QUANTA Lite M2 EP (MIT3) Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite M2 EP (MIT3) Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie Test ELISA QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) jest testem immunoenzymatycznym (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał przeciwmitochondrialnych w surowicy ludzkiej. W połączeniu z wynikami klinicznymi i innymi testami laboratoryjnymi do wspomagania diagnozy pierwotnej marskości żółciowej wątroby wykorzystać można badanie na obecność przeciwciał przeciwmitochondrialnych. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Pierwotna marskość żółciowa wątroby (ang. primary biliary cirrhosis, PBC) to przewlekła choroba wątroby charakteryzująca się zniszczeniem małych wewnątrzwątrobowych dróg żółciowych. Postępujące niszczenie dróg prowadzi do rosnącego pogorszenia czynności wątroby i z czasem może doprowadzić do niewydolności wątroby oraz konieczności jej przeszczepienia. 1, 2 Etiologia PBC nie jest znana, chociaż 1, 3, 4 w rozwoju choroby może być istotny element genetyczny oraz inne czynniki. PBC zazwyczaj występuje w wieku od 30 do 65 lat i częściej dotyka kobiet niż mężczyzn (szacowany współczynnik kobiety:mężczyźni 9:1). 3, 4 Występowanie PBC u krewnych pierwszego stopnia pacjentów z PBC waha się od 1,3 do 6,4%. 4, 5 PBC występuje u wszystkich ras i na całym świecie. Donoszono o dużej zmienności występowania geograficznego PBC, od 2 na w Japonii i Australii do 40 na w Stanach Zjednoczonych. 3, 6 Badania serologiczne stanowią ważną pomoc w rozpoznawaniu i diagnozie PBC, ponieważ wiele przeciwciał związanych z PBC występuje przed ujawnieniem się objawów. 7-9 Przeciwciała przeciwmitochondrialne (ang. anti-mitochondrial antibodies, AMA) wykrywane metodą pośredniej techniki immunofluorescencyjnej (ang. indirect immunofluorescence assay, IFA) to klasyczny marker serologiczny PBC. 10 Chociaż AMA zgłaszano u 90 95% pacjentów z PBC, częstość wykrywania może być znacznie niższa. 11 Wykrywanie AMA metodą IFA jest w dużym stopniu uzależnione od umiejętności obserwatora, elementów technicznych badania oraz obecności innych przeciwciał, które mogą przesłonić lub zakłócić interpretację wzorców IFA. Wczesne badania opisały 9 podtypów antygenów mitochondrialnych, które nazwano M1 M9. 12 Większość autoantygenów stanowiących cel w surowicach pacjentów z PBC stanowi frakcję antygenów M2. Podstawowe składniki antygenu M2 to członkowie kompleksu dehydrogenazy 1-oksokwasu. Swoiste antygeny zostały zidentyfikowane jako podjednostki E2 kompleksu dehydrogenazy pirogronianu (PDC-E2), kompleksu dehydrogenazy rozgałęzionego 2-oksokwasu (BCOADC-E2) i kompleksu dehydrogenazy 2-okso glutaranu. 13 Identyfikacja tych antygenów umożliwiła opracowanie testów ELISA. Testy ELISA okazały się być bardziej czułe niż IFA Testy ELISA anty-m2 wykorzystywały PDC-E2 jako substrat pierwotny do wykrywania przeciwciał swoistych dla PBC. Chociaż 80 90% pacjentów z PBC potwierdzonym histologicznie ma przeciwciała anty-pdc-e2, około 10% pacjentów z PBC reaguje tylko na BCOADC-E2 i/lub OGDC-E2. 18,19 Gershwin i Leung opracowali i opatentowali hybrydowy klon potrójnej ekspresji ( MIT3 ), który wytwarza immunodominujące epitopy PDC-E2, BCOADC-E2 i OGDC-E2. 11, 15, 16, 19 Wykazano, że test ELISA oparty na MIT3 ma wydajność lepszą niż IFA lub konwencjonalne testy ELISA oparte na PDC-E2 i wykrywał AMA w dwóch trzecich surowic AMA-negatywnych (według IFA) uzyskanych od pacjentów z PBC. 15, 16 Ponieważ występowanie AMA może poprzedzać rozwój choroby objawowej, możliwość dokładniejszej identyfikacji obecności markerów PBC może przyczynić się do wcześniejszej diagnozy, leczenia i może spowolnić postęp choroby. 7,8,9 Zasada badania Rekombinowany antygen oczyszczony metodą powinowactwa (MIT3), zawierający immunodominujące części PDC-E2, BCOADC-E2 i OGDC-E2 jest wiązany w dołkach polistyrenowej płytki z mikrodołkami w warunkach, które zachowają antygen w jego stanie natywnym. Wstępnie rozcieńczone kontrole oraz surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków umożliwiając związanie wszelkich występujących przeciwciał przeciwmitochondrialnych z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowe płytki z mikrodołkami ELISA pokryte oczyszczonym antygenem rekombinowanym MIT3 (12-1 x 8 dołków), z uchwytem, w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna testu ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez przeciwciał ludzkich skierowanych przeciwko mitochondrialnemu M2, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Słabo pozytywna kontrola testu ELISA M2 EP (MIT3), 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko mitochondrialnemu M2, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 1

2 4. Wysoko pozytywna kontrola testu ELISA M2 EP (MIT3), 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i przeciwciała surowicy ludzkiej skierowane przeciwko mitochondrialnemu M2, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HbsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego powodu słabo pozytywna kontrola testu ELISA M2 EP (MIT3), wysoko pozytywna kontrola testu ELISA M2 EP (MIT3) i kontrola negatywna testu ELISA powinny być oznaczane w taki sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. 2

3 Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej, żółtaczkowej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami ELISA z M2 EP (MIT3) (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ELISA M2 EP (MIT3) 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli testu ELISA M2 EP (MIT3) 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20  26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu ELISA M2 EP (MIT3), wysoko pozytywnej kontroli testu ELISA M2 EP (MIT3) oraz kontroli negatywnej testu ELISA. 4. W celu stwierdzenia obecności lub braku przeciwciał przeciwko M2 (MIT3) z zastosowaniem jednostek arbitralnych, potrzebne są po dwa dołki na każdą z trzech kontroli i jeden do dwóch dołków na każdą próbkę pochodzącą od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Dodać do dołków 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ELISA M2 EP (MIT3), wysoko pozytywnej kontroli testu ELISA M2 EP (MIT3), kontroli negatywnej testu ELISA oraz rozcieńczonych próbek pacjenta. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Dodać µl rozcieńczonego buforu do płukania HRP do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 3

4 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą testu ELISA M2 EP (MIT3), wysoko pozytywną kontrolą testu ELISA M2 EP (MIT3) i kontrolą negatywną ELISA. 2. Proszę zwrócić uwagę, że słabo pozytywna kontrola testu ELISA M2 EP (MIT3), wysoko pozytywna kontrola testu ELISA M2 EP (MIT3) i kontrola negatywna testu ELISA są wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli testu ELISA M2 EP (MIT3) musi być wyższa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ELISA M2 EP (MIT3), która musi być wyższa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Wstępnie rozcieńczona wysoko pozytywna kontrola testu ELISA M2 EP (MIT3) musi mieć absorbancję wyższą niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA nie może przekraczać 0,2. c. Absorbancja słabo pozytywnej kontroli testu ELISA M2 EP (MIT3) musi być przynajmniej dwukrotnie wyższa niż kontroli negatywnej testu ELISA lub przekraczać 0,25. d. Kontrola negatywna testu ELISA oraz wysoko pozytywna kontrola testu ELISA M2 EP (MIT3) mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Wysoko pozytywna kontrola testu ELISA M2 EP (MIT3) nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie NCCLS C24-A2. 21 Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność dla każdej próbki można następnie obliczyć dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli testu ELISA M2 EP (MIT3). Wynik jest mnożony przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu ELISA M2 EP (MIT3), którą można znaleźć na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x słabo pozytywna kontrola testu ELISA M2 EP (MIT3) (jednostki) Gęstość optyczna słabo pozytywnej (jednostki) kontroli testu ELISA M2 EP (MIT3) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. 4

5 Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, niejednoznaczna lub pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywna 20 Niejednoznaczne 20,1-24,9 Pozytywne Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał przeciwmitochondrialnych i sugeruje możliwość występowania pierwotnej marskości żółciowej wątroby. 2. Wynik negatywny wskazuje na brak przeciwciał przeciwmitochondrialnych lub ich poziom poniżej wartości granicznej testu. 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Następujące wyniki uzyskano za pomocą testu INOVA QUANTA Lite M2 EP (MIT3) ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości M2 EP (MIT3) uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu. 2. Nie u wszystkich pacjentów z pierwotną marskością żółciową wątroby występują przeciwciała przeciwmitochondrialne. 3. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 4. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Występowanie PBC waha się od około 2 na w Japonii i Australii do 40 na w Stanach Zjednoczonych. 3, 6 Chociaż ogólnie uważano, że przeciwciała przeciwmitochondrialne występują u 90 95% pacjentów z PBC, częstość wykrywanych przeciwciał zależy od badanej grupy a czułość może wynosić zaledwie 72%. 11 Swoistość dla AMA badana metodą IFA dla PBC mieści się w zakresie 95 97%. 11 Normalny zakres Przeciwciała anty-m2 (MIT3) u bezobjawowych osób zdrowych Panel 520 bezobjawowych osób zdrowych zbadano za pomocą testu QUANTA Lite M2 EP (MIT3) ELISA pod kątem przeciwciał przeciwko M2 EP (MIT3). Dane dotyczące wieku i płci były dostępne dla 299 próbek. Spośród nich, trzystu dawców było w wieku od 18 do 78 lat, a grupa obejmowała 150 mężczyzn oraz 149 kobiet. Wartość średnia dla tej populacji wynosiła 7,6 jednostki, a wartość mediany wynosiła 6,0 jednostek. Swoistość badania wyniosła 98,5% (512/520) dla zdrowych pacjentów. Dwie próbki reaktywne w badaniu IFA wykazywały wyraźne wzorce AMA. Specyficzna charakterystyka wyników W Tabeli 1 przedstawiono częstość występowania przeciwciał M2 (MIT3) wykrywanych w teście QUANTA Lite M2 EP (MIT3) ELISA na łącznej liczbie 980 pewnych przypadków PBC (978) lub PBC/autoimmunologicznego zapalenia wątroby (ang. Autoimmune Hepatits, AIH) (2) zebranych z kilku grup klinicznych. Wykluczono próbki pacjentów z AIH, znanym PBC o negatywnym wyniku AMA lub podejrzeniem choroby bez jej potwierdzenia. Całkowita czułość badania wyniosła 87,3% (856/980). Swoistość badania wyniosła 98,7% (590/598). Wartość predykcyjna pozytywna wynosiła 99,1%, a wartość predykcyjna negatywna wynosiła 82,6%. Wartość średniej i mediany dla wszystkich nie-pbc lub PBC/AIH wynosiła odpowiednio 7,5 i 5,9 jednostki. Tabela 1: Czułość testu QUANTA Lite M2 EP (MIT3) ELISA N=1578 Test QUANTA Lite M2 EP (MIT3) ELISA Grupa pacjentów n= pozyt. niejedn. negat. PBC (967) lub PBC/AIH (13) próbki kontrolne pochodzące od osób zdrowych (520); Pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych (ang. Primary Sclerosing Cholangitis, PSC) (47), próbki kontrolne pochodzące od osób cierpiących na inne choroby (31) Czułość: 87,3% (856/980); 95% Przedział ufności (CI): od 85,1% do 89,4% Swoistość: 98,7% (590/598); 95% CI: od 97,4% do 99,4% 5

6 Reaktywność krzyżowa W celu oceny swoistości testu za pomocą testu ELISA QUANTA Lite M2 EP (MIT3) przebadano surowice 155 pacjentów z chorobą wątroby inną niż PBC (70 AIH, 46 PSC, 8 AIH/PSC) oraz chorobami autoimmunologicznymi lub zakaźnymi (3 LKM-1, 2 SLA, 3 GPA, 3 chromatyna, 3 ASCA, 2 Sm, 2 RNP, 2 SS-A, 2 SS--B, 2 Scl-70, 2 Jo-1, 1 SLE, 2 HCV, 2 podejrzenia choroby wątroby innej niż PBC). Żadna z surowic związanych z chorobami autoimmunologicznymi lub zakaźnymi nie została zinterpretowana przez test QUANTA Lite M2 EP(MIT3) ELISA jako pozytywna. Pięć próbek AIH było pozytywnych, ale mogły one wiązać się z nierozpoznanym lub rozwijającym się zespołem AIH/PBC. Z obliczeń swoistości wykluczono wszystkie próbki AIH oraz AIH/PSC. Precyzja i powtarzalność Precyzję w obrębie badania określono oznaczając 6 próbek po 6 razy każdą. Tabela 2: Precyzja w obrębie badania QUANTA Lite M2 EP(MIT3) ELISA A B C D E F Jednostka średnia 123,8 7,3 55,4 11,8 168,2 8,1 SD 3,46 0,95 3,14 0,96 2,55 0,78 CV % 2,8 13,0 5,7 8,1 1,5 9,7 Precyzję w obrębie badania oceniono badając w dwóch powtórzeniach 5 próbek, dołączoną do zestawu kontrolę wysoko pozytywną (HPC) i kontrolę negatywną (NC) dwa razy dziennie (raz rano i raz po południu) przez 3 dni. Tabela 3: Precyzja testu ELISA QUANTA Lite M2 EP(MIT3) pomiędzy badaniami HPC NC A B C D E Jednostki średnie 112,7 2,2 110,3 7,8 54,4 11,6 160,3 SD 2,98 0,16 2,56 1,27 1,57 0,61 4,30 CV % 2,6 7,4 2,3 16,2 2,9 5,3 2,7 6

7 Piśmiennictwo 1. Kaplan, M. M. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 335, (1996). 2. Heathcote, E. J. Management of primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines. Hepatology 31, (2000). 3. Feld, J. J. & Heathcote, E. J. Epidemiology of autoimmune liver disease. J Gastroenterol Hepatol 18, (2003). 4. Talwalkar, J. A. & Lindor, K. D. Primary biliary cirrhosis. Lancet 362, (2003). 5. Jones, D. E., Watt, F. E., Metcalf, J. V., Bassendine, M. F. & James, O. F. Familial primary biliary cirrhosis reassessed: a geographically-based population study. J Hepatol 30, (1999). 6. Kim, W. R. et al. Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology 119, (2000). 7. Metcalf, J. V. et al. Natural history of early primary biliary cirrhosis. Lancet 348, (1996). 8. Kisand, K. E. et al. The follow-up of asymptomatic persons with antibodies to pyruvate dehydrogenase in adult population samples. J Gastroenterol 36, (2001). 9. Prince, M., Chetwynd, A., Newman, W., Metcalf, J. V. & James, O. F. Survival and symptom progression in a geographically based cohort of patients with primary biliary cirrhosis: follow-up for up to 28 years. Gastroenterology 123, (2002). 10. Walker, J. G., Doniach, D., Roitt, I. M. & Sherlock, S. Serological Tests in Diagnosis of Primary Biliary Cirrhosis. Lancet 39, (1965). 11. Muratori, P. et al. 'True' antimitochondrial antibody-negative primary biliary cirrhosis, low sensitivity of the routine assays, or both? Clin Exp Immunol 135, (2004). 12. Berg, P. A. & Klein, R. Mitochondrial antigens and autoantibodies: from anti-m1 to anti-m9. Klin Wochenschr 64, (1986). 13. Fussey, S. P., Guest, J. R., James, O. F., Bassendine, M. F. & Yeaman, S. J. Identification and analysis of the major M2 autoantigens in primary biliary cirrhosis. Proc Natl Acad Sci USA 85, (1988). 14. Vergani, D. & Bogdanos, D. P. Positive markers in AMA-negative PBC. Am J Gastroenterol 98, (2003). 15. Miyakawa, H. et al. Detection of antimitochondrial autoantibodies in immunofluorescent AMAnegative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantigens. Hepatology 34, (2001). 16. Moteki, S. et al. Use of a designer triple expression hybrid clone for three different lipoyl domain for the detection of antimitochondrial autoantibodies. Hepatology 24, (1996). 17. Fritzler, M. J. & Manns, M. P. Anti-mitochondrial autoantibodies. Clin Appl Immunol Rev 3, (2002). 18. Nishio, A., Keeffe, E. B. & Gershwin, M. E. Immunopathogenesis of primary biliary cirrhosis. Semin Liver Dis 22, (2002). 19. Leung, P. S. et al. Use of designer recombinant mitochondrial antigens in the diagnosis of primary biliary cirrhosis. Hepatology 15, (1992). 20. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, 2007, Fifth Edition. 21. Internal Quality Control: Principles and Definitions, Approved Guidline, NCCLS Doc C24-A2 (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1991). 7

8 QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Marzec 2011 Wersja 0 8