QUANTA Lite Anti-C1q ELISA Tylko na eksport. Nie do sprzedaży w Stanach Zjednoczonych Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite Anti-C1q ELISA Tylko na eksport. Nie do sprzedaży w Stanach Zjednoczonych Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite TM Anti-C1q jest to immunoenzymatyczny test (ELISA) do półilościowego oznaczania przeciwciał przeciwko C1q w surowicy człowieka. Badanie na obecność przeciwciał przeciwko C1q u pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym w połączeniu z wynikami klinicznymi i innymi testami laboratoryjnymi wykorzystać można do wykrywania osób zagrożonych zapaleniem kłębuszków nerkowych. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Przeciwciała przeciwko fragmentowi pierwszego składnika dopełniacza - C1q pojawiają się w kilku różnych chorobach autoimmunologicznych 1, 2. Wiele z przeprowadzonych w ciągu ostatnich 21 lat badań wykazało, że u ludzi z toczniem rumieniowatym układowym (SLE) obecność autoprzeciwciał przeciwko C1q wiąże się z występowaniem aktywnej postaci zapalenia kłębuszków nerkowych W okresie zaostrzenia choroby ilość tych przeciwciał może się zwiększać 3-9. U cierpiących na zapalenie kłębuszków nerkowych pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym stwierdzono występowanie C1q w zmianach patologicznych nerek 11 a przeciwciała przeciwko C1q przyczyniają się do powstania zapalenia kłębuszków nerkowych w mysich modelach toczniowego zapalenia nerek 12. Podsumowując, badania te wykazują, że występowanie autoprzeciwciał przeciwko C1q zwiększa u pacjenta z SLE ryzyko rozwinięcia się aktywnej postaci zapalenia kłębuszków nerkowych, prawdopodobnie z tego względu, że autoprzeciwciała przeciwko C1q stają się patogenne, gdy w układzie krążenia pacjenta pojawią się kompleksy immunologiczne. Tabela 1. Korelacja między występowaniem przeciwciał przeciwko C1q a aktywną postacią toczniowego zapalenia nerek Nr referencyjny Nr SLE punkty Korelacja z aktywną postacią choroby nerek Lepiej niż przeciwciał a przeciwko DNA % przeciwciał przeciwko C1q w aktywnej postaci choroby nerek (liczba punktów) % przeciwciał przeciwko C1q w nieaktywnej postaci lub bez choroby nerek (liczba punktów) Skorelowa ny z SLEDAI lub ECLAM p<0,0003 Tak 44% (139) 18% (101) N.D. Tak p=0,017 N.D. 50% (22) 23% (107) p=0,006 Tak p=0,0001 Tak 74% (77) 32% (74) N.S.** Tak 6 43 p<0,005 Tak 82% (17) 31% (26) N.D. Tak 7 61 p<0,0001 Tak 87% (23) 8% (38) p<0,0001 Tak 8 68 p<0,01 Tak 71% (21) 30% (47) p<0,01 Tak p<0,0001 N.D. 95% (38) 35% (62) N.D. Tak W przygotowaniu^ 58 p=0,054 Tak 44% (16) 26% (42) p=0,005 Tak Łącznie % (353) 25% (625) *N.D. = nie przeprowadzono, **N.S. = nie istotny, ^Badanie przeprowadzone z zastosowaniem testu QUANTA Lite Anti-C1q ELISA, rękopis przygotowywany do drugiego badania Seryjne pomiary wykazuj ą zmianę Zasada badania Oczyszczony antygen C1q wiąże się z dołkami płytek polistyrenowych w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego reaktywnym stanie. Obecność autoprzeciwciał przeciwko podobnemu do kolagenu rejonowi C1q skorelowana jest z występowaniem u pacjentów aktywnej postaci SLE. Aby zmniejszyć wiązanie się kompleksu immunologicznego z innymi częściami C1q w rozcieńczalniku do próbek stosuje się duże stężenie soli. Rozcieńczone wstępnie próbki kontrolne i rozcieńczone surowice pochodzące od pacjentów dodaje się do oddzielnych dołków, co umożliwia związanie się wszelkich występujących w próbce przeciwciał przeciwko C1q z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z wszelkimi przeciwciałami pacjenta, które związały się z mikrodołkami. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym antygenem przeciwko C1q (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko C1q, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Słabo pozytywna kontrola Anti-C1q ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko C1q, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Wysoko pozytywna kontrola Anti-C1q ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko C1q, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 1

2 5. Rozcieńczalnik do próbek Anti-C1q, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną kontrolę Anti-C1q ELISA, wysoko pozytywną kontrolę Anti-C1q ELISA I kontrolę negatywną ELISA należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych I lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami I osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowodują degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/ dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. 2

3 Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami Anti-C1q ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli Anti-C1q ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli Anti-C1q ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek Anti-C1q 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek Anti-C1q. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli Anti-C1q ELISA, wysoko pozytywnej kontroli Anti-C1q ELISA i kontroli negatywnej ELISA. 4. W celu stwierdzenia obecności bądź braku przeciwciał przeciwko C1q z zastosowaniem jednostek arbitralnych, potrzebne są po dwa dołki na każdą z trzech kontroli i jeden do dwóch dołków na każdą próbkę pochodzącą od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli Anti-C1q ELISA, wysoko pozytywnej kontroli Anti-C1q ELISA, kontroli negatywnej ELISA i rozcieńczonych próbek pochodzących od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3

4 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Dodać µl rozcieńczonego buforu do płukania HRP do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą Anti-C1q ELISA, wysoko pozytywną kontrolą Anti- C1q ELISA i kontrolą negatywną ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola Anti-C1q ELISA, wysoko pozytywna kontrola Anti-C1q ELISA i kontrola negatywna ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli Anti-C1q ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli Anti-C1q ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli Anti-C1q ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli Anti-C1q ELISA musi być ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej ELISA, lecz nie większa niż 0,6. d. Kontrola negatywna ELISA i wysoko pozytywna kontrola Anti-C1q ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Wysoko pozytywna kontrola Anti-C1q ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI C24-A3. Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli Anti-C1q ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli Anti-C1q ELISA, którą można znaleźć na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x słabo pozytywna kontrola Anti-C1q ELISA (jednostki) gęstość optyczna słabo pozytywnej (jednostki) kontroli Anti-C1q ELISA Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. 4

5 Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, średnio pozytywna lub silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywny <20 Słabo pozytywna Średnio pozytywna Silnie pozytywna >80 1. Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał przeciwko C1q i sugeruje zwiększone ryzyko toczniowego zapalenia nerek u pacjentów z SLE. 2. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała przeciwko C1q, lub że ich poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania. Ograniczenia badania 1. W badaniu tym obecność w próbce pochodzącej od pacjenta kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobulinowych nie spowoduje otrzymania fałszywie pozytywnych wyników, ponieważ stosuje się specjalny rozcieńczalnik do próbek o dużym stężeniu soli Nie u wszystkich pacjentów z SLE cierpiących na toczniowe zapalenie nerek występują przeciwciała przeciwko C1q. 3. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 4. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Zdolność testu QUANTA Lite Anti-C1q ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko C1q u pacjentów z SLE oceniono, przeprowadzając dwa badania na próbkach pochodzących od pacjentów z klinicznie zdefiniowanym SLE. W tabeli poniżej przedstawiono porównanie wyników podanych w piśmiennictwie i otrzymanych za pomocą testu QUANTA Lite Anti-C1q ELISA. Swoistość i wrażliwość kliniczna SLE N=139 Łącznie Wrażliwość i swoistość Anti-C1q GN+ GN- ELISA Pozytywna Wrażliwość = 50% Negatywny Swoistość = 70% Łącznie W analizie tej zapalenie kłębuszków nerkowych (GN+) uznawane jest za stan chorobowy, a brak zapalenia kłębuszków nerkowych (GN-) uznawane jest za stan, w którym choroba nie występuje. Normalny zakres Aby określić przedział referencyjny przy użyciu testu Anti-C1q ELISA przebadano ogółem 184 próbek pochodzących od wybranych losowo dawców krwi. 15 próbek dało wynik pozytywny dla przeciwciał przeciwko C1q, co oznacza swoistość 91,8%. Próbki kontrolne pochodzące od osób z chorobami reumatycznymi i zakaźnymi Przy użyciu testu Anti-C1q ELISA przebadano 71 próbek pobranych od pacjentów, u których zdiagnozowano zdefiniowane choroby reumatyczne oraz 76 próbek zawierających przeciwciała przeciwko chorobom zakaźnym. Próbki zawierające przeciwciała przeciwko chorobom zakaźnym obejmowały 28 przypadków twardziny, 16 - choroby Mikulicza-Radeckiego, 27 - reumatoidalnego zapalenia stawów, 52 - HCV, 8 - HSV, 8 - CMV, 3 - toksoplazmozy i 5 - różyczki. Jedna próbka pochodząca od pacjenta z chorobą Mikulicza- Radeckiego, 1 od pacjenta z RA, 2 od pacjenta z HCV, 2 od pacjenta z CMV, 1 od pacjenta z HSV i 1 od pacjenta z toksoplazmozą wykazały obecność przeciwciał C1q, co świadczy o 93,9% swoistości dla tej grupy. 5

6 Porównanie metody Próbki pochodzące od normalnych dawców krwi, od osób z chorobami reumatycznymi i zakaźnymi wymienionymi powyżej oraz 58 próbek pochodzących od pacjentów z SLE badano zarówno przy użyciu testu QUANTA Lite Anti-C1q jak i testów anti-dsdna ELISA. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli. Procentowa zgodność wyników pozytywnych i negatywnych uzyskanych przy użyciu testu antidsdna Wszyscy dsdna IgG ELISA Łącznie % zgodności pacjenci Pozytywna Negatywny N=389 Anti-C1q ELISA Pozytywna Pozyt. % zgodności=37% Negatywny Negat. % zgodności=96% Łącznie Ogółem % zgodności=90% Reaktywność krzyżowa Aby ocenić kwestie potencjalnej reaktywności krzyżowej antygenu C1q z innymi autoprzeciwciałami, na zestawie QUANTA Lite Anti-C1q ELISA przebadano 16 próbek o wysokich mianach różnych innych autoprzeciwciał. Grupa ta obejmowała dwie próbki, z których każda reagowała z SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Ribo-P i DNA. Wszystkie próbki nie wykazały obecności przeciwciał przeciwko C1q. Precyzja i powtarzalność Precyzję w obrębie badania dla QUANTA Lite Anti-C1q ELISA określono, przeprowadzając 9- lub 10-krotne badanie 9 tych samych próbek na zestawach pochodzących z 3 serii. Poniżej zostały przedstawione wyniki reprezentatywne. C1q 1 C1q 2 C1q 3 N 209 C1q 4 C1q 5 Lis 22 Średnia 93 U 39 U 25 U 9 U 18 U 29 U 77 U SD 2,01 1,37 21,05 1,09 1,59 0,94 1,67 CV 2 % 3 % 4 % 12 % 9 % 3 % 2 % Precyzję pomiędzy badaniami dla testu QUANTA Lite Anti-C1q ELISA oceniono, przeprowadzając badanie 12 próbek w 6 niezależnych badaniach, co zajęło ogółem osiem dni. Testy te przeprowadzono na płytkach Anti-C1q ELISA pochodzących z trzech serii; reprezentatywne wyniki podano poniżej. C1q 1 C1q 2 C1q 5 C1q 6 N207 Lis 14 Lis 22 Średnia 94 U 43 U 33 U 27 U 7 U 71 U 61 U SD 4,09 3,40 2,32 3,35 0,52 2,47 6,51 CV 4 % 8 % 7 % 13 % 8 % 3 % 11 % 6

7 Piśmiennictwo 1. Gunnarsson, I., Ronnelid, J., Lundberg, I. & Jacobson, S.H. Occurrence of anti-c1q antibodies in IgA nephropathy. Nephrol Dial Transplant 12, (1997). 2. Siegert, C.E., Daha, M.R., Halma, C., van der Voort, E.A. & Breedveld, F.C. IgG and IgA autoantibodies to C1q in systemic and renal diseases. Clin Exp Rheumatol 10, (1992). 3. Haseley, L.A. et al. Antibodies to C1q in systemic lupus erythematosus: characteristics and relation to Fc gamma RIIA alleles. Kidney Int 52, (1997). 4. Horvath, L. et al. High levels of antibodies against Clq are associated with disease activity and nephritis but not with other organ manifestations in SLE patients. Clin Exp Rheumatol 19, (2001). 5. Marto, N., Bertolaccini, M.L., Calabuig, E., Hughes, G.R. & Khamashta, M.A. Anti-C1q antibodies in nephritis: correlation between titres and renal disease activity and positive predictive value in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis 64, (2005). 6. Coremans, I.E. et al. Changes in antibodies to C1q predict renal relapses in systemic lupus erythematosus. Am J Kidney Dis 26, (1995). 7. Moroni, G. et al. Anti-C1q antibodies may help in diagnosing a renal flare in lupus nephritis. Am J Kidney Dis 37, (2001). 8. Siegert, C.E. et al. Predictive value of IgG autoantibodies against C1q for nephritis in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis 52, (1993). 9. Trendelenburg, M., et al. High prevalence of anti-c1q antibodies in biopsy-proven active lupus nephritis. Nephrol Dial Transplant 21, (2006). 10. Moura G.C. et al. Anti-C1q antibodies: assaociation with Nephritis and disease activity in Systemic Lupus Erythematosus. J Clin Lab Anal 23, (2009). 11. Jennette, J.C. & Hipp, C.G. Immunohistopathologic evaluation of C1q in 800 renal biopsy specimens. Am J Clin Pathol 83, (1985). 12. Trouw, L.A. et al. Anti-C1q autoantibodies deposit in glomeruli but are only pathogenic in combination with glomerular C1q-containing immune complexes. J Clin Invest 114, (2004). 13. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institute of Health, 5 th Edition,

8 QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Marzec 2011 Wersja 0 8