: mitochondria, rybosomy, Aparat Golgiego, lizosomy Szkielet komórkowy: Aktyna Wimentyna Cytokeratyna ziarnisty drobnoziarnisty Dalsze białka: Jo-1 PL-7

22

23 PRZECIWCIAŁA PRZECIWKO MITOCHONDRIOM (AMA) Przeciwciało przeciw M2 M4 Choroba Pierwotna Ŝółciowa marskość wątroby (wysokie miana) Postępująca twardzina uogólniona Pierwotna Ŝółciowa marskość wątroby Rozpowszechnienie % M9 Pierwotna Ŝółciowa marskość wątroby Wczesne stadium (M2 neg) M2 pozytywne 82 40

24 KRYTERIA DIAGNOSTYCZNE AUTOIMMUNOLOGICZNEGO ZAPALENIA WĄTROBY 1. cechy zapalenia w biopsji 2. obecność autoprzeciwciał (A A, ASMA, SLA/LP) 3. hypergammaglobulinemia 4. negatywne badania serologiczne w kierunku HBV i HCV 5. antygeny HLA B8, DR3 lub DR4

25

26 Wzór fluorescencji Centriole Antygeny związane z mitozą, 1-2 punkty na biegunach struktury mitotyczne Włókna wrzeciona kariokinetycznego Włókna wychodzące z centriol Strefa podziału równikowy

27

28 INTERPRETACJA WYNIKÓW IP Komórki wątroby szczura Komórki Hep-2010 rozcieńczenia surowicy 1:20 1:80 1:40 1:80 1:160 1:160 1:360 1:640

29 ANA - METODY WYKRYWANIA Immunofluorescencja pośrednia (IP) (kom. Hep-2010, Hep-2000,Hep 2000,Hep-2, 2, skrawki wątroby szczura lub małpy) Określamy miano p-ciwciał i ew. typ świecenia + + Westrenblot Określamy rodzaj p-ciał Testy immunoenzymatyczne (ELISA) Określamy rodzaj p-ciał oraz jego stęŝenie

30

31

32 ANA - METODY WYKRYWANIA Immunofluorescencja pośrednia (IP) (kom. Hep-2010, Hep-2000,Hep-2, 2, skrawki wątroby szczura lub małpy) Określamy miano p-ciwciał i ew. typ świecenia + Westrenblot Określamy rodzaj p-ciał + Testy immunoenzymatyczne (ELISA) Określamy stęŝenie p-ciała oraz jego rodzaj

33 Metoda ELISA Mikropłytka z antygenami Rozcienczone surowice Pipetujemy: 100 µl do dolka Inkubacja: 30 min płukanie: 300 µl wash buffer do dołka 3x

34 chromogen/substrate solution Pipetujemy: 100 µl do dołka Incubacja: 15 min stop solution Pipetujemy: 100 µl do dołka Odczyt absorbancji: przy dlugosci fali 450 nm

35 PRZECIWCIAŁA PRZECIWJĄDROWE W REUMATOIDALNYM ZAPALENIU STAWÓW histony ANTYGEN Jednoniciowy DNA U1-nRNP RANA CZESTOŚĆ WYSTĘPOWANIA %

36 MARKERY REUMATOIDALNEGO ZAPALENIA STAWÓW Genetyczne HLA-D4, HLA-DRB-1*0401, *0404, *0405, *0408 on-hla markery 2q34, 2q35 Autoprzciwciała Czynnik Reumatoidalny A A Anty-CCP Anty-filigrannin Odpowiedź ostrej fazy Białka ostrej fazy: CRP, SA Cytokiny: IL-1, T F, IL-6 Biochemiczne markery metabolizmu kostnego: Osteokalcyna Fosfataza zasaddowa- frakcja kostna Deoxypiridynolina CTx, Tx

37 CZYNNIK REUMATOIDALNY ALNY *Antygen domena CH2 i CH3 regionu Fc immunoglobuliny IgG 1. metoda rozcieńczeniowa (wykrywanie TYLKO RF RF klasy IgM - Test lateksowy (dodatnie: 1:40) Metody oznaczania IgM) - Waaler-Rose (WR) test (wynik dodatni 1:80) 2. ELISA oznaczanie wszystkich klas RF: IgM, IgA, IgG,

38 WYSTĘPOWANIE CZYNNIKA REUMATOIDALNEGO OBEC Y IEOBEC Y CHOROBY REUMATYCZ E Reumatoidalne zapalenie stawów Zespół Sjogrena (pierwotny i wtórny) Toczeń rumieniowaty układowy Scleroderma układowa PM/DM MCTD Krioglobulinemia Choroba zwyrodnieniowa stawów Zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa Choroby metaboliczne (dna, chondrokalcynoza) Choroba Lyme CHOROBY I FEKCYJ E Bakteryjne zapalenie wsierdzia Gruźlica Kiła Wirusowe zapalenie wątroby Trąd Ropne zapalenie stawów Zapalenie stawów w przebiegu HIV Rozlane śródmiąższowe zapalenie płuc Przewlekłe aktywne zapalenie wątroby Marskość wątroby Sarkoidoza Makroglobulinemia Zdrowi w starszym wieku > 60 lat (5-30%) do 60 rz ( 1-5%) CHOROBY IEI FEKCYJ E

39 PRZECIWCIAŁA PRZECIW BIAŁKU CYKLICZNEMU CYTRULINY (CCP) CHOROBA Anty-CCP dodatnie % Reumatoidalne zapalenie stawów 97 Toczeń rumieniowaty układowy Zespół Sjogrena Twardzina Układowa Zapalenie wielomęśniowe/skórnomięśniowe Zdrowa kontrola

40 PRZECIWCIAŁA PRZECIW BIAŁKU CYKLICZNEMU CYTRULINY (CCP), anti-cyclic citrullinated peptide antibodies - accp są przeciwciałami głównie klasy IgG, wiąŝącymi syntetyczne cykliczne peptydy zawierające cytrulinę. Antygen: zsyntetyzowany z zachowaniem struktury III- rzędowej Czułość: 80% (wczesna faza- 79%) Specyficzność: 97%

41 ZNACZENIE PRZECIWCIAŁ anty-ccp wysoko specyficzne dla RA obecne przed manifestacją kliniczną RZS Pojawienie się przeciwciał accp we krwi moŝe nawet na lat wyprzedzać wystąpienie objawów, ze znacznym wzrostem częstości ich występowania 1,5 roku przed klinicznym ujawnieniem się RZS wysoka wartość prognostyczna dla formy nadŝerkowej

42 CZUŁOŚĆ PRZECIWCIAŁ PRZECIW BIAŁKU CYKLICZNEMU CYTRULINY (CCP) Panel n Anti-CCP Nowo zdiagnozowane rzs % RZS powyŝej 2 lat % Czułość dla rzs %

43 SPECYFICZNOŚĆ PRZECIWCIAŁ PRZECIW BIAŁKU CYKLICZNEMU CYTRULINY (CCP) oraz CZYNNIKA REUMATOIDALNEGO Specyficzność anty-ccp oraz RF-IgM Zdrowa kontrola TRU MCTD Zespół Sjogrena Twardzina RZS Anty -CCP 0 % 8% 0% 3 % 5% 97% RF-IgM 21 % 46% 10% 73% 65% 62%

44 KORELACJA anty-ccp/ RF-IgM DAWCY KRWI N=196 pozytywne RF-IgM(ELISA) negatywne Anty-CCP pozytywne 0 0 Anty-CCP negatywne RZS POWYŻEJ 2 LAT pozytywne RF-IgM(ELISA) negatywne Anty-CCP pozytywne Anty-CCP negatywne 48 58

45 RODZAJ ŚWIECENIA ANTYGEN JEDNOSTKA CHOROBOWA ca CA Proteinaza 3 Ziarniniak Wegenera panca Mieloperoksydaza Syndrom Churg-Straus Polyarteritis nodosa panca Elastaza Ulcerative colitis, Chorba Crohna, primary sclerosing cholangitis, toczeń rumieniowaty układowy panca Katepsyna G Ulcerative colitis, primary sclerosing cholangitis choroba Crohna panca Lizozym Ulcerative colitis, primary sclerosing cholangitis choroba Crohna panca Laktoferryna Ulcerative colitis, primary sclerosing cholangitis, choroba Crohna, toczeń rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów

46 Świecenie na granulocytach utrwalonych etanolem / wątroba canca panca ANA

47 ANCA - METODY WYKRYWANIA panca canca

48 ANA / ANCA ANA +panca panca (anty -MPO) ANA granulocyty etanol/wątroba granulocyty formaldehyd/hep-2