QUANTA Lite Gliadin IgG ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite Gliadin IgG ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie Test QUANTA Lite TM IgG gliadyny to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowego oznaczania przeciwciał IgG przeciwko gliadynie w surowicy ludzkiej. Wykrywanie tych przeciwciał wspomaga diagnozę pewnychenteropatii związanych z nadwrażliwością na gluten, takich jak celiakia i zapalenie opryszczkowate skóry. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Celiakia lub enteropatia związana z nadwrażliwością na gluten to choroba przewlekła, której główne cechy obejmują stan zapalny i charakterystyczne histologiczne spłaszczenie błony śluzowej przewodu pokarmowego, którego skutkiem jest zespół złego wchłaniania. Dokładna etiologia choroby pozostaje nieznana, ale gliadyna lub rozpuszczalna w alkoholu frakcja glutenu pszennego jest zdecydowanie czynnikiem toksycznym. 1 Początkowo w celu zdiagnozowania celiakii i zaburzeń pokrewnych wykonywano szereg wielokrotnych biopsji jelitowych. Ostatnio zasugerowano wykonywanie badań serologicznych jako badań przesiewowych wykonywanych u pacjentów z podejrzeniem enteropatii związanej z nadwrażliwością na gluten, jak również do monitorowania przestrzegania diety. 2-5 Europejskie Towarzystwo Gastroenterologii Pediatrycznej i Żywienia (European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN)) w celu zmniejszenia liczby biopsji jelita potrzebnych do postawienia rozpoznania zaleciło stosowanie markerów serologicznych, takich jak gliadyna, jak również przeciwciał przeciwko retikulinie (białko tkanki łącznej układu chłonnego) i śródmięsnej. 6 U pacjentów cierpiących na enteropatię związaną z nadwrażliwością na gluten w surowicy wykrywane są zarówno przeciwciała IgA jak i IgG. 2,3 Wydaje się, że przeciwciała IgG przeciw gliadynie są czulszymi, lecz również mniej swoistymi markerami choroby niż przeciwciała klasy IgA. Przeciwciała IgA gliadyny są mniej wrażliwe, ale bardziej swoiste. Strategia stosowania czułych testów przesiewowych w populacji o podwyższonym ryzyku obejmuje badania zarówno w kierunku obecności przeciwciał IgG jak i IgA przeciwko gliadynie, jako że znaczna część pacjentów z celiakią to chorzy z niedoborem IgA. 7 Przeciwciała IgA przeciwko gliadynie są ważne w ocenie aktywności choroby w czasie oraz w celu monitorowania skuteczności stosowania diety bezglutenowej. 5 Zasada badania Oczyszczony antygen gliadyny wiąże się z dołkami płytek polistyrenowych w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego stanie natywnym. Rozcieńczone wstępnie próbki kontrolne i rozcieńczone surowice pochodzące od pacjentów dodaje się do oddzielnych dołków, co umożliwia związanie się wszelkich występujących w próbce przeciwciał IgG przeciwko gliadynie z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowe płytki z mikrodołkami ELISA pokryte oczyszczonym antygenem gliadyny (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna testu ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko IgG gliadyny, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Słabo pozytywna kontrola testu ELISA IgG gliadyny, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko IgG gliadyny, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Silnie pozytywna kontrola testu ELISA IgG gliadyny, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko IgG gliadyny, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 1

2 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344 M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (0,02% chloramfenikol) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HbsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną kontrolę testu ELISA IgG gliadyny, silnie pozytywną kontrolę testu ELISA IgG gliadyny i kontrolę negatywną testu ELISA należy obsługiwać w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. 2

3 Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami ELISA IgG gliadyny (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ELISA IgG gliadyny 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu ELISA IgG gliadyny 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu ELISA IgG gliadyny, silnie pozytywnej kontroli testu ELISA IgG gliadyny i kontroli negatywnej testu ELISA. 4. W celu stwierdzenia obecności lub braku IgG przeciwko gliadynie z zastosowaniem jednostek arbitralnych, potrzebne są po dwa dołki na każdą z trzech kontroli i jeden do dwóch dołków na każdą próbkę pochodzącą od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. 3

4 Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ELISA IgG gliadyny, silnie pozytywnej kontroli testu ELISA IgG gliadyny, kontroli negatywnej testu ELISA i rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Dodać µl rozcieńczonego buforu do płukania HRP do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 µl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą testu ELISA IgG gliadyny, silnie pozytywną kontrolą testu ELISA IgG gliadyny i kontrolą negatywną testu ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola testu ELISA IgG gliadyny, wysoko pozytywna kontrola testu ELISA IgG gliadyny i kontrola negatywna testu ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze -20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu ELISA IgG gliadyny musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ELISA IgG gliadyny, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli testu ELISA IgG gliadyny musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ELISA IgG gliadyny musi być ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej testu ELISA lub być większa niż 0,25. d. Kontrola negatywna testu ELISA i silnie pozytywna kontrola testu ELISA IgG gliadyny mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Silnie pozytywna kontrola testu ELISA IgG gliadyny nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI (NCCLS) C24-A. 4

5 Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli testu ELISA IgG gliadyny. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu ELISA IgG gliadyny, którą można znaleźć na etykiecie. Gęstość optyczna próbki x słabo pozytywna kontrola Wartość próbki = testu ELISA IgG gliadyny (jednostki) Gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu ELISA IgG gliadyny (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, średnio pozytywna lub silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywny <20 Słabo pozytywna Możliwe są wyniki od średnio pozytywnych do Silnie pozytywna >30 1. Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał IgG przeciwko gliadynie i sugeruje możliwość występowania pewnych enteropatii związanych z nadwrażliwością na gluten, takich jak celiakia i opryszczkowe zapalenie skóry. 2. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała IgG przeciwko gliadynie bądź ich poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania. 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki otrzymano przy wykorzystaniu zestawu ELISA INOVA QUANTA Lite IgG gliadyny. Nie można stosować zamiennie wartości IgG przeciwko gliadynie uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Negatywny wynik dla IgA przeciwko gliadynie u nieleczonego pacjenta nie wyklucza enteropatii związanej z nadwrażliwością na gluten, zwłaszcza gdy jednocześnie występuje u niego wysoki poziom przeciwciał IgG przeciwko gliadynie. Wynik taki można często wyjaśnić, występującym względnie często w celiakii, selektywnym niedoborem IgA. 2. U leczonych pacjentów z ekspresją przeciwciał IgA, poziom IgA przeciwko gliadynie jest lepszym wskaźnikiem przestrzegania diety niż stężenie przeciwciał IgG przeciwko gliadynie. 3. Możliwe są wyniki fałszywie pozytywne (wysokie poziomy przeciwciał bez charakterystycznych wyników histologicznych). Wiadomo, że inne schorzenia żołądkowojelitowe mogą indukować pojawienie się w układzie krążenia przeciwciał przeciwko gliadynie; są to głównie choroba Crohna, nietolerancja pokarmowa białek (mleko krowie) i zespół złego wchłaniania po infekcji. 4. Związek między opryszczkowatym zapaleniem skóry i enteropatią związaną z nadwrażliwością na gluten jest tak silny, że sugeruje się, że obydwie choroby mają taką samą etiologię; u pacjentów tych, określenie przeciwciał przeciwko gliadynie jest przydatne do wykrywania objawów celiakii oraz oszacowania stopnia zajęcia układu pokarmowego. 5. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 6. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. 5

6 Spodziewane wartości Zdolność testu ELISA QUANTA Lite IgG gliadyny do wykrywania przeciwciał IgG przeciwko gliadynie oceniano poprzez porównanie z dostępnym w handlu testem ELISA. Wyniki testu ELISA ustalono zgodnie z broszurą jego producenta. Normalny zakres Próbki pochodzące od stu dwóch losowo wybranych krwiodawców przebadano na obecność przeciwciał IgG przeciwko gliadynie. Pięć próbek (5%) wypadło powyżej 20-jednostkowej wartości granicznej. Najwyższa wartość spośród tych 5 wyników pozytywnych wynosiła 34 jednostki. Średnia wartość dla 102 próbek wyniosła 7,4 jednostki ze standardowym odchyleniem 6,4 jednostki. Średnia wartość wynosi 2 standardowych odchyleń poniżej 20-jednostkowej wartości granicznej. 20- jednostkowa wartość graniczną stosuje się zarówno dla populacji dziecięcej jak i dorosłej. Swoistość i wrażliwość względna Osiemdziesiąt jeden próbek wysłane do dużego laboratorium referencyjnego w celu oceny celiakii i przebadano za pomocą testu ELISA QUANTA Lite IgG gliadyny oraz innego zestawu dostępnego w handlu. Wyniki przedstawiono poniżej. INOVA Wrażliwość względna 94,3% Referencje Swoistość względna 89,3% Skuteczność względna 92,6% Pięćdziesiąt próbek było pozytywne według obu metod, a 25 próbek było negatywnych według obu metod. Trzy próbki były pozytywne w teście INOVA, ale negatywne w metodzie referencyjnej. Wszystkie trzy z tych próbek były jedynie słabo pozytywne (21, 25 i 27 jednostek). Trzy inne próbki były pozytywne w metodzie referencyjnej i negatywne w teście INOVA. Wszystkie trzy próbki były słabo pozytywne według metody referencyjnej (23, 24 i 29 jednostek) przy wartości granicznej wynoszącej 20 jednostek. Próbki od dziesięciu pacjentów z aktywną postacią celiakii przebadano zarówno przy użyciu testu INOVA jak i metody referencyjnej. Próbki od wszystkich dziesięciu pacjentów dały w obu metodach pozytywny wynik przeciwciał IgG przeciwko gliadynie. Przy użyciu obu metod przebadano dwunastu pacjentów cierpiących na różne dolegliwości ze strony przewodu pokarmowego bez aktywnej postaci celiakii. Trzy z tych próbek były pozytywne w teście INOVA oraz metodzie referencyjnej. Swoistość i wrażliwość kliniczna Zestawy ELISA QUANTA Lite IgG i IgA gliadyny oceniono w dwóch zewnętrznych badaniach klinicznych. Poniższa tabela podsumowuje wyniki zarówno zewnętrznych oraz wewnętrznych badań klinicznych. Podsumowanie wyników uzyskanych w badaniach klinicznych Grupa pacjentów Liczba Obecność IgA Obecność IgG Obecność G i/lub A Celiakia, nieleczona 62 a 44 (71%) 54 (87%) 59 (95%) Celiakia, pacjent na diecie 32 5 b (16%) 17 (53%) 17 (53%) Inna choroba przewodu pokarmowego (2%) 20 (15%) 20 (15%) Wątpliwa celiakia 20 2 c (10%) 4 (20%) 5 d (25%) SLE 29 1 (3%) 1 (3%) 1 (3%) Zespół Sjögrena 26 1 (4%) 0 (0%) 1 (4%) Twardzina Zapalenie wielomięśniowe Normalne (1%) 5 (5%) 5 (5%) a. Przynajmniej dwóch pacjentów w tej grupie miało udokumentowany niedobór IgA. Obaj pacjenci mieli negatywny wynik IgA, ale pozytywny wynik IgG. b. Trzech z pięciu pacjentów pozytywnych miało wyniki jedynie słabo pozytywne (<30 jednostek). c. Obaj pacjenci mieli wyniki jedynie słabo pozytywne (<30 jednostek). d. Jeden pacjent z wynikiem pozytywnym IgG i IgA przeciw gliadynie oraz przeciwciałami przeciw śródmięsnej mimo wątpliwych wyników biopsji mógł już mieć aktywną lub rozwijającą się celiakię. 6

7 W tabeli poniżej przedstawiono czułość i swoistość testów na obecność IgG i IgA przeciw gliadynie oraz łączną czułość i swoistość dla powyższych grup pacjentów. Czułość Swoistość IgA przeciw gliadynie 71% 97,6% IgG przeciw gliadynie 87% 91,0% IgG, IgA lub oba 95% 90,0% Reaktywność krzyżowa Aby ocenić kwestie potencjalnej reaktywności krzyżowej z innymi autoprzeciwciałami, za pomocą zestawu ELISA QUANTA Lite IgG gliadyny przebadano wiele różnych, dających pozytywne wyniki, próbek o wysokich mianach autoprzeciwciał. Ogółem, przeprowadzono badania dla 28 próbek. Wiele próbek stanowiło wysoko pozytywną kontrolę z innych zestawów testowych autoprzeciwciał INOVA QUANTA Lite. Swoistości obejmowały dwuniciowe DNA (ds)dna, histony, Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, tarczycę, mitochondria, mięśnie gładkie, PR-3, MPO i kardiolipinę. Średnia wartość dla tych 28 próbek wyniosła 4,5 jednostek. Najwyższa próbka miała 20 jednostek. Średnia wartość wynosi 3,0 odchyleń standardowych poniżej 20-jednostkowej wartości granicznej. Następujące grupy pacjentów z chorobami tkanki łącznej zbadano pod kątem występowania przeciwciał IgG przeciwko gliadynie. Tylko jeden pacjent z SLE miał wynik pozytywny (32 jednostki). Wszyscy spośród tych pacjentów mieli wyniki pozytywne dla innych autoprzeciwciał. Wszyscy pacjenci z SLE mieli wyniki pozytywne dla Sm, dsdna lub obu z nich. Wszyscy pacjenci z zespołem Sjögrena mieli wyniki pozytywne dla SS-A, SS-B lub obu z nich. Wszyscy pacjenci z twardziną mieli wyniki pozytywne dla Scl-70 i wszystkich 6 pacjentów z zapaleniem wielomięśniowym miało wyniki pozytywne dla Jo-1. Grupa pacjentów Nr Liczba wyników pozytywnych SLE 29 1 Zespół Sjögrena 26 0 Twardzina 10 0 Zapalenie wielomięśniowe 6 0 Precyzja i powtarzalność Precyzja i powtarzalność badania zostały przebadane przez oznaczenie sześciu powtórzeń każdej silnie pozytywnej i umiarkowanie pozytywnej próbki przez cztery kolejne dni. Średnia reaktywność silnie pozytywnych wynosiła 103,5 jednostki, a wartość średnia umiarkowanie pozytywnych wynosiła 33,0. Poniżej znajduje się podsumowanie odchylenia standardowego oraz współczynnika zmienności dla każdej próbki. Silnie pozytywna Średnio pozytywna SD CV SD CV Łącznie 3,1 3,0% 1,1 3,2% W ramach serii 3,1 3,0% 1,1 3,3% Pomiędzy seriami 3,4 2,9% 1,0 3,1% 7

8 Piśmiennictwo 1. Trier JS: Celiac Sprue. N Engl J Med 325: , Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: , McMillan SA, Haughton DJ, et al.: Predictive value for coeliac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. J Intern Med 241: , Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Arch Dis Child 66: , Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Arch Dis Child 65: , Collin P, et al.: Selective IgA deficiency and coeliac disease. Scand J Gastroenterol 27: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition QUANTA Lite i INOVA Diagnostics, Inc. są zastrzeżonym znakiem handlowym firmy Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Sierpień 2011 Wersja 0 8