RT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6

Transkrypt

1 RT31-020, RT31-100

2 RT31-020, RT Zestaw TRANSCRIPTME RNA zawiera wszystkie niezbędne składniki do przeprowadzenia syntezy pierwszej nici cdna na matrycy mrna lub całkowitego RNA. Uzyskany jednoniciowy cdna nadaje się do stosowania w kolejnych etapach reakcji RT-PCR i/lub RT-qPCR. Zestaw TRANSCRIPTME RNA został opracowany w celu zapewnienia wysokiej wydajności syntezy cdna oraz zwiększenia czułości reakcji RT-qPCR. Pozwala na syntezę cdna w zakresie 10 pg 5 µg matrycowego RNA. W skład zestawu wchodzi TRANSCRIPTME Enzyme Mix zawierający rekombinowaną termostabilną odwrotną transkryptazę M-MuLV (bez aktywności RNazy H) oraz inhibitor RNaz RIBOPROTECT; ponadto zoptymalizowany bufor reakcyjny zawierający mieszaninę starterów oligo(dt) 18, random heksamerów X 6, MgCl 2 oraz mieszaninę dntps. Odwrotna transkryptaza TRANSCRIPTME charakteryzuje się podwyższoną termostabilnością, co umożliwia prowadzenie reakcji w wyższej temperaturze (optimum aktywności w temp. 50 C). Dzięki temu zwiększona zostaje wydajność i specyficzność transkrypcji regionów RNA z dużą zawartością par GC i/lub struktur drugorzędowych. Enzym nie posiada aktywności RNazy H i 3 5 egzonukleazy, umożliwiając tworzenie produktów cdna o długości powyżej 10 kb. Zastosowanie rekombinowanego inhibitora RNaz RIBOPROTECT zabezpiecza matrycowe RNA przed degradacją. Do zestawu dołączona jest również RNaza H, która służy do specyficznej degradacji RNA w hybrydach RNA:cDNA tworzonych po syntezie pierwszej nici cdna. Ten opcjonalny etap może znacznie poprawić czułość reakcji RT-qPCR, poprzez zwiększenie dostępności miejsc wiązania się starterów do matrycy cdna w reakcji PCR. Trawienie RNazą H jest zalecane w przypadku wysokich stężeń wyjściowego matrycowego RNA, a także układów PCR wrażliwych na obecność pozostałości RNA. DNA-Gdańsk info@dnagdansk.com

3 Właściwości i zalety Wysoka wydajność syntezy pełnej długości produktów cdna (nawet >10 kb) Zwiększona czułość w reakcjach RT-qPCR i RT-PCR Zmniejszona do minimum ilość etapów pipetowania obniżone ryzyko wprowadzenia kontaminacji Zestaw zawiera zarówno oligo(dt) 18 jak i random heksamery X 6, dzięki czemu możliwa jest jednoczesna synteza cdna na matrycy mrna oraz rrna Materiał wyjściowy: 10 pg do 5 µg całkowitego RNA Optymalna temperatura reakcji: 50 C Odwrotna transkryptaza bez aktywności RNazy H oraz 3 5 egzonukleazy o podwyższonej termostabilności, odpowiednia do amplifikacji trudnych matryc RNA Inhibitor RNaz zabezpiecza matrycowe RNA przed degradacją Dodatkowy etap trawienia RNazą H może znacznie poprawić czułość reakcji RT-qPCR w przypadku układów wrażliwych na obecność pozostałości RNA po syntezie cdna Zastosowania Synteza pierwszej nici cdna w RT-PCR i RT-qPCR Konstrukcja bibliotek cdna Analiza RNA

4 RT31-020, RT Protokół syntezy pierwszej nici cdna 1. Do sterylnej, wolnej od nukleaz probówki typu Eendorf umieszczonej w lodzie lub w statywie mrożeniowym należy dodać następujące składniki reakcji we wskazanej kolejności (dla większej ilości prób zaleca się przygotowanie Master Mix-u bez matrycowego RNA): Składnik Ilość 2x RT Master Mix 10 µl TRANSCRIPTME Enzyme Mix 2 µl RNA 5 µg woda wolna od nukleaz uzupełnić do 20 µl 2. Delikatnie wymieszać i inkubować w temp. 25 C przez 10 min. 3. Inkubować w temp. 50 C przez 30 min. 4. Inaktywować reakcję poprzez ogrzewanie w temp. 85 C przez 5 min., a następnie niezwłocznie schłodzić w lodzie. Opcjonalnie *: dodać 1 µl RNazy H i inkubować w temp. 37 C przez 20 min., a następnie inaktywować reakcję przez ogrzewanie w temp. 85 C przez 5 min. * Etap trawienia RNazą H może znacznie poprawić czułość reakcji RT-qPCR w przypadku układów wrażliwych na obecność pozostałości RNA. 5. Produkt cdna może być użyty bezpośrednio w reakcjach PCR lub qpcr (nierozcieńczony lub rozcieńczony w wodzie wolnej od nukleaz lub w TE), bądź przechowywany w temp. -20 C lub -70 C do czasu dalszych analiz.

5 Praca z RNA Wysoka jakość nienaruszonego RNA, wolnego od pozostałości genomowego DNA i RNaz jest istotna do syntezy wysokiej jakości pełnej długości produktów cdna oraz dokładnej analizy ilościowej RNA (qpcr). W związku z tym należy przestrzegać następujących zaleceń dotyczących pracy z RNA: Utrzymywać aseptyczne warunki pracy: używać jednorazowych rękawiczek i w miarę potrzeby często je zmieniać; używać probówek i tipsów wolnych od RNaz (RNase-free); wyznaczyć specjalny obszar i sprzęt do pracy tylko z RNA. DNaza I (brak w zestawie) może być zastosowana w celu wyeliminowania zanieczyszczeń genomowym DNA w wyjściowych preparatach RNA. Preparaty RNA powinny być przechowywane w temp. -70 C, najlepiej rozporcjowane. Należy unikać częstego rozmrażania/zamrażania próbek.

6 Dodatkowe informacje Do izolacji całkowitego RNA z tkanek zwierzęcych lub linii komórkowych polecamy zestaw EXTRACTME TOTAL RNA (EM09) lub EXTRACTME TOTAL RNA PLUS (EM11). Wszystkie odczynniki zestawu TRANSCRIPTME RNA należy przechowywać w lodzie lub w statywie mrożeniowym podczas przygotowywania reakcji RT-PCR. Wszystkie odczynniki zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte w temp. -20 C lub -70 C. W przypadku układów wrażliwych na obecność pozostałości RNA można poprawić czułość reakcji RT-PCR lub RT-qPCR poprzez przeprowadzenie trawienia RNazą H. Podczas przeprowadzania reakcji PCR lub qpcr na matrycy zsyntetyzowanego cdna, należy użyć cdna w ilości nie większej niż 1/10 końcowej objętości reakcji PCR, np. 2,5 µl cdna w 25 µl reakcji PCR. Aktywność odwrotnej transkryptazy TRANSCRIPTME hamowana jest w obecności substancji chelatujących jony metali (np. EDTA), nieorganicznego fosforanu, pirofosforanu i poliamin. Kontrola jakości Preparat wolny od nukleaz oraz zanieczyszczeń kwasami nukleinowymi. Produkt testowano w reakcjach odwrotnej transkrypcji, a następnie na otrzymanych matrycach cdna przeprowadzono szereg reakcji PCR i qpcr. DNA-Gdańsk info@dnagdansk.com

7 Możliwe problemy i ich rozwiązywanie Problem Prawdopodowna przyczyna Rozwiązanie Brak lub niska wydajność syntezy cdna RNA jest podegradowane Zalecane jest przechowywanie RNA w temp. -70 C. Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek. Po rozmrożeniu próbka RNA powinna być niezwłocznie umieszczona w lodzie lub w statywie mrożeniowym. Należy sprawdzić jakość wyizolowanego RNA w żelu w warunkach denaturujących. Do reakcji użyto za mało RNA lub RNA o niskiej jakości Zwiększyć ilość RNA. Usunąć inhibitory reakcji (m.in. SDS, EDTA, fosforan sodu, spermidyna, sole guanidyny, formamid itd.) poprzez precypitację RNA, włączając etap płukania 70% etanolem. Nieoczekiwane prążki podczas analizy elektroforetycznej amplifikowanych produktów Próbka wyizolowanego RNA zawiera genomowe DNA Traktować zanieczyszczoną próbkę RNA DNazą I.

8 Zawartość RT reakcji RT reakcji RT31-S 3 reakcje TRANSCRIPTME Enzyme Mix (1) 40 µl 5 x 40 µl 7 µl 2x RT Master Mix (2) 200 µl 5 x 200 µl 33 µl RNase H (E. coli) 20 µl 5 x 20 µl 4 µl Nuclease-free water 180 µl 5 x 180 µl 35 µl 1) Zawiera odwrotną transkryptazę TRANSCRIPTME oraz inhibitor RNaz RIBOPROTECT. 2) Zawiera bufor do RT-PCR, startery oligo(dt) 18, random heksamery, MgCl 2 oraz mieszaninę dntps. Przechowywanie i transport Warunki przechowywania Wszystkie elementy zestawu należy przechowywać w temp. -20 C. Trwałość może być przedłużona przy przechowywaniu zestawu w temp. -70 C. Warunki transportu Transport w warunkach chłodniczych. do badań naukowych Data zakupu Gwarancja 12 miesięcy od daty zakupu DNA-Gdańsk info@dnagdansk.com