QUANTA Lite GPA (Gastric Parietal Cell Antibody) ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite GPA (Gastric Parietal Cell Antibody) ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie Zestaw QUANTA Lite TM GPA (Gastric Parietal Cell Antibody, Przeciwciało przeciwko komórkom ściennym żołądka) jest to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał klasy IgG przeciwko (H+/K+) ATP-azie komórek ściennych żołądka w surowicy człowieka. Obecność przeciwciał przeciwko (H+/K+) ATP-azie komórek ściennych żołądka, w połączeniu z objawami klinicznymi i innymi badaniami laboratoryjnymi, może być stosowana w celu wsparcia diagnostyki stanów charakteryzujących się podwyższonym poziomem przeciwciał przeciwko (H+/K+) ATP-azie komórek ściennych żołądka włączając w to niedokrwistość złośliwą. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Niedokrwistość złośliwa jest chorobą przewlekłą i stanowi ostatnie stadium przewlekłego (autoimmunologicznego) zanikowego zapalenia błony śluzowej żołądka typu A. Przewlekłe zanikowe zapalenie błony śluzowej żołądka typu A atakuje dno i trzon żołądka, a w typie B (nieautoimmunologicznym) dochodzi do uszkodzenia jamy odźwiernikowej żołądka oraz jego dna i trzonu. Typ A choroby wiąże się z występowaniem niedokrwistości złośliwej, natomiast typ B powiązany jest z infekcją drobnoustrojem H. pylori 1-3. Gdy przewlekłe zanikowe zapalenie błony śluzowej żołądka typu A postępuje w kierunku zaniku komórek ściennych żołądka, wówczas komórki te, produkujące czynnik wewnętrzny oraz HCl, ulegają zniszczeniu i zatrzymana zostaje produkcja czynnika wewnętrznego i HCl. Czynnik wewnętrzny jest niezbędny do wchłaniania witaminy B 12 z jelita a jego brak prowadzi do niedoboru witaminy B 12 i niedokrwistości megaloblastycznej. Zazwyczaj niedokrwistość złośliwa rozwija się powoli a proces przekształcania się przewlekłego zanikowego zapalenia błony śluzowej żołądka w zanik komórek ściennych i kliniczną postać niedokrwistości trwa lat. Średni wiek pacjentów, u których diagnozuje się tę chorobę wynosi 60 lat. Chociaż choroba ta często pozostaje nierozpoznana do chwili pojawienia się poważnych objawów niedokrwistości lub innych objawów, to powodujące je wrzody żołądka można wykryć na kilka lat przed jej rozwinięciem 3,4. U pacjentów z niedokrwistością złośliwą obserwuje się zwiększoną częstość występowania chorób autoimmunologicznych, w tym autoimmunologicznego zapalenia tarczycy (choroba Hashimoto), cukrzycy typu 1, choroby Addisona, choroby Gravesa-Basedowa oraz miastenii. U pacjentów z niedokrwistością złośliwą ryzyko wystąpienia raka żołądka jest 3x większe a ryzyko wystąpienia rakowiaka żołądka jest 13x większe 5. Autoprzeciwciała przeciwko komórkom ściennym żołądka występują u około 90% pacjentów z niedokrwistością złośliwą i około 30% krewnych pierwszego stopnia pacjentów z niedokrwistością złośliwą 1-3. Przeciwciała przeciwko komórkom ściennym żołądka (GPA) wykrywa się zazwyczaj metodą immunofluorescencji pośredniej (IFA) z zastosowaniem skrawków śluzówki żołądka gryzonia 2. Przeciwciała przeciwko komórkom ściennym żołądka skierowane są przeciwko antygenowi związanemu z błoną komórkową w kanaliku wydzielniczym i komórkach ściennych żołądka 6. Zidentyfikowano, że celem działania GPA jest żołądkowa H+/K+ ATP-aza (żołądkowa pompa protonowa), która odpowiedzialna jest za zakwaszanie światła żołądka GPA wiąże się zarówno z podjednostką α jak i podjednostką β H+/K+ ATPazy 9. Częstość występowania GPA zwiększa się wraz z wiekiem i wykryto je u 2,5% zdrowej populacji w wieku lat i 9,6% populacji w ósmej dekadzie życia 3. Niedawne badanie wykazało, że u pacjentów z cukrzycą typu 1 jest duża częstość występowania GPA oraz towarzyszącej temu autoimmunologicznej choroby żołądka, co stanowi silną przesłankę za tym, aby diabetyków z niedokrwistością i/lub objawami ze strony przewodu pokarmowego badać na obecność GPA 12. Podwyższony poziom GPA stwierdzono u pacjentów z chorobą tarczycy, niedokrwistością z niedoboru żelaza, łysieniem plackowatym i bielactwem nabytym 13,14. Wykrywanie przeciwciał GPA metodą IFA jest pracochłonne, wymaga subiektywnej interpretacji wyników przez wysoko przeszkolony personel i podlega zmienności jakości i powtarzalności ze względu na skrawki tkankowe używane do produkcji preparatów IFA. W celu identyfikacji podjednostek α i β żołądkowej H+/K+ ATP-azy stanowiących cząsteczkowy cel działania przeciwciał przeciwko komórkom ściennym żołądka skonstruowano czułe i swoiste testy ELISA wykrywające przeciwciała GPA 15. Zastosowanie testów ELISA umożliwia otrzymanie ustandaryzowanych, powtarzalnych i obiektywnych wyników dla GPA. Zasada badania Oczyszczony antygen H+/K+ ATP-azy wyizolowany ze śluzówki świni wiąże się z dołkami płytki polistyrenowej w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego stanie natywnym. Wstępnie rozcieńczone kontrole oraz surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków, umożliwiając związanie wszelkich występujących przeciwciał przeciwko H+/K+ ATP-azie z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciwludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. 1

2 Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym antygenem H+/K+ ATP-azy (12-1 x 8 dołków), z uchwytem, w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko H+/K+ ATP-azie, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Słabo pozytywna kontrola GPA ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko H+/K+ ATP-azie, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Silnie pozytywna kontrola GPA ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko H+/K+ ATP-azie, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HbsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną kontrolę testu GPA ELISA, wysoko pozytywną kontrolę testu GPA ELISA oraz kontrolę negatywną ELISA należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 2

3 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami GPA ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu GPA ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu GPA ELISA i kontroli negatywnej ELISA. 4. Oznaczanie obecności lub braku przeciwciał przeciwko H+/K+ ATP-azie, z zastosowaniem jednostek umownych wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli i jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. 3

4 Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu GPA ELISA, kontroli negatywnej testu ELISA i rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą testu GPA ELISA, silnie pozytywną kontrolą testu GPA ELISA i kontrolą negatywną ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola testu GPA ELISA, silnie pozytywna kontrola testu GPA ELISA i kontrola negatywna testu ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze - 20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu GPA ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu GPA ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej negatywnej kontroli ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA musi być ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej ELISA lub być większa niż 0,25. d. Kontrola negatywna testu ELISA i silnie pozytywna kontrola testu GPA ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Silnie pozytywna kontrola testu GPA ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie NCCLS C24-A. 17 4

5 Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA, którą można znaleźć na etykiecie. Gęstość optyczna próbki x słabo pozytywna Wartość próbki = kontrola testu GPA ELISA (jednostki) gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu GPA ELISA (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, niejednoznaczna lub pozytywna (wykryte zostaje przeciwciało IgG przeciwko H+/K+ ATP-azie), zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywna 0,0-20,0 Niejednoznaczne 20,1 24,9 Pozytywne 25 Niejednoznaczne próbki powinny zostać ponownie przebadane przed przedstawieniem wyników. 1. Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał przeciwko H+/K+ ATP-azie i sugeruje możliwość wystąpienia niedokrwistości złośliwej lub chorób pokrewnych. 2. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała przeciwko H+/K+ ATP-azie, lub że ich poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania. 3. Próbka z niejednoznacznym poziomem GPA nie może być oznaczona pod kątem statusu przeciwciał. Jeśli wyniki nadal są niejednoznaczne po powtórzonym badaniu, wynik należy zaraportować jako niejednoznaczny i/lub pobrać dodatkową próbkę. 4. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki otrzymano przy wykorzystaniu testu INOVA QUANTA Lite TM GPA ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości GPA uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu. 2. Negatywny wynik testu na obecność przeciwciał przeciwko komórkom ściennym żołądka nie wyklucza niedokrwistości złośliwej. 3. Negatywny wynik na obecność przeciwciał GPA nie wyklucza obecności przeciwciał GPA, ponieważ stężenie przeciwciał może być poniżej granicy wykrywania dla tego testu. 4. Wynik pozytywny świadczy jedynie o występowaniu przeciwciał przeciwko H+/K+ ATP-azie i nie koniecznie może wskazywać na chorobę autoimmunologiczną lub inną chorobę. 5. To badanie nie zostało zatwierdzone do stosowania w przypadku populacji dziecięcej. 6. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 7. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Zdolność testu QUANTA Lite GPA ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko H+/K+ ATP-azie oceniano poprzez porównanie z dostępnym w handlu zestawem H+/K+ ATPase ELISA. Przeprowadzono również porównanie wyników otrzymanych z zastosowaniem testu QUANTA Lite GPA ELISA i testu pośredniej immunofluorescencji z wykorzystaniem skrawków tkanki nerki/żołądka myszy. Częstość występowania GPA w populacjach osób zdrowych rośnie wraz z wiekiem od około 2,5% w trzeciej dekadzie życia do 9,6% w ósmej dekadzie. Występowanie GPA obserwowane jest częściej u kobiet niż u mężczyzn. W przypadku mężczyzn w wieku poniżej 55 lat u 5,5% z nich występują GPA w porównaniu z 14,7% kobiet. W przypadku osób powyżej 55 roku życia GPA występowały u 9,2% mężczyzn i 22,3% kobiet 4. 5

6 Normalny zakres Przy użyciu zestawu QUANTA Lite GPA ELISA przebadano 210 próbek pochodzących od zdrowych osób nie wykazujących żadnych objawów. Zakres wiekowy wynosił od 17 do 77 lat (mediana=32). Z tych 210 próbek, 154 (73,3%) pochodziło od mężczyzn a 56 (26,7%) od kobiet. Średnia wartość wynosiła 7,3 jednostki w zakresie od 1,3 do 84,1 jednostki. Dwie z 7 próbek zawierających GPA dało wynik pozytywny w teście GPA IFA. Przy wyłączeniu 4 próbek dających wynik niejednoznaczny swoistość testu ustalono na 96,6% (199/206). Swoistość i wrażliwość względna Wyniki uzyskane dla 20 próbek pochodzących od pacjentów z niedokrwistością złośliwą badanych z zastosowaniem testu QUANTA Lite GPA ELISA i predykatowego zestawu GPA ELISA pokazano w tabeli 1. Porównanie wyników dla tych próbek uzyskanych z przy zastosowaniu metody IFA z wykorzystaniem preparatów nerki/żołądka myszy przedstawiono w tabeli 2. W tabeli 3 przedstawiono porównanie wyników dla 41 próbek uzyskanych z zastosowaniem QUANTA Lite GPA ELISA i predykatowego zestawu GPA ELISA. Tabela 1: Wyniki dla próbek pochodzących od pacjentów z niedokrwistością złośliwą badanych przy użyciu testu QUANTA Lite GPA i predykatowego testu GPA ELISA Wyniki QUANTA Lite GPA ELISA Predykatowy test GPA ELISA n=20 Pozyt. (15) EQ (0) Negat. (5) Pozytywna Pozyt. (14) Niejednoznaczna EQ (5) Negatywny Negat. (1) Zgodność (przy wykluczeniu wyników niejednoznacznych): 100% (15/15) Tabela 2: Wyniki dla próbek pochodzących od pacjentów z niedokrwistością złośliwą badanych przy użyciu testu QUANTA Lite GPA i testu ANA IFA (nerka/żołądek myszy) Wyniki testu QUANTA Lite GPA ELISA GPA IFA N = 20 Pozyt. (15) EQ (0) Negat. (5) Pozytywna Pozyt. (15) Niejednoznaczna EQ (0) Negatywny Negat. (5) Zgodność: 100% (20/20) Tabela 3: Wyniki dla próbek zgłoszonych do testu na obecność GPA, badanych przy użyciu testu QUANTA Lite GPA i predykatowego testu GPA ELISA Predykatowy test GPA Wyniki testu QUANTA Lite GPA ELISA ELISA N=41 Pozyt. (19) EQ (2) Negat. (20) Pozytywna Pozyt. (22) Niejednoznaczna EQ (0) Negatywny Negat. (19) Zgodność (przy wykluczeniu wyników niejednoznacznych): 89,7% (35/39) Badanie reaktywności krzyżowej Surowice pochodzące od pacjentów z przeciwciałami związanymi z chorobami autoimmunologicznymi i zakaźnymi lub różnymi stanami klinicznymi włączając w to przeciwciała przeciwko H. pylori (7), peroksydazie tarczycowej (5), antygenowi tarczycy M (5), antygenowi tarczycy T (4), beta-2 glikoproteinie (5), LKM-1 (5), występujące w autoimmunologicznym zapaleniu wątroby typu 1 (14), antygenowi mitochondriów M2 (4) badano pod kątem reaktywności krzyżowej przy użyciu testu QUANTA Lite GPA ELISA. Jedna próbka H.pylori i 2 próbki TPO dały w teście QUANTA Lite GPA ELISA wynik pozytywny. Te 3 próbki dały z teście GPA IFA wynik pozytywny. Precyzja i powtarzalność Wydajność w obrębie badania dla testu QUANTA Lite GPA ELISA oceniano, testując 6 próbek po 9 razy każdą. Podsumowane w tabeli 4 wyniki wskazują precyzję w obrębie badania. Tabela 4: Wyniki w ramach badania QUANTA Lite GPA ELISA Próbka A Próbka B Próbka C Próbka D Próbka E Próbka F Jednostki średnie 40,7 93,4 35,4 58,3 47,0 10,5 SD 2,3 5,7 3,2 5,4 5,1 0,7 CV % 5,6 6,1 9,0 9,2 10,8 6,9 Wyniki pomiędzy badaniami oceniono, przeprowadzając dwukrotnie badanie panelu 5 próbek 2 razy dziennie przez 3 dni. Tabela 5: Wyniki pomiędzy badaniami QUANTA Lite GPA ELISA Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Jednostki średnie 32,7 95,2 11,4 32,9 5,9 SD 1,61 2,25 0,37 1,77 0,42 CV % 4,9 2,4 3,2 5,4 7,1 6

7 Piśmiennictwo 1. Gleeson PA and B-H Toh. Molecular Targets in Pernicious Anemia. Immunology Today 12(7): , Gleeson PA, Van Driel IR and B-H Toh. Parietal Cell Antibodies. In: Autoantibodies. Peter JB and Y Shoenfeld, eds., Elsevier Science B.V. pp , Toh B-H, Van Driel IR and PA Gleeson. Pernicious Anemia. N. Eng. J. Med. 37(20): , Lee GR. Pernicious Anemia and other causes of vitamin B12 (cobalamin) deficiency. In: Wintrobe s Clinical Hematology, 10 th ed, Williams & Wilkins, pp , Hsing AW, Hansson L-E, McLaughlin JK, et al. Pernicious anemia and subsequent cancer: a population-based cohort study. Cancer 71: , Hoedemaeker PJ and S Ito. Ultrastructural localization of gastric parietal cell antigen with peroxidasecoupled antibody. Lab. Invest. 22: , Burman P, Mardh S, Norberg L and FA Karlsson. Parietal cell antibodies in pernicious anemia inhibit H+/K+ -adenosine triphosphatase, the proton pump of the stomach. Gastroenterol. 96: , Toh B-H, Gleeson PA, Simpson RJ, et al. The 60- to 90 kda parietal cell autoantigen associated with autoimmune gastritis is a β subunit of the gastric H+/K+ ATPase (proton pump). PNAS 87: , Callagham JM, Khan MA, Alderuccio F, Van Driel IR, Gleeson PA and B-H Toh. α and β subunits of the gastric H+/K+ ATPase are concordantly targeted by parietal cell autoantibodies associated with autoimmune gastritis. Autoimmun. 16: , Ma JY, Borch K and S Mardh. Human gastric H,K-adenosine triphosphatase β-subunit is a major autoantigen in atrophic corpus gastritis. Expression of the recombinant human glycoprotein in insect cells. Scand. J. Gastroenterol. 29: , Claeys D, Galler G, Appelmelk BJ, Negrini R and T Kirchner. The gastric H+/K+-ATPase is a major autoantigen in chronic Helicobacter pylori gastritis with body mucosa atrophy. Gastroenterol. 115: , DeBlock CRM, DeLeeuw IH, Van Gaal LF and the Belgian Diabetes Registry. High prevalence of manifestations of gastric autoimmunity in parietal cell antibody-positive type 1 (insulin-dependent) diabetic patients. J. Clin. Endocrin. Metab. 84(1): , Mandry, RC, Ortiz LJ, Lugo-Somolinos A and JL Sanchez. Organ-specific autoantibodies in Vitiligo patients and their relatives. Int. J. Dermatol. 35(1): , Kumar B, Sharma VK and S Sehgal. Anti-smooth muscle and anti-parietal cell antibodies in Indians with alopecia areata. Int. J. Dermatol. 34(8): , Chuang JS, Callagham JM, Gleeson PA and B-H Toh. Diagnostic ELISA for parietal cell autoantibody using tomato lectin-purified gastric H+/K+-ATPase (proton pump). Autoimmun. 12:1-7, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) ). 17. National Committee for Clinical Laboratory Standards,1991. Internal Quality Control: Principles and Definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol 11(6). 7

8 QUANTA Lite i INOVA Diagnostics, Inc. są zastrzeżonym znakiem handlowym firmy Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Sierpień 2011 Wersja 0 8