QUANTA Lite Chromatin ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite Chromatin ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite TM Chromatin jest to immunoenzymatyczny test (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał przeciwko chromatynie w surowicy człowieka. Obecność przeciwciał przeciwko chromatynie może być wykorzystana w połączeniu z wynikami klinicznymi i innymi testami laboratoryjnymi do wspomagania diagnozy toczenia polekowego (DIL) oraz toczenia rumieniowatego układowego (SLE). Podsumowanie i wyjaśnienie testu Chromatyna normalnie występuje w jądrze komórek. Składa się ona z natywnego DNA owiniętego wokół (H2A-H2B-H3-H4) 2 oktameru histonów, z powiązanymi białkami H1 oraz niektórymi białkami bezhistonowymi. Autoprzeciwciała przeciwko chromatynie zostały zmierzone za pomocą wielu technik, w tym testu komórek LE 1, immunoprecypitacji 2, immunofluorescencji ekstrahowanych kwasem komórek z odtworzonym histomen 3 oraz ELISA. 4,5 Te przeciwciała zostały wykryte w przeważającej mierze u osób chorych na SLE, 3,6,7,8 DIL, 9,10 oraz sporadycznie u osób z innymi chorobami. 11 Przeciwciała przeciwko chromatynie są również znane jako przeciwko-nukleosomy 5,8,11, przeciwko-(h2a-h2b) DNA 9,13, przeciwko- DNP 3,4 oraz czynnik komórki LE 1,11. Jednym z głównych zastosowań tego testu jest pomoc w diagnozowaniu DIL. Przeciwciała przeciwko histonom i chromatynie zostały wykryte u pacjentów z toczeniem poprokainamidowym. 9,12,13 Jednak przeciwciała przeciwko histonom występują również u pacjentów przyjmujących prokainamid ale niewykazujących objawów chorób związanych z toczeniem. 9,13 Natomiast przeciwciała przeciwko chromatynie występują znacznie rzadziej i przy niższych mianach niż u tych pacjentów bezobjawowych. 9,13 Oprócz tego pacjenci z toczeniem wywołanym lekami takimi jak chinidyna, penicylamina, metyldopa oraz acebutalol posiadają przeciwciała przeciwko chromatynie, ale nie przeciwko histonom. 9,10 W ten sposób, zgodnie z tymi opublikowanymi raportami, przeciw-chromatyna jest bardziej czuła i bardziej swoista w przypadku toczenia polekowego niż przeciwko-histonom. Interesujące jest to, że przeciwciała przeciwko chromatynie zostały wykryte u osób zażywających prokainamid przed rozwinięciem przed wcześniej objawów jak przy toczeniu. 13 Liczne badania wykorzystujące testy ELISA z chromatyną wykazały, że od 50% do 90% pacjentów z SLE posiada przeciwciała przeciwko chromatynie. 6,7,8 Jest to taki sam wskaźnik procentowy jak u osób które mają pozytywną odpowiedź na LE. 14 W zasadzie większość pacjentów z SLE odpowiada pozytywnie na przeciwciała przeciwko chromatynie, niż na przeciwciała przeciwko 6,7,8,11,14 Obecność przeciwciał przeciwko chromatynie została również powiązana z proteinurią u pacjentów. 1 Przeciwciała przeciwko chromatynie są kierowane do epitopów składających się z natywnego kompleksu histonu-dna, natywnego DNA oraz regionów histonów znajdujących się w chromatynie. 7,9,11 W ten sposób przeciwciała przeciwko ndna stanowią podzespół przeciw-chromatyny. Jednak niektóre przeciwciała przeciw-histonowe są kierowane przeciwko epitopom na skażonych histonach, które nie są wystawione w chromatynie. 11 Zasada badania Mocno oczyszczonej chromatyny z grasicy cielęcej, składająca się z DNA owiniętego wokół podstawowego histonu (H2A-H2B-H3-H4) 2 oktamer jest przymocowany do dołków płytki. Białka typu histon H1 oraz białka bez histonu zostały usunięte z chromatyny podczas procesu czyszczenia. Wstępnie rozcieńczone kontrole oraz surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków umożliwiając związanie wszelkich występujących przeciwciał przeciwko chromatynie z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciwludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym antygenem chromatyny (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko chromatyny, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Słabo pozytywna chromatyna ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko chromatynie, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 4. Silnie pozytywna chromatyna ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko chromatynie, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 1

2 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną chromatynę ELISA, silnie pozytywną chromatynę ELISA oraz kontrolę negatywną ELISA należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. 2

3 Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami chromatyny ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej chromatyny ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej chromatyny ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej chromatyny ELISA, wysoko pozytywnej chromatyny ELISA i kontroli negatywnej ELISA. 4. Oznaczanie obecności lub braku chromatyny, stosując jednostki umowne wymaga dwóch dołków dla każdego z trzech kontroli i jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej chromatyny ELISA, wysoko pozytywnej chromatyny ELISA, kontroli negatywnej ELISA i rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 3

4 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną chromatyną ELISA, silnie pozytywną chromatyną ELISA i kontrolą negatywną ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna chromatyna ELISA, silnie pozytywna chromatyna ELISA i kontrola negatywna ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze - 20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej chromatyny ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej chromatyny ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej chromatyny ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli chromatyny ELISA musi być ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej ELISA lub być większa niż 0,25. d. Kontrola negatywna ELISA i wysoka pozytywna chromatyna ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Wysoko pozytywna chromatyna ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI (NCCLS) C24-A. Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej chromatyny ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej chromatyny ELISA, którą można znaleźć na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x nisko pozytywna chromatyna ELISA (jednostki) gęstość optyczna słabo pozytywnej chromatyny ELISA (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. 4

5 Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, średnio pozytywna lub silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywny <20 Średnio pozytywna Silnie pozytywna >60 1. Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał przeciwko chromatynie i sugeruje możliwość diagnozy polekowego (DIL) oraz toczenia rumieniowatego układowego (SLE). 2. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała przeciwko dsdna, lub że ich poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania. 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki otrzymano przy wykorzystaniu zestawu INOVA QUANTA Lite Chromatin ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości chromatyny uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu. 2. Nie wszyscy pacjenci z toczeniem polekowym (DIL) lub toczeniem rumieniowatym układowym (SLE) mają wynik pozytywny na chromatynę. 3. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 4. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Normalny zakres Przebadano 210 próbek pochodzących od zdrowych ochotników. Normalna populacja składała się w 68% z kobiet z średnią wieku 38 lat. Próbki pochodziły od osób w wieku lat. Oprócz tego przebadano 29 pacjentów, którzy nie zażywają prokainamidu, odpowiadających wiekiem i płciom pacjentom, którzy zażywają prokainamid. 208 próbek miało wynik negatywny w teście QUANTA Lite Chromatin ELISA, co stanowi 99%. 2 pozytywne normalne próbki wykazały 24 i 22 jednostki aktywności. Wartość graniczna wynosi < 20 jednostek. 90% zdrowych pacjentów wykazało 10 jednostek lub mniej. Wszyscy pacjenci z chorobami sercowymi wykazali wynik negatywny. Swoistość i wrażliwość względna Porównanie z testem histonów ELISA W przypadku test histonów ELISA skażone poszczególne histony (tzn. H1, H2A, H2B, H3 i H4) wiążą się z płytką ELISA. W teście chromatyny ELISA, chromatyna z naniesionym H1 (tzn. natywny (H2A-H2B-H3-H4) 2 oktamer histonowy owinięty 145 podstawowymi parami DNA) wiąże się z płytką ELISA. Szczegółowe porównanie testów histonów i chromatyny ELISA zostało podanych w referencji 11. Podsumowując, te dwa antygeny współdzielą niektóre ważne epitopy. W szczególności ogonki histonów wrażliwe na trypsynę, które są poddawane działaniu w przypadku chromatyny i skażonych histonów, reagują z przeciwciałami od pacjentów z SLE i DIL. Jednak epitopy składające się z natywnego dimera H2-A-N2B lub kompleksu (H2A- H2B)-DNA występują w chromatynie, ale nie w skażonych histonach. Przeciwciała pochodzące od pacjentów z SLE i DIL rozpoznają te epitopy. Natomiast niektóre epitopy, które są poddane działaniu w skażonych histonach, są ukryte w chromatynie. Te epitopy są rozpoznawane przez pacjentów, którzy zażywają prokainamid ale nie mają objawów toczenia polekowego, co utrudnia stosowanie testu histonów ELISA w stosunku do testów chromatyny ELISA w diagnozowaniu DIL. Obecność DNA w chromatynie powoduje, że przeciwciała pacjentów z SLE sprawniej rozpoznają chromatynę niż histony. Jednak w związku z tym, że przeciw-dna rzadko występuje u osób z SLE, to praktycznie nie ma fałszywych pozytywnych wyników z chromatyną wywołaną przez reakcyjność przeciwko- DNA. Zgodnie z dwoma poniższymi tabelami chromatyna ELISA jest bardziej czuła i swoista niż histony ELISA w zakresie różnicowania pacjentów objawowych i bezobjawowych, przyjmujących prokainamid. W przypadku pacjentów z objawami przypominającymi toczeń, test chromatyny ELISA wykazał 20 z 26 pozytywnych wyników, a test histonów ELISA tylko 19 pozytywnych. Pewna część tych próbek wykazała większą reakcyjność na chromatynę ELISA niż na histony ELISA. W przypadku pacjentów zażywających prokainamid ale nie wykazujących objawów toczenia, tylko 17 z 67 dało wynik pozytywny w teście chromatyny ELISA i tylko 4 były silnymi reaktorami. Jednak 34 były pozytywne w teście histonów ELISA, a 21 z nich było silnymi reaktorami. W ten sposób przeciwciała przeciwko chromatynie lepiej różnicują grupy objawowe i bezobjawowe niż przeciwciała przeciwko histonom. 9,10,13 5

6 Porównanie pacjentów z objawami (n=26) zażywających prokainamid w ramach testu INOVA ELISA chromatyny oraz INOVA ELISA histonów. Pacjenci z objawami n=26 ELISA chromatyny Negatywny Średnio Silnie ELISA histonu Negatywny Średnio Silnie Porównanie pacjentów bez objawów zażywających prokainamid w ramach testu INOVA ELISA chromatyny oraz INOVA ELISA histonów. Pacjenci bez objawów n=67 ELISA chromatyny Negatywny Średnio Silnie ELISA histonu Negatywny Średnio Silnie Test chromatyny ELISA jest również bardziej czuły niż histonów ELISA w zakresie wykrywania pacjentów z SLE. Wyższa wartość procentowa występowała w przypadku chromatyny ELISA i wiele z nich wykazało wyższą reakcyjność. Te wyniki były oczekiwane na podstawie opublikowanych badań. 6,7,8 Dane zostały podsumowane w poniższej tabeli. Porównanie pacjentów SLE w ramach testu INOVA ELISA chromatyny oraz INOVA ELISA histonów SLE n=45 ELISA histonu ELISA chromatyny Negatywny Średnio Silnie Negatywny Średnio Silnie Zestawienie danych z powyższych tabeli z wynikami z normalnego panelu oraz kontroli sercowych wykazało względną czułość i swoistość testu chromatyny ELISA w porównaniu do testu histonów ELISA. Próbki łącznie ELISA chromatyny Negatywny Pozytywna ELISA histonu Negatywny Pozytywna 28* 67 Czułość względna = 70% Swoistość względna = 98% *Spośród 28 próbek pozytywnych w przypadku testu histonów ELISA ale negatywnych w przypadku chromatyny ELISA, 18 pochodziło od bezobjawowych pacjentów zażywających prokainamid, 8 od zdrowych ochotników, a 1 byłą sercową próbką kontrolną. 6

7 Swoistość i wrażliwość kliniczna Chromatyna pozytywna Grupa pacjentów Łączna liczba # % Zdrowi ochotnicy % Objawowy toczeń wywołany prokainamidem % Bezobjawowi pacjenci zażywający prokainamid % Pacjenci z chorobami serca dopasowani pod względem wieku i płci % SLE % Na podstawie powyższego badania, czułość kliniczna testu chromatyny ELISA w przypadku DIL i SLE wynosi 72%, a swoistość kliniczna wynosi 94%. Te wartości są zgodne z wartościami podanymi w literaturze. 11 Precyzja i powtarzalność W ramach serii Pięć próbek było poddanych badaniu 18 razy, każda na płytce ELISA. Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Średnio 61 U 49 U 91 U 75 U 133 U SD 2,9 U 2,7 U 4,1 U 5,2 U 5,1 U CV 4,8% 5,6% 4,5% 7,0% 3,9% W celu ocenienia precyzji w ramach serii w obszarze wartości granicznej chromatyny ELISA, 5 próbek poddano badaniom 14 razy na płytce ELISA. Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Średnio 22 U 26 U 30 U 22 U 21 U SD 0,9 U 1,4 U 1,4 U 0,9 U 0,9 U CV 4,3% 5,3% 4,5% 3,9% 4,4% Pomiędzy seriami 5 pozytywnych próbek poddano badaniu jeden raz dziennie przez 5 różnych dni, Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Średnio 67 U 57 U 110 U 84 U 167 U SD 4,3 U 4,1 U 8,6 U 4,7 U 10,2 U CV 6,4% 7,1% 7,8% 5,6% 6,1% 7

8 Piśmiennictwo 1. Lachman PJ: An attempt to characterize the lupus erythematosus cell antigen. Immunology 4: , Robitaille P, et al.: Relationship between deoxyribonucleo-protein and deoxyribonucleic acid antibodies in systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 52: , Fritzler MJ and Tan EM: Antibodies to histones in drug-induced and idiopathic lupus. J Clin Invest 62: , Halbert SP, et al.: Studies on autoantibodies to deoxyribonucleic acid and deoxyribonucleoprotein with enzyme immunoassay (ELISA). J Lab Clin Med 97: , Burlingame RW and Rubin RL: Subnucleosome structures as substrates in enzyme-linked immunosorbent assays. J Immunol Methods 134: , Karsh J, et al.: Anti-DNA, anti-deoxyribonucleoprotein and rheumatoid factor in patients with systemic lupus erythematosus, Sjogren s syndrome and rheumatoid arthritis. Int Arch Allergy Appl Immunol 68: 60-69, Burlingame RW, et al.: The central role of chromatin in the autoimmune responses to histones and DNA in systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 94: , Chabre H, et al.: Presence of nucleosome-restricted antibodies in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 38: , Burlingame RW and Rubin RL: Drug-induced anti-histone autoantibodies display two patterns of reactivity with substructures of chromatin. J Clin Invest 88: , Rubin RL, et al.: Autoantibodies associated with lupus induced by diverse drugs target a similar epitope in the (H2A-H2B)-DNA complex. J Clin Invest 90: , Burlingame RW: The clinical utility of antihistone antibodies: Autoantibodies reactive with chromatin in systemic lupus erythematosus and drug-induced lupus. Clin Lab Med 17: , Rubin RL: Autoantibody specificity in drug-induced lupus and neutrophil-mediated metabolism of lupus-inducing drugs. Clin Biochem 25: , Rubin RL, et al.: IgG but not other classes of anti[(h2a-h2)-dna] is an early sign of procainamideinduced lupus. J Immunol 154: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 25: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Sierpień 2011 Wersja 0 8