QUANTA Lite F-Actin IgA ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite F-Actin IgA ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite TM aktyna F IgA jest testem immunoabsorpcji enzymatycznej (ELISA) dla półilościowego wykrywania przeciwciał IgA do elementu aktyny F mięśnia gładkiego w surowicy ludzkiej. U pacjentów z wynikami klinicznymi potwierdzającymi spójnie celiakię obecność przeciwciał przeciw aktynie F IgA może pomóc w oszacowaniu prawdopodobieństwa zaawansowanej atrofii mikrokosmków przewodu pokarmowego. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Autoprzeciwciała przeciw aktynie F są głównym elementem tzw. przeciwciał mięśnia gładkiego (ASMA). Te przeciwciała ukazują się szczególnie w kierunku elementu aktyny F cytoszkieletu i są najczęściej wykrywane prze niebezpośrednią immynofluorescencję wykorzystującą cienkie skrawki wątroby, nerki lub żołądka gryzonia jako substratu. 1-3 Przeciwciała mięśnia gładkiego są kierowane przeciwko wielu elementom, z których najważniejszym jest aktyna F, ale immonofluorescencja może również wykrywać przeciwciała do tubuliny i włókien pośrednich. 4,5 U pacjentów z autoagresyjnym zapaleniem wątroby (AIH) reakcyjność przeciw mięśniowi gładkiemu przede wszystkim odzwierciedla przeciwciała przeciw aktynie F, podczas gdy w infekcjach wirusowych, takich jak mononukleoza zakaźna, wirusowe zapalenie wątroby, odra oraz świnka, reakcyjność przeciw mięśniowi gładkiemu jest spowodowana reakcyjnością na antygeny cytoplazmatyczne inne niż aktyna F. 4-8 Przeciwciała przeciw aktynie F IgG zostały stwierdzone u 52 85% pacjentów z AIH oraz u 22% pacjentów z marskością wątroby pierwotną żółciową (PBC). 7-9,12-16 Przeciwciała przeciw aktynie F IgG (z reguły w niskich stężeniach) zostały stwierdzone u 3 18% surowicy od ogólnie zdrowej populacji. 17 W przeciwieństwie do przeciwciał przeciw aktynie F IgG, które są charakterystyczne dla pacjentów z autoagresyjnym zapaleniem wątroby, przeciwciała przeciw aktynie F IgA są klinicznie istotne w przypadku pacjentów z celiakią. Ostatnie badania wykazały, że przeciwciała IgA na aktynę F wykazują silną zależność od stopnia atrofii mikrokosmków jelitowych obecnych u pacjentów z celiakią Clemente et al za pomocą badania immunofluorescencyjnego (IFA) do wykrywania przeciwciał przeciw aktynie F IgA na specjalnie przygotowanym enterocycie wykazał, że 98,2% pacjentów z celiakią z płaską śluzówką, 89% pacjentów z pośrednią atrofią mikrokosmków oraz 0% kontroli negatywnych śródmięśniowych i z transglutaminaza tkankową miało wynik pozotywny dla przeciwciał przeciw aktynie F IgA. 25 Pedreira, S. et al. stwierdził, że 95% nieleczonych pacjentów cierpiących na celiakię miało podwyższoną liczbę przeciwciał przeciw aktynie F IgA w porównaniu do normalnych kontroli. 23 Ta grupa również wykazała, że wyższe stężenie przeciwciał przeciw aktynie F było współzależne od poważniejszych urazów jelitowych. Spadek liczby przeciwciał przeciw aktynie F IgA na skutek wprowadzenia diety bezglutenowej oraz sugerowane badanie tych przeciwciał może mieć wpływ na monitorowanie zgodności diety bezglutenowej. 22 Badania immunofluorescencyjne do wykrywania przeciwciał mięśnia gładkiego lub aktyny F są subiektywne i ich wyniki zależą od typu użytej tkanki, specyfiki koniugatu, mocy systemu mikroskopowego używanego do odczytania wyników oraz umiejętności technicznych osoby badającej. Metody ELISA wykrywania przeciwciał aktyny F, które były w pierwszej kolejności zgłaszane od połowy lat 80. do wczesnych lat 90. ubiegłego wieku 4,5,7,8 umożliwiają bardziej znormalizowane, mniej wymagające technicznie oraz zautomatyzowane analizy. 7,9-12 Zasada badania Oczyszczony antygen aktyny F wiąże się z dołkami płytek polistyrenowych w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego naturalnym stanie. Wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczona surowica pacjenta są dodawane do oddzielnych dołków, umożliwiając obecnym przeciwciałom aktyny F powiązanie z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgA. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgA znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgA znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowe płytki z mikrodołkami ELISA pokryte oczyszczonym antygenem aktyny F (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Negatywna kontrola ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i ludzką surowicę bez żadnych ludzkich przeciwciał do aktyny F, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Pozytywna niska aktyna F IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała ludzkiej surowicy do aktyny F, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Pozytywna wysoka aktyna F IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała ludzkiej surowicy do aktyny F, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 1

2 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgA, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgA, 1 fiolka zabarwienie żółte, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W związku z tym pozytywna niska aktyna F IgA ELISA, pozytywna wysoka aktyna F IgA oaz negatywna kontrola ELISA powinny być obsługiwane w taki sam sposób jak potencjalnie infekcyjny materiał Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie zestawy odczynników przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. 2

3 Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. 29 Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami ELISA z aktyną F (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli pozytywnej niskiej ELISA aktyny F IgA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli pozytywnej wysokiej ELISA aktyny F IgA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgA HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgA 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0.344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ z pozytywną niską aktyną F IgA ELISA, pozytywną wysoką aktyną F IgA ELISA oraz negatywną kontrolą ELISA. 4. Ustalenie obecności lub nieobecności aktyny F przy pomocy arbitralnych jednostek wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli oraz jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Dodać do dołków 100 µl wstępnie rozcieńczonego do niskiej pozytywnej kontroli aktyny F IgA ELISA, wysokiej dodatniej aktyny F IgA ELISA, negatywnej kontroli ELISA oraz rozcieńczonych próbek pacjenta. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i delikatnie strząsnąć ją na materiał chłonny, aby usunąć wszelkie pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgA HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap 3. 3

4 6. Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Niska pozytywna kontrola aktyny F IgA ELISA, wysoka dodatnia aktyna F IgA ELISA oraz negatywna kontrola ELISA powinny być wykonywane z każdą serią próbek w celu potwierdzenia, czy wszystkie odczynniki i badania funkcjonują prawidłowo. 2. Uwaga: w związku z tym, że niska pozytywna kontrola aktyny F IgA ELISA, wysoka dodatnia aktyna F IgA ELISA oraz negatywna kontrola ELISA są wstępnie rozcieńczone, nie mają one zastosowania w metodach badań związanych z rozcieńczeniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < - 20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysokiej pozytywnej aktyny F IgA ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej niskiej pozytywnej kontroli aktyny F IgA ELISA, która musi być większa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysokiej pozytywnej aktyny F IgA ELISA musi być większa niż 1,0, a absorbancja wstępnie rozcieńczonej negatywnej kontroli ELISA nie może być większa niż 0,2. c. Niska pozytywna absorbancja aktyny F IgA ELISA musi być wyższa od dwukrotnej negatywnej kontroli ELISA lub musi być powyżej 0,25. d. Negatywna kontrola ELISA oraz pozytywna kontrola aktyny F IgA ELISA są przeznaczone do monitorowania istotnych nieprawidłowości odczynników. Wysoka pozytywna kontrola aktyny F IgA nie zapewni precyzji na poziome wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie NCCLS C24-A3. 30 Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reakcyjność każdej próbki można następnie obliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną niskiej pozytywnej aktyny F IgA ELISA. Wynik jest mnożony przez liczbę jednostek przypisanych do niskiej pozytywnej aktyny F IgA ELISA, która jest umieszczona na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x niska pozytywna aktyna F IgA ELISA (jednostki) gęstość optyczna niskiej pozytywnej (jednostki) aktyny F IgA ELISA Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, niejednoznaczna lub pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywny < 20 Niejednoznaczna 20,1 24,9 Pozytywna > Pozytywny wynik przeciw aktyny F IgA u pacjentów z celiakią wskazuje na podwyższone prawdopodobieństwo poważnej jelitowej atrofii mikrokosmków. 2. Negatywny wynik wskazuje na brak przeciwciała aktyny F Iga lub poziomy poniżej wartości granicznej badania. 4

5 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki zostały uzyskane przy użyciu zestawu INOVA QUANTA Lite aktyny F IgA ELISA. Wartości aktyny F IgA uzyskane przy użyciu analiz innych producentów nie mogą być używane zamiennie. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgA nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu. 2. Nie wszyscy pacjenci mają pozytywny wynik na aktynę F IgA. 3. Nie wszystkie pozytywne próbki mięśnia gładkiego będą mieć przeciwciała aktyny F IgA. 4. Wykrycie przeciwciał aktyny F IgA u pacjentów z chorobą wątroby powinno być interpretowane z rezerwą, ponieważ obecności przeciwciał aktyny F IgG w grupie choroby często towarzyszą przeciwciała aktyny F IgA, które mogą nie być powiązane z patologią jelit. Przeciwciała aktyny F IgA powinny być analizowane tylko u pacjentów z celiakią, jako pomoc w ocenie uszkodzenia jelit. 5. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 6. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Dane wyników Spodziewane wartości Normalny zakres Panel 500 próbek pobranych od aktualnie zdrowych osób (250 mężczyzn oraz 250 kobiet) został przebadany przy użyciu zestawu QUANTA Lite aktyny F IgA ELISA. Zakres wiekowy od 18 do 80 lat (mediana=41). Swoistość badania wynosiła 92,2% (461/500). Trzy z 39 próbek były pozytywne na przeciwciała ttg IgA i dlatego mogą stanowić niezdiagnozowanych pacjentów celiakii. Jedna z tych trzech próbek była również pozytywna śródmięśniowo i praktycznie jest ona pewna jako prawdziwa celiakia. Powszechne występowanie celiakii w normalnej populacji USA zostało oszacowane na 1:133 i w związku z tym wykrycie niezdiagnozowanych pacjentów celiakii w normalnej grupie pacjentów nie jest niespodziewane. 26 Swoistość i wrażliwość kliniczna W związku z tym, że zamierzonych użyciem analizy QUANTA Lite F-Actin IgA jest zbadanie prawdopodobieństwa uszkodzenia jelit u pacjentów z celiakią, wrażliwość i swoistość zostały obliczone na podstawie 445 próbek z wynikami biopsji. Spośród 445 próbek 157 miało patologię Marsha 3, a 288 miało patologię Marsha 0, 1 lub N =445 Wynik Marsha Jednostki aktyny F IgA M3a/b/c M0,M1,M2 Łącznie Poz (>24,9 jednostek) Neg (>24,9 jednostek) Łącznie Wyniki niejednoznaczne liczone jako negatywne (tzn. niedodatnie) Wrażliwość kliniczna: 48,4% (76/157) (95% CI, od 40,4% do 56,5% ) Swoistość kliniczna: 95,1% (274/288) ( ,3%) Przewidywana wartości pozytywna: 84,4% Przewidywana wartości negatywna: 88,4% Skuteczność: 78,7% Jeśli obliczenia są wykonywane tylko przy użyciu M3c (całkowita atrofia mikrokosmków) jako indeks odniesienia, wrażliwość i swoistość wynoszą odpowiednio 59,4% i 91,3%, jak pokazano poniżej. N =445 Wynik Marsha Jednostki aktyny F IgA M3c Inne niż M3c Łącznie Poz (>24,9 jednostek) Neg (>24,9 jednostek) Łącznie Wyniki niejednoznaczne liczone jako negatywne (tzn. niedodatnie) Wrażliwość kliniczna: 59,4% (60/101) (95% CI, od 49,2% do 69,1% ) Swoistość kliniczna: 91,3% (314/344) (87,7 94,0%) Przewidywana wartości pozytywna: 66,7% Przewidywana wartości negatywna: 88,5 Skuteczność: 78,7% 5

6 Porównanie z urządzeniem predykadowym Zestaw QUANTA Lite aktyny F IgA ELISA został porównany z urządzeniem zatwierdzonym przez FDA do wykrywania przeciwciał IgA na transglutaminazę (ttg) tkanki znacznika celiakii (ttg). Pozytywna zgodność procentowa wynosiła 74/128 = 57,8%, a negatywna zgodność procentowa wynosiła 27/29 = 93,1%, gdy pacjenci z klasą Marsha 3a 3b lub 3c byli badani za pomocą dwóch urządzeń. Gdy były testowane tylko osoby z patologią Marsha 3c (całkowita atrofia mikrokosmków), pozytywna zgodność procentowa wynosiła 60/98 = 61,2%, a negatywna zgodność procentowa wynosiła 3/3 = 100%. Podczas gdy większość próbek dodatniej aktyny F IgA jest również dodatnia ttg, tylko pacjenci z celiakią z poważnymi uszkodzeniami jelit są pozytywni dla aktyny F IgA. Reaktywność krzyżowa Surowice od 36 pacjentów z przeciwciałami choroby autoagresyjnej/zakaźnej lub surowice chorób swoistego stanu, w tym komórka ciemieniowa żołądka, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, kłębuszkowa błona podstawowa, LKM-1, rozpuszczalny antygen wątroby, centromer, chromatyna, autoagresyjne zapalenie wątroby, marskość wątroby pierwotna żółciowa, wirus zapalenia wątroby typu B, wirus zapalenia wątroby typu C, główne stwardniejące zapalenie dróg żółciowych były badane na reakcyjność krzyżową za pomocą zestawu QUANTA Lite aktyny F IgA ELISA. Wiele próbek z chorobą wątroby było pozytywnych dla przeciwciał aktyny F IgA. Wykrycie przeciwciał aktyny F IgA u pacjentów z chorobą wątroby powinno być interpretowane z rezerwą, ponieważ obecności przeciwciał aktyny F IgG w grupie choroby często towarzyszą przeciwciała aktyny F IgA, które mogą nie być powiązane z patologią jelit. Precyzja i powtarzalność Wyniki w ramach badania były oceniane przez przygotowanie 6 próbek, z których każda była poddawana testom 7 razy. Tabela 1: Wyniki w ramach badania QUANTA Lite aktyny F IgA ELISA Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Próbka 6 Jednostki średnie 104, , ,4 SD 2,4 7 0,3 1,5 0,4 0,4 CV % 2,3 4,6 0,9 3,8 3,0 2,6 Wynik w ramach badania był oceniony przez testowanie z duplikatem, 6 próbek z zestawem wysokiej pozytywnej kontroli (HPC) oraz negatywnej kontroli (NC) dwa razy dziennie (raz rano i raz po południu) przez 3 dni. Tabela 2: Wyniki pomiędzy badaniami QUANTA Lite aktyny F IgA ELISA HPC Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Próbka 6 NC Jednostki średnie 78,3 104,8 156,8 41,5 41,1 14,8 17,0 1,0 SD 4,7 6,6 5,8 1,7 2,6 0,7 0,8 0,1 CV % 6,0 6,3 3,7 4,2 6,4 5,0 4,7 10,5 6

7 Piśmiennictwo 1. Gabbiani, G. et al. Human smooth muscle autoantibody. Its identification as antiactin antibody and a study of its binding to "nonmuscular" cells. Am J Pathol 72, (1973). 2. Anderson, P. Studies on the specificity of smooth-muscle antibodies. Clin Exp Immunol 26, (1976). 3. Bottazzo, G. F. et al. Classification of smooth muscle autoantibodies detected by immunofluorescence. J Clin Pathol 29, (1976). 4. Toh, B. H. Smooth muscle autoantibodies and autoantigens. Clin Exp Immunol 38, (1979). 5. Toh, B. H. et al. Viral infections and IgM autoantibodies to cytoplasmic intermediate filaments. Clin Exp Immunol 37, (1979). 6. Andersen, P., Small, J. V., Andersen, H. K. & Sobieszek, A. Reactivity of smooth-muscle antibodies with F- and G-actin. Immunology 37, (1979). 7. Bretherton, L. et al. ELISA assay for IgG autoantibody to G-actin: comparison of chronic active hepatitis and acute viral hepatitis. Clin Exp Immunol 51, (1983). 8. Kurki, P. Determination of anti-actin antibodies by a solid-phase immunoenzymatic assay and by indirect immunofluorescence technique. Clin Immunol Immunopathol 11, (1978). 9. Dighiero, G., Lymberi, P., Monot, C. & Abuaf, N. Sera with high levels of anti-smooth muscle and anti-mitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeleton proteins. Clin Exp Immunol 82, 52-6 (1990). 10. De Scheerder, I. et al. Post-cardiac injury syndrome and an increased humoral immune response against the major contractile proteins (actin and myosin). Am J Cardiol 56, (1985). 11. Leibovitch, L., George, J., Levi, Y., Bakimer, R. & Shoenfeld, Y. Anti-actin antibodies in sera from patients with autoimmune liver diseases and patients with carcinomas by ELISA. Immunol Lett 48, (1995). 12. Frenzel, C. et al. Evaluation of F-Actin ELISA for the diagnosis of autoimmune hepatitis. Am J Gastroenterol 101, (2006). 13. Czaja, A. J., Cassani, F., Cataleta, M., Valentini, P. & Bianchi, F. B. Frequency and significance of antibodies to actin in type 1 autoimmune hepatitis. Hepatology 24, (1996). 14. Kurki, P. et al. Different types of smooth muscle antibodies in chronic active hepatitis and primary biliary cirrhosis: their diagnostic and prognostic significance. Gut 21, (1980). 15. Granito, A. et al. Antibodies to filamentous actin (F-Actin) in type 1 autoimmune hepatitis. J Clin Pathol 59, (2006). 16. Liaskos, C., Bogdanos, D. P., Davies, E. T. & Dalekos, G. N. Diagnostic relevance of anti-filamentous actin antibodies in autoimmune hepatitis. J Clin Pathol 60, (2007). 17. Fagraeus, A. & Norberg, R. Anti-actin antibodies. Curr Top Microbiol Immunol 82, 1-13 (1978). 18. Carroccio, A. et al. IgA anti-actin antibodies ELISA in coeliac disease: A multicentre study. Dig Liver Dis 39, (2007). 19. Carroccio, A. et al. Anti-actin antibodies in celiac disease: correlation with intestinal mucosa damage and comparison of ELISA with the immunofluorescence assay. Clin Chem 51, (2005). 20. Clemente, M. G. et al. Immune reaction against the cytoskeleton in coeliac disease. Gut 47,520-6 (2000). 21. Clemente, M. G. et al. Detection of Autoantibodies against Enterocyte Actin Filaments as Serological Predictive Test for Intestinal Villous Atrophy in Celiac Disease: Results of a Polycentric Study. Gastroenterology 124, A-660 (2003). 22. Granito, A. et al. Anti-actin IgA antibodies in severe coeliac disease. Clin Exp Immunol 137, (2004). 23. Pedreira, S. et al. Significance of smooth muscle/anti-actin autoantibodies in celiac disease. Acta Gastroenterol Latinoam 35, (2005). 24. Norman, G. L. et al. in Association of Medical Laboratory Immunologists (Chicago, Ill, 2007). 25. Clemente, M. G. et al. Enterocyte actin autoantibody detection: a new diagnostic tool in celiac disease diagnosis: results of a multicenter study. Am J Gastroenterol 99, (2004). 26. Fasano, A. et al. Prevalence of celiac disease in at-risk and not-at-risk groups in the United States: a large multicenter study. Arch Intern Med 163, (2003). 27. Antonioli, D. A. Celiac disease: a progress report. Mod Pathol 16, (2003). 28. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, 2007, Fifth Edition. 29. CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38): CLSI (NCCLS). Feb Statistical quality control: Principles and definitions: Approved Guideline Third Edition. CLSI Document C24-A3, Vol 26(25):1999 7

8 QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Marzec 2011 Wersja 0 8