QUANTA Lite Actin IgG ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite Actin IgG ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite TM Actin IgG jest testem immunoenzymatycznym (ELISA) dla półilościowego wykrywania przeciwciał IgG do komponentu aktynowego mięśni gładkich w surowicy ludzkiej. Obecność przeciwciał przeciwko aktynie może być stosowana w połączeniu z wynikami badań klinicznych i innymi badaniami laboratoryjnymi do wsparcia diagnozy autoimmunologicznych chorób wątroby, takich jak autoimmunologiczne zapalenie wątroby (AIH) i pierwotna marskość żółciowa (PBC).. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Autoprzeciwciała przeciw aktynie są głównym elementem tzw. przeciwciał przeciwko mięśniom gładkim (ASMA). Te przeciwciała wykazują swoistość zwłaszcza względem komponentu aktynowemu cytoszkieletu 1,2 i tradycyjnie wykrywa się je metodą pośredniej immunofluorescencji wykorzystującej jako podłoże cienkie skrawki wątroby, nerki lub żołądka gryzonia. 2,3 Przeciwciała przeciwko aktynie występują u 52-85% pacjentów z AIH lub przewlekłym aktywnym zapaleniem wątroby (CAH) oraz u 22% pacjentów z pierwotną marskością żółciową wątroby (PBC). 3,4,5 Przeciwciała przeciwko aktynie wykrywano, zazwyczaj w małej ilości, w 3-18% surowic pochodzących od ogólnej zdrowej populacji. 6 Badania immunofluorescencyjne mające ma celu wykrycie przeciwciał przeciwko mięśniom gładkim są subiektywne i ich wyniki zależą od typu użytej tkanki, specyfiki koniugatu, mocy systemu mikroskopowego używanego do odczytania wyników oraz doświadczenia eksperymentatora. Nowsze metody ELISA, po raz pierwszy opisywane od połowy lat 80 do wczesnych lat 90 ubiegłego wieku 4,5,7,8, mają możliwość lepszej, bardziej ustandaryzowanej i możliwej do zautomatyzowania pracy. Istnieją doniesienia, że swoistość przeciwciał przeciwko aktynie mięśni gładkich występuje głównie u pacjentów z CAH; natomiast w przypadku infekcji wirusowych, takich jak zakaźna mononukleoza, zapalne zapalenie wątroby, odra i świnka, wspomniana reaktywność przeciwko mięśniom gładkim spowodowana jest reaktywnością względem nieaktynowych antygenów cytoplazmatycznych. 1,2,3,9,10 Przeciwciała przeciwko mięśniom gładkim i przeciwciała przeciwjądrowe są immunoserologicznymi markerami autoimmunologicznego zapalenia wątroby typu Przeciwciała przeciwko mięśniom gładkim skierowane są przeciwko kilku komponentom, z których najważniejszym jest aktyna, lecz metodą immunofluorescencji można również wykryć przeciwciała przeciwko tubulinie i filamentom pośrednim. 12 Wyniki ostatnich badań sugerują, że to przeciwciała przeciwko aktynie są swoiste dla autoimmunologicznej choroby wątroby i są zalecane jako lepsze markery autoimmunologicznego zapalenia wątroby niż przeciwciała przeciwko mięśniom gładkim. 12,13,14 Istotnie, do opisu tej choroby posługiwano się nazwą zapalenia wątroby z przeciwciałami przeciwko aktynie (anti-actin hepatitis). 15 Czaja i inni 14 wykazali, że przeciwciała przeciwko aktynie występowały u 73 z 99 (74%) pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby typu 1 i u 0 z 83 zdrowych dawców krwi oraz u 3-15% pacjentów z innymi typami przewlekłego zapalenia wątroby. W tym samym badaniu wykryto, że u prawie wszystkich (99%) pacjentów z przeciwciałami przeciwko aktynie występowały również przeciwciała przeciwko mięśniom gładkim, natomiast u 46% z pacjentów z grupy nie posiadającej przeciwciał przeciwko aktynie wystąpiła reaktywność skierowana przeciwko mięśniom gładkim. Pacjenci, u których występują przeciwciała przeciwko aktynie, byli bardziej podatni na niewrażliwość na leczenie kortykosteroidami (16% w porównaniu z 4%) oraz na pojawienie się u nich niewydolności wątroby (20% w porównaniu z 4%). 14 Zasada badania Oczyszczony antygen aktyny F wiąże się z dołkami płytki polistyrenowej w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego naturalnym stanie. Wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone surowice od pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków, umożliwiając obecnym przeciwciałom przeciwko aktynie związanie się z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym antygenem aktyny (12-1 x 8 dołków), z uchwytem, w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał IgG przeciwko aktynie, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Kontrola słabo pozytywna testu Actin IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej IgG przeciwko aktynie, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Kontrola silnie pozytywna testu Actin IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej IgG przeciwko aktynie, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 1

2 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną kontrolę testu Actin IgG ELISA, silnie pozytywną kontrolę testu Actin IgG ELISA i kontrolę negatywną testu ELISA należy obsługiwać w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. 2

3 Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami testu Actin IgG ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu Actin IgG ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu Actin IgG ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu Actin IgG ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu Actin IgG ELISA i kontroli negatywnej testu ELISA. 4. Ustalenie obecności lub nieobecności aktyny z zastosowaniem jednostek umownych wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli oraz jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu Actin IgG ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu Actin IgG ELISA, kontroli negatywnej testu ELISA i rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3

4 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą testu Actin IgG ELISA, silnie pozytywną kontrolą testu Actin IgG ELISA i kontrolą negatywną testu ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola testu Actin IgG ELISA, silnie pozytywna kontrola testu Actin IgG ELISA i kontrola negatywna ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze - 20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu Actin IgG ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu Actin IgG ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu Actin IgG ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu Actin IgG ELISA musi być ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej testu ELISA lub być większa niż 0,25. d. Kontrola negatywna ELISA i silnie pozytywna kontrola testu Actin IgG ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Silnie pozytywna kontrola testu Actin IgG ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI (NCCLS) C24-A. Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli testu Actin IgG ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu Actin IgG ELISA, którą można znaleźć na etykiecie. Wartość próbki = (jednostki) Gęstość optyczna próbki gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu Actin IgG ELISA 4 x słabo pozytywna kontrola testu Actin IgG ELISA (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić seryjne badanie próbek otrzymanych od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem

5 pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. 5

6 Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, umiarkowanie bądź silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywna <20 Słabo pozytywna Od umiarkowanie do silnie pozytywnego >30 1. Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał przeciwko aktynie i sugeruje możliwość wystąpienia autoimmunologicznego zapalenia wątroby lub przewlekłego aktywnego zapalenia wątroby. 2. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała przeciwko aktynie, lub że ich poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania. 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki uzyskano stosując zestaw testowy INOVA QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości przeciwciał przeciwko aktynie uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu. 2. Nie u wszystkich pacjentów z przewlekłą aktywną chorobą wątroby lub pierwotną marskością żółciowej występują przeciwciała przeciwko aktynie. 3. Nie we wszystkich próbkach dających wynik pozytywny na obecność przeciwciał przeciwko mięśniom gładkim występować będą przeciwciała przeciwko aktynie. 4. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 5. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. 6. Na tym etapie, nieznany jest wpływ terapii na poziom autoprzeciwciał przeciwko aktynie. Spodziewane wartości Zdolność testu QUANTA Lite Actin IgG ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko aktynie oceniono przez porównanie z dostępnym w handlu testem immunofluorescencyjnym, wykorzystując próbki od pacjentów zdefiniowanych klinicznie. Wyniki testu immunofluorescencyjnego ustalono zgodnie z broszurą jego producenta. Normalny zakres Badanie na populacji z zakresu normalnego przeprowadzono w laboratorium badawczym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Wybrano losowo sto pięćdziesiąt próbek od osób zdrowych i przebadano je z zastosowaniem testu QUANTA Lite Actin IgG ELISA. Populacja ta składała się z 89 mężczyzn w wielu od 18 do 70 lat (średnia wieku 31 lat) i 61 kobiet w wieku od 17 do 74 lat (średnia wieku 36). Jedynie 3 z tych 150 próbek dały wynik pozytywny. Dwie próbki dały wynik umiarkowany do silnie pozytywnego (75 i 31 jednostki) a pozostała próbka dała wynik słabo pozytywny (21 jednostek). Wartość graniczna wyników pozytywnych dla testu wynosi 20 jednostek. Średnia wartość we tej grupie 150 próbek pochodzących od osób zdrowych wynosiła 7,3 jednostki. Trzy próbki od osób zdrowych dające wynik pozytywny przebadano z zastosowaniem zestawu NOVA Lite ANA Plus Mouse Kidney & Stomach wykorzystującego zasadę immunofluorescencji. Próbki dające wynik silnie pozytywny (75 i 31 jednostek) dały reakcję pozytywną z klasycznym wzorcem obecności przeciwciał przeciwko aktynie mięśni gładkich. W próbkach tych obserwowano jasne świecenie spowodowane reakcją fluorescencyjną z mięśniem gładkim naczyń krwionośnych nerki, warstwy mięśniowej żołądka jak również pęczków białek kurczliwych przebiegających między komórkami ściennymi żołądka. Dla próbki dającej słabszy wynik (21 jednostek) zaobserwowano nietypowe wybarwienie tkanki mięśnia gładkiego, bardziej zbliżone do tego, jakie charakteryzuje retikulinę. 6

7 Względna zgodność wyników testu ELISA i testu immunofluorescencji W celu określenia czułości i swoistości względnej testu, przebadano 83 próbek przesłanych do badania pod kątem przeciwciał przeciwko mięśniom gładkim, wymienionych w tabeli powyżej i dodatkowe 150 próbek od osób zdrowych, stosując test QUANTA Lite Actin IgG ELISA oraz inny dostępny w handlu test IFA. Spośród 233 próbek 65 było pozytywnych a 136 negatywnych wg obu metod. Trzydzieści dwie próbki dały wynik pozytywny w teście IFA, lecz nie w teście ELISA. Spośród tych 32 próbek dających w teście IFA wynik pozytywny, lecz negatywny w teście ELISA, 11 pochodziło od osób zdrowych a 17 z pozostałych 21 próbek dało w teście IFA wynik pozytywny, lecz jedynie w rozcieńczeniu 1:40. Test QUANTA Lite Actin IgG ELISA Zgodność wyników pozytywnych 67,0% Test IFA Zgodność wyników negatywnych 100% Ogólna zgodność 86,3% Swoistość i wrażliwość kliniczna Poniżej podano zestawienie otrzymanych wyników badań klinicznych przeprowadzonych w laboratoriach INOVA oraz wyników 1 badania zewnętrznego. Grupa pacjentów Liczba Liczba wyników pozytywnych % Pozytywny Autoimmunologiczne zapalenie wątroby (AIH) ,4 Kryptogenne zapalenie wątroby ,0 Autoimmunologiczne zapalenie dróg żółciowych ,5 Pierwotna żółciowa marskość wątroby (PBC) ,0 Zachodzenie AIH/PBC ,8 Zachodzenie AIH/PSC ,0 Polekowe zapalenie wątroby ,0 Autoimmunologiczne zapalenie wątroby typu ,0 Wirusowe zapalenie wątroby 3 0 0,0 Marskość 1 0 0,0 Pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych (PSC) 1 0 0,0 Próbki kontrolne z autoprzeciwciałami ,0 Normalne ,8 Czułość testu względem AIH może być właściwie wyższa niż wykazana, gdyż przed pobraniem próbki wielu tych pacjentów poddawanych było leczeniu immunosupresyjnemu. Ponadto od wielu pacjentów pobrano wiele próbek. Seropozytywność w powyższej tabeli określono jako wynik pozytywny uzyskany dla najwcześniej pobranej próbki. Dla 7 pacjentów z AIH, 1 pacjenta z AIH/PBC oraz 1 pacjenta z AIH/PSC uzyskano wynik pozytywny w później pobieranych próbkach, co prowadziło do uzyskania dla grupy AIH czułości wynoszącej 75,7%. Reaktywność krzyżowa Aby ocenić potencjalne reakcje krzyżowe innych autoprzeciwciał z testem QUANTA Lite Actin IgG ELISA przebadano ogółem 68 różnych surowic, z których każda zawierała wysokie miano różnych powszechnie badanych autoprzeciwciał. Grupa ta składała się z 68 próbek, z których 6 pochodziło od pacjentów z SLE z wysokim mianem ANA i przeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA, 2 zawierały czynnik reumatoidalny, 6 surowic zawierało przeciwciała przeciwko endomysium/transglutaminazie tkankowej, 7 surowic zawierało przeciwciała przeciwko peroksydazie tarczycowej (TPO). Było 8 próbek dających pozytywny wynik na obecność przeciwciał przeciwko ANCA, 4 - dla P-ANCA i 4 dla C-ANCA. Jedna zawierająca przeciwciała przeciwko kłębuszkowej błonie podstawnej (GBM), 1 zawierające antykoagulant tocznia i po 4 zawierające przeciwciała przeciwko Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70 i Jo-1. Pozostałe 4 surowice zawierały przeciwciała przeciwko kardiolipinie, 3 - przeciwciała przeciwko β 2 GPI, 2 - przeciwciała przeciwko protrombinie, 1 - przeciwciała przeciwko histonom, a 3 próbki pochodziły od pacjentów z cukrzycą typu I zawierające ICA. Jedynie 4 próbki dały wynik pozytywny. Dwie próbki dały wynik silnie pozytywny (83 i 66 jednostki). W testach metodą IFA na zestawie NOVA Lite ANA Plus Mouse Kidney & Stomach obie próbki dały wykazały obecność przeciwciał przeciwko mięśniom gładkim do miana 1:320 z charakterystycznym wzorem aktynowym. Dwie próbki dały wynik słabo pozytywny a wynik dla każdej z nich wynosił 26 jednostek. Żadna z nich nie wykazała żadnej reaktywności z tkanką mięśni gładkich w metodzie immunofluorescencyjnej. Obie próbki wykazały obecność przeciwciał ANA/przeciwko DNA. 7

8 Badanie 83 próbek zawierających przeciwciała przeciwko mięśniom gładkim W poniższej tabeli podano wyniki pozytywne potwierdzające obecność przeciwciał przeciwko aktynie w teście ELISA w porównaniu z mianem przeciwciał przeciwko mięśniom gładkim w teście IFA. Miano IFA Liczba Liczba wyników pozytywnych na obecność przeciwciał przeciwko aktynie % Pozytywny % % % % % % % Ogółem % Precyzja i powtarzalność Precyzja i powtarzalność badania zostały przebadane przez przeprowadzenie sześciu powtórzeń każdej negatywnej (14 jednostek), słabo pozytywnej (25 jednostek) i silnie pozytywnej próbki (110 jednostek) w sześciu oddzielnych badaniach. Precyzję w obrębie badania i między badaniami obliczono w sposób następujący: Poniżej znajduje się podsumowanie odchylenia standardowego oraz współczynnika zmienności dla każdej próbki. Negatywna Słabo pozytywna Silnie pozytywna SD CV SD CV SD CV Łącznie 1,3 9,7% 1,4 5,5% 4,5 4,1% W ramach serii 1,1 8,0% 1,4 5,8% 3,8 3,5% Pomiędzy seriami 1,2 8,6% 1,3 5,3% 5,3 4,2% Piśmiennictwo 1. Anderson P, et al. Studies on the specificity of smooth-muscle antibodies. Clin Exp Immunol 26:57-66, Bottazzo GF, et al. Classification of smooth muscle autoantibodies detected by immunofluorescence. J Clin Pathol 129: , George, J and Shoenfeld Y. Actin Autoantibodies, p10-12 in Autoantibodies by JB Peter and Y Shoenfeld eds. Elsevier, Amsterdam, Bretherton L, et al. Elisa assay for IgG autotantibody to G-actin: comparison of chronic active hepatitis and acute viral hepatitis. Clin Exp Immunol 51: , Dighiero G, et al. Sera with high levels of antismooth muscle and anti mitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeletal proteins. Clin Ept Immunol 82:52-56, Fagraeus A and Norberg R. Antiactin antibodies. Curr Top Microbiol Immunol 82:1-13, DeScheerder I, et al. Post-Cardiac injury syndrome and an increased humoral immune response against the major contractile proteins (actin and myosin). Am J Cardiol 56: , Leibovitch L, et al. Anti-actin antibodies in sera from patients with autoimmune liver diseases and patients with carcinomas by ELISA. Immunol Letters 48: , Kurki P, et al. Smooth muscle antibodies of actin and nonactin specificity. Clin Immuno Immunpathol 9: , Toh BH, et al. Viral infections and IgM autoantibody to cytoplasmic intermediate filaments. Clin Exp Immunol 37:76-82, Alvarez F, et al. International autoimmune hepatitis group report: review of criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis. J of Hepatology 31: , Toh BH. Smooth muscle atuoantibodies and autoantigens. Clin Exp Immunol 38: , Fusconi M, et al. Anti-actin antibodies: a new test for an old problem? J Immunol Mehtods 130:1-8, Czaja A, et al. Frequency and significance of antibodies to actin in type 1 autoimmune hepatitis. Hepatology 24: , Homberg J, et al. Chronic active hepatitis associated with antiliver/kidney microsome antibody type 1: a second type of autoimmune hepatitis. Hepatology 7: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 8

9 QUANTA Lite, NOVA Lite i INOVA Diagnostics, Inc. są zastrzeżonym znakiem handlowym firmy Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Sierpień 2011 Wersja 0 9