QUANTA Lite PBC Screen IgG/IgA ELISA Do diagnostyki in vitro

Transkrypt

1 QUANTA Lite PBC Screen IgG/IgA ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie Test ELISA QUANTA Lite TM badania przesiewowego IgG/IgA PBC to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowej detekcji przeciwciał mitochondrialnych, gp210 i sp100 klasy IgG i/lub IgA w surowicy ludzkiej. Obecność przeciwciał mitochondrialnych, gp210 i sp100 można użyć w połączeniu z wynikami klinicznymi i innymi testami laboratoryjnymi do wspomagania diagnozy pierwotnej marskości żółciowej. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Pierwotna marskość żółciowa wątroby (ang. primary biliary cirrhosis, PBC) to przewlekła choroba wątroby charakteryzująca się zniszczeniem małych wewnątrzwątrobowych dróg żółciowych. Postępujące niszczenie dróg prowadzi do rosnącego pogorszenia czynności wątroby i z czasem może doprowadzić do niewydolności wątroby oraz konieczności jej przeszczepienia. 1,2 Etiologia PBC nie jest znana, chociaż w rozwoju choroby może być istotny element genetyczny oraz inne czynniki. 3,4 PBC zazwyczaj występuje w wieku od 30 do 65 lat i częściej dotyka kobiet niż mężczyzn (szacowany współczynnik kobiet: mężczyzn 9:1). 3,4 Występowanie PBC u krewnych pierwszego stopnia pacjentów z PBC waha się od 1,3 do 6,4%. 4,5 PBC występuje u wszystkich ras i na całym świecie. Donoszono o dużej zmienności występowania geograficznego PBC, od 2 na w Japonii i Australii do 40 na w Stanach Zjednoczonych. 3,6 Cechą serologiczną PBC jest obecność przeciwciał przeciwmitochondrialnych (AMA), które można wykryć u 90 95% pacjentów z PBC. Przeciwciała przeciwmitochondrialne wykrywano u osób bezobjawowych z prawidłowymi wynikami czynności wątroby i histologicznymi. U niektórych z tych osób z czasem wystąpi PBC. 7-9 Większość autoantygenów skierowanych przeciw AMA to podjednostki E2 kompleksu dehydrogenazy pirogronianu (PDC-E2), kompleksu dehydrogenazy rozgałęzionego 2-oksokwasu (BCOADC-E2) i kompleksu dehydrogenazy 2-okso glutaranu (OGDC-E2). 10 Gershwin i Leung opracowali i opatentowali rekombinowany antygen (MIT3), który zawiera immunodominujące epitopy tych trzech podjednostek. 11 Oznaczenia oparte na MIT3 mają lepszą wydajność w porównaniu z oznaczeniami wykorzystującego konwencjonalne testy ELISA oparte na PDC-E2. 11,12 Oprócz AMA, około 50 72% surowic pacjentów z PBC zawiera przeciwciała przeciwjądrowe (ANA). Dwa wzorce ANA swoiście związane z PBC to charakterystyka punktowego barwienia brzegu/membrany białka gp210 porowatej membrany jądra i charakterystyka wielopunktowego barwienia jądra (MND) białka sp100 związanego z jądrem. Przeciwciała przeciw-gp210 i przeciw-sp100 występowały u około 25% pacjentów z PBC i są one wysoce swoiste dla PBC. Ponadto te przeciwciała występują u 10 50% AMA-negatywnych pacjentów z PBC i mogą być jedynymi wykrywanymi przeciwciałami swoistymi dla PBC. Chociaż większość konwencjonalnych oznaczeń wykrywa wyłącznie przeciwciała IgG AMA, przeciwciała IgA AMA występują w surowicy, żółci, ślinie i moczu osób chorych na PBC. 13,14 Sugerowano, że to wydzielanie IgA anty-pbc może odgrywać rolę w patogenezie PBC. 14 Pacjenci z podejrzeniem autoimmunologicznej choroby wątroby, ale nie spełniający wszystkich klasycznych kryteriów, mogą stanowić wyzwanie kliniczne. Do tej grupy należą osoby AMA-negatywne PBC. Nowe oznaczenia wykrywające przeciwciała przeciw gp210, sp100 i AMA wykorzystujące lepszą czułość antygenu MIT3 zmniejszały liczbę pacjentów PBC bez serologicznych dowodów PBC. Test QUANTA Lite TM badania przesiewowego IgG/IgA PBC wykrywa przeciwciała przeciw MIT3, sp100 i gp210 będące markerami swoistymi dla PBC. Koniugat podwójnie swoisty (IgG/IgA) oferuje zwiększoną czułość wykrywania próbek, które mogą być słabe lub negatywne podczas testowania z koniugatem monoswoistym (tylko IgG). Połączone testowanie przeciwciał IgG i IgA przeciw MIT3, gp210 i sp100 zapewnia narzędzie do badania osób z podejrzeniem na PBC. Zasada badania Mieszanina zawierająca oczyszczony metodą powinowactwa rekombinowany antygen (MIT3), który obejmuje immunodominujące części PDC-E2, BCOADC-E2, OGDC-E2, oczyszczony fragment białka sp100 i oczyszczony fragment białka gp210, jest wiązany w dołkach polistyrenowej płytki z mikrodołkami w warunkach, które zachowają antygen w jego stanie natywnym. Wstępnie rozcieńczone kontrole oraz surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków umożliwiając związanie wszelkich występujących przeciwciał mitochondrialnych, sp100 lub gp210 z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciwludzkiego IgG/IgA. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG/IgA znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG/IgA znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowe płytki z mikrodołkami ELISA pokryte oczyszczonym antygenem badania przesiewowego PBC (mieszanina oczyszczonych antygenów MIT3, sp100 i gp210) (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna testu ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez przeciwciał ludzkich skierowanych przeciwko antygenom badania przesiewowego PBC, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia 1,2 ml 1

2 3. Kontrola niska pozytywna testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC, 1 fiolka buforu zawierającego środek konserwujący oraz przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko antygenowi badania przesiewowego PBC, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia, 1,2 ml 4. Kontrola wysoka pozytywna testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC, 1 fiolka buforu zawierającego środek konserwujący oraz przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko antygenowi badania przesiewowego PBC, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat IgG/A badania przesiewowego PBC HRP, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG/IgA, 1 fiolka bezbarwny, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego powodu kontrola niska pozytywna testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC, kontrola wysoka testu ELISA pozytywna badania przesiewowego IgG/IgA PBC i kontrola negatywna testu ELISA powinny być oznaczane w taki sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/ dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. 2

3 Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. 16 Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC (12-1 x 8 dołków), zuchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli niskiej pozytywnej testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli wysokiej pozytywnej testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC, (kozie), przeciw-ludzkie IgG/IgA 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20 26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ kontroli niskiej pozytywnej testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC, kontroli wysokiej pozytywnej testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC i kontroli negatywnej testu ELISA. 4. Oznaczenie obecności lub braku przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom badania przesiewowego IgG/IgA PBC z wykorzystaniem jednostek dowolnych wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli lub jednego bądź dwóch dołków dla każdej próbki pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Dodać do dołków 100 µl wstępnie rozcieńczonej kontroli niskiej pozytywnej testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC, kontroli wysokiej pozytywnej testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC, kontroli negatywnej testu ELISA oraz rozcieńczonych próbek pacjenta. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3

4 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100μl koniugatu HRP badania przesiewowego IgG/IgA PBC. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Z każdą serią próbek należy oznaczać kontrolę niską pozytywną testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC, kontrolę wysoką pozytywną testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC i kontrolę negatywną testu ELISA, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury są prawidłowe 2. Proszę zwrócić uwagę, że ponieważ kontrola niska pozytywna testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC, kontrola wysoka pozytywna testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC i kontrola negatywna ELISA są wstępnie rozcieńczone, nie kontrolują one metod proceduralnych związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli wysokiej pozytywnej testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC musi być wyższa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej kontroli niskiej pozytywnej testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC, która musi być wyższa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA. b. Wstępnie rozcieńczona kontrola wysoka pozytywna testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC musi mieć absorbancję wyższą niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA nie może przekraczać 0,2. c. Absorbancja kontroli niskiej pozytywnej testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC musi być przynajmniej dwukrotnie wyższa niż kontroli negatywnej testu ELISA lub przekraczać 0,25. d. Kontrola negatywna testu ELISA oraz kontrola wysoka pozytywna testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC mają monitorować występowanie poważnych nieprawidłowości związanych z odczynnikami. Kontrola wysoka pozytywna testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC nie zapewni precyzji na poziomie wartości granicznej testu. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI (NCCLS) C24-A2. 17 Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność dla każdej próbki można następnie obliczyć dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną kontroli niskiej pozytywnej testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC. Wynik jest mnożony przez liczbę jednostek przypisanych do kontroli niskiej pozytywnej testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC występującej na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x kontrola niska pozytywna testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC (jednostki) Gęstość optyczna kontroli niskiej (jednostki) pozytywną testu ELISA badania przesiewowego IgG/IgA PBC Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). 4

5 Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, niejednoznaczna lub pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywna 20,0 Niejednoznaczne 20,1 24,9 Pozytywne > Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał przeciw jednemu lub więcej antygenów w badaniu przesiewowym PBC i sugeruje możliwość występowania pierwotnej marskości żółciowej. 2. Wynik negatywny wskazuje brak przeciwciał przeciwko mitochondriom, gp210 i sp100 lub ich poziom poniżej wartości granicznej testu. 3. Próbki o wynikach pozytywnych mogą być testowane pod kątem obecności poszczególnych przeciwciał MIT3, gp210 i sp100 za pomocą swoistych testów ELISA MIT3, gp210 i sp Próbka z niejednoznacznymi poziomami przeciwciał nie może być oznaczona pod kątem statusu przeciwciał. Zaleca się powtórzenie testu na świeżej próbce lub jego wykonanie w okresie późniejszym. 5. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Następujące wyniki uzyskano za pomocą testu ELISA INOVA QUANTA Lite TM badania przesiewowego IgG/IgA PBC. Wartości badania przesiewowego PBC uzyskane przy użyciu metod testowania różnych producentów nie mogą być stosowane zamiennie. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG/IgA nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu. 2. Nie wszyscy pacjenci z pierwotną marskością żółciową mają pozytywne wyniki przeciwciał przeciw antygenom stosowanym w teście ELISA badania przesiewowego IgG/IgA. 3. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 4. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Normalny zakres Panel 520 bezobjawowych, zdrowych osób mieszkających na terenie USA zbadano za pomocą testu ELISA QUANTA Lite TM badania przesiewowego IgG/IgA PBC. Dane dotyczące wieku i płci były dostępne dla 307 próbek. Wiek mieścił się w zakresie lat i obejmował 150 mężczyzn oraz 157 kobiet. Wartość średnia dla tej populacji wynosiła 6,6 jednostki, a wartość mediany wynosiła 4,6 jednostek. Swoistość badania wyniosła 98,1 % (510/520) dla pacjentów prawidłowych. Z 10 próbek pozytywnych, 7 wykazywało reaktywność z testem ELISA IgG M2 EP(MIT3), a 1 próbka była reaktywna podczas testu przeciwciał IgA M2 EP(MIT3). Specyficzna charakterystyka wyników Badania kliniczne Łącznie 440 pacjentów PBC oraz 769 pacjentów nie cierpiących na PBC, z których 520 było zdrowych i prawidłowych, analizowano za pomocą testu ELISA QUANTA Lite TM badania przesiewowego IgG/IgA PBC w celu oceny swoistości i czułości testu. Wykluczono próbki AMA-negatywne PBC lub pacjentów z podejrzeniem, ale bez potwierdzenia choroby oraz pacjentów z AIH. Grupa PBC (440) obejmowała próbki od 426 osób o określonej PBC i 14 z nałożeniem AIH/PBC. Grupa nie cierpiąca na PBC obejmowała próbki od 520 zdrowych kontroli oraz próbki od osób cierpiących na wirusowe zapalenie wątroby (HBV lub HCV) (149), PSC (48), choroby wątroby inne niż PBC (23) oraz choroby zakaźne lub autoimmunologiczne (29). Wartości średniej i mediany dla grupy nie cierpiącej na PBC wynosiły odpowiednio 8,1 i 5,3. Wyniki zostały podsumowane w Tabeli 1 poniżej. Tabela 1: Swoistość i czułość testu ELISA QUANTA Lite TM badania przesiewowego IgG/IgA PBC N=1209 n pozyt. niejedn. negat. Grupa PBC Grupa nie-pbc Wrażliwość: 95,9% (422/440); 95% Przedział ufności (CI): od 93,6% do 97,6% Swoistość: 96,1% (739/769); 95% CI: od 94,5% do 97,4% Zgodność całkowita (wyniki niejednoznaczne uznawane za negatywne): 96,0% (1161/1209) 5

6 Porównanie z urządzeniami predykatowymi Test ELISA QUANTA Lite badania przesiewowego IgG/IgA PBC porównywano z poszczególnymi testami ELISA QUANTA Lite M2 EP (MIT3, QUANTA Lite gp210 i QUANTA Lite sp100. Ogółem 1209 próbek (440 klinicznych PBC, 249 nie-pbc i 520 bezobjawowych osób zdrowych) zbadano za pomocą badania przesiewowego PBC oraz poszczególnych testów ELISA QUANTA Lite MIT3, sp100 i gp210. N=1209 Pojedynczy test QUANTA Lite Pozyt. Niejedn.* Negat. Pozyt Test ELISA QUANTA Lite PBC Niejedn.* badania przesiewowego IgG/IgA Negat *Wyniki niejednoznaczne wykluczono z analizy Zgodność pozytywną i negatywną obliczono porównując wyniki uzyskane w badaniu przesiewowym PBC z wynikami uzyskanymi w każdym z pojedynczych testów. Zgodność pozytywna (wykluczając niejednoznaczne) = 99,5% (437/439) Zgodność negatywna (wykluczając niejednoznaczne) = 98,9% (730/738) Zgodność ogólna (wykluczając niejednoznaczne) = 99,2% (1167/1177) Reaktywność krzyżowa Surowice 463 pacjentów z chorobą wątroby inną niż PBC (213 AIH-1, 48 PSC, 10 AIH/PSC, 8 AIC, 9 kryptogenne zapalenie wątroby, 11 VBDS, 3 AIH-2, 11 alkoholowa choroba wątroby, 1 zapalenie wątroby indukowane lekami, 71 HBV i 78 HCV) oraz 29 pacjentów z chorobą autoimmunologiczną lub zakaźną (7 H. pylori, 3 ASCA, 4 ANA, 3 ttg, 2 GPA, 2 GBM i 8 CMV) zbadano za pomocą testu ELISA QUANTA Lite TM badania przesiewowego IgG/IgA PBC w celu oceny swoistości testu. Z grupy chorób autoimmunologicznych/zakaźnych (29 pacjentów) tylko jedną próbkę CMV pozytywną zinterpretowano jako pozytywną (34,4 jednostki) w badaniu przesiewowym PBC. Ten pacjent wykazywał słabe barwienie jądrowe i cytoplazmatyczne w IFA, ale nieswoiste dla żadnego wzorca antygenu PBC. W grupie nie-pbc obejmującej 463 pacjentów, 53 pacjentów było pozytywnych w badaniu przesiewowym PBC. 42 z 53 pacjentów pozytywnych wykazywało pewną reaktywność w jednym lub więcej poszczególnych testów, natomiast 9 pacjentów było negatywnych dla wszystkich markerów. Możliwe, że 53 pozytywnych pacjentów z grupy chorób wątroby innych niż PBC może mieć pewną nierozpoznaną lub rozwijającą się nakładającą się chorobę PBC. Precyzja i powtarzalność Wydajność w obrębie badania oceniono badając 7 próbek, zestaw kontroli wysokiej pozytywnej (HPC), i kontroli negatywnej (NC) łącznie po 5 razy każdą. Tabela 2: Wydajność w obrębie badania testu ELISA QUANTA Lite badania przesiewowego IgG/IgA PBC HPC NC A B C D E F G Jednostka średnia 100,6 1,1 61,6 39,8 27,9 13,6 27,5 26,5 23,6 SD 2,2 0,1 2,3 1,0 0,8 0,3 0,9 0,6 0,5 CV % 2,2 6,5 3,7 2,4 3,0 2,4 3,2 2,2 2,2 Tabela 3: Wydajność między badaniami testu ELISA QUANTA Lite badania przesiewowego IgG/IgA PBC HPC NC A B C D E F G H Jednostki średnie 104,8 1,6 67,5 8,4 29,7 35,2 6,3 31,5 29,8 25,2 SD 1,9 0,3 1,7 0,3 1,2 0,6 0,6 1,9 1,3 0,25 CV % 1,8 21,9 2,6 3,6 4,0 1,6 9,2 6,1 4,5 1,0 6

7 Piśmiennictwo 1. Heathcote EJ. Management of primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines. Hepatology 2000;31: Kaplan MM, Gershwin ME. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 2005;353: Feld JJ, Heathcote EJ. Epidemiology of autoimmune liver disease. J Gastroenterol Hepatol 2003;18: Talwalkar JA, Lindor KD. Primary biliary cirrhosis. Lancet 2003;362:53: Jones DE, Watt FE, Metcalf JV, Bassendine MF, James OF. Familial primary biliary cirrhosis reassessed; a geographically-based population study. J Hepatol 1999;30: Kim W.R. et.al Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology (2000) 119, Kisand KE, Metskula K, Kisand KV, Kivik T, Gershwin ME, Uibo R. The follow-up of asymptomatic persons with antibodies to pyruvate dehydrogenase in adult population samples. J Gastroenterol 2001;36: Metcalf JV, Mitchison HC, Plamer JM, Jones DE, Bassendine MF, James OF. Natural history early primary biliary cirrhosis. Lancet 1996;348: Prince M, Chetwynd A, Newman W, Metcalf JV, James OF. Survival and symptom progression in a geographically based cohort with primary biliary cirrhosis: follow-up for up to 28 years. Gastroenterology 2002:123: Fussey SP, Guest JR, James OF, Bassendine MF, Yeaman SJ. Identification and analysis of the major M2 autoantigens in primary biliary cirrhosis. Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85: Moteki S, Leung PS, Cappel RL, Dickson ER, Kaplan MM, Munoz S, Gershwin ME. Use of a designer triple expression hybrid clone for three different lipoyl domain for the detection of antimitochondrial autoantibodies. Hepatology 1996;24: Miyakawa H, Tanaka A, Kikuchi K, Matsushita M, Kitazawa E, Kawaguchi N, Fujikawa H, et al. Detection of antimiochondrial autoantibodies in immunofluorescent AMA-negative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantibodies autoantigens. Hepatology 2001;34: Milkiewicz P, Buwaneswaran H, Lee L, Coltescu C, Shums Z, Norman GL, Heathcote EJ. Value of "new" autoantibody testing in the differential diagnosis of autoimmune liver conditions. Hepatology 2005;42:292A. 14. Tanaka A, Nalbandian G, Leung PS, Benson GD, Munoz S, Findor JA, Branch AD, et al. Mucosal immunity and primary biliary cirrhosis: presence of antimitochondrial antibodies in urine. Hepatology 2000;32: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38), CLSI (NCCLS). Statistical quality control: Principles and definitions; Approved Guideline- 2 nd edition NCCLS Document C24-A2, Vol. 19(5),

8 QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Marzec 2011 Wersja 0 8