QUANTA Lite Gliadin IgG II Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite Gliadin IgG II Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite TM Gliadin IgG II jest to immunoenzymatyczny test do półilościowego oznaczania przeciwciał IgG przeciwko gliadynie w surowicy człowieka. W połączeniu z wynikami klinicznymi i innymi testami laboratoryjnymi do diagnozowania celiakii wykorzystać można badanie na obecność przeciwciał przeciwko gliadynie. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Celiakia lub enteropatia związana z nadwrażliwością na gluten to choroba przewlekła, której główne cechy obejmują stan zapalny i charakterystyczne histologiczne spłaszczenie błony śluzowej przewodu pokarmowego, którego skutkiem jest zespół złego wchłaniania. Dokładna etiologia choroby pozostaje nieznana, ale gliadyna lub rozpuszczalna w alkoholu frakcja glutenu pszennego jest zdecydowanie czynnikiem toksycznym. 1 Początkowo, w celu zdiagnozowania celiakii i zaburzeń pokrewnych wykonywano szereg wielokrotnych biopsji jelitowych. Ostatnio zasugerowano wykonywanie badań serologicznych jako badań przesiewowych wykonywanych u pacjentów z podejrzeniem enteropatii wrażliwej na gluten, jak również do monitorowania przestrzegania diety. 2-5 Europejskie Towarzystwo Gastroenterologii Pediatrycznej (European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN)) w celu zmniejszenia liczby biopsji jelita potrzebnych do postawienia rozpoznania zaleciło stosowanie markerów serologicznych, takich jak gliadyna, jak również przeciwciał przeciwko retikulinie (białko tkanki łącznej układu chłonnego) i śródmięsnej (endomysium). 6 Ostatnie prace wykazały, że przeciwciała wchodzące w reakcję z gliadyną u pacjentów z celiakią wiążą się z bardzo ograniczoną liczbą konkretnych determinant antygenowych na cząsteczce gliadyny. 7,8 Te same badania wykazały ponadto, że deamidacja gliadyny przez transglutaminazę tkankową - enzym powiązany z celiakią - skutkuje zwiększonym wiązaniem przez przeciwciała przeciw gliadynie. W oparciu o powyższe obserwacje wykazano, że testy wykorzystujące deamidowane i zdefiniowane peptydy są dokładniejsze w wykrywaniu celiakii, niż standardowe testy wykrywające przeciwciała przeciw gliadynie. 9 U pacjentów cierpiących na enteropatię związaną z nadwrażliwością na gluten w surowicy wykrywane są zarówno przeciwciała IgA jak i IgG. 2,3 Wydaje się, że przeciwciała IgG przeciw gliadynie są bardziej wrażliwymi, lecz również mniej swoistymi markerami choroby niż przeciwciała klasy IgA. Przeciwciała IgA gliadyny są mniej wrażliwe, ale bardziej swoiste. Strategia stosowania czułych testów przesiewowych w populacji o podwyższonym ryzyku obejmuje badania zarówno w kierunku obecności przeciwciał IgG i IgA gliadyny, jako że znaczna część pacjentów z celiakią to chorzy z niedoborem IgA. 10 Przeciwciała IgA gliadyny są ważne w ocenie aktywności choroby w czasie oraz w celu monitorowania skuteczności stosowania diety bezglutenowej. 5 Zasada badania Oczyszczone peptydy gliadyny są wiązane z dołkami polistyrenowej płytki z mikrodołkami w warunkach, które pozwalają na zachowanie antygenu w stanie natywnym. Rozcieńczone wstępnie próbki kontrolne i rozcieńczone surowice pochodzące od pacjentów dodaje się do oddzielnych dołków, co umożliwia związanie się wszelkich występujących w próbce przeciwciał IgG przeciwko gliadynie z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonymi peptydami gliadyny (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko IgG gliadyny, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Słabo pozytywna kontrola IgG II gliadyny ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko IgG gliadyny, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Wysoko pozytywna kontrola IgG II gliadyny ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko IgG gliadyny, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml 1

2 Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HbsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną kontrolę IgG II gliadyny ELISA, wysoko pozytywną kontrolę IgG II gliadyny ELISA i kontrolę negatywną ELISA należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/ dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. 2

3 Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami Gliadin IgG II ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli IgG II gliadyny ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli IgG II gliadyny ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli IgG II gliadyny ELISA, wysoko pozytywnej kontroli IgG II gliadyny ELISA i kontroli negatywnej ELISA. 4. W celu stwierdzenia obecności lub braku IgG przeciwko gliadynie z zastosowaniem jednostek arbitralnych, potrzebne są po dwa dołki na każdą z trzech kontroli i jeden do dwóch dołków na każdą próbkę pochodzącą od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli IgG II gliadyny ELISA, wysoko pozytywnej kontroli IgG II gliadyny ELISA, kontroli negatywnej ELISA i rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i delikatnie strząsnąć ją na materiał chłonny, aby usunąć wszelkie pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. 3

4 Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą IgG II gliadyny ELISA, wysoko pozytywną kontrolą IgG II gliadyny ELISA i kontrolą negatywną ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola IgG II gliadyny ELISA, wysoko pozytywna kontrola IgG II gliadyny ELISA i kontrola negatywna ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli IgG II gliadyny ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli IgG II gliadyny ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli IgG II gliadyny ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli IgG II gliadyny ELISA musi być ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej ELISA lub być większa niż 0,25. d. Kontrola negatywna ELISA i wysoko pozytywna kontrola IgG II gliadyny ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Wysoko pozytywna kontrola IgG II gliadyny ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie NCCLS C24-A2. Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli IgG II gliadyny ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli IgG II gliadyny ELISA, którą można znaleźć na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = - x Słabo pozytywna kontrola IgG II gliadyny ELISA (jednostki) x gęstość optyczna słabo (jednostki) pozytywnej kontroli IgG II gliadyny ELISA Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, średnio pozytywna lub silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywny <20 Słabo pozytywna Możliwe są wyniki od średnio pozytywnych do Silnie pozytywna >30 1. Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał IgG przeciwko gliadynie i sugeruje możliwość występowania pewnych enteropatii związanych z nadwrażliwością na gluten, takich jak celiakia i opryszczkowe zapalenie skóry. 2. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała IgG przeciwko gliadynie, lub że ich poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania. 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki otrzymano przy wykorzystaniu zestawu INOVA QUANTA Lite Gliadin IgG II. Nie można stosować zamiennie wartości IgG przeciwko gliadynie uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. 4

5 Ograniczenia badania 1. Negatywny wynik dla IgA przeciwko gliadynie u nieleczonego pacjenta nie wyklucza enteropatii związanej z nadwrażliwością na gluten, zwłaszcza gdy jednocześnie występuje u niego wysoki poziom przeciwciał IgG przeciwko gliadynie. Wynik taki można często wyjaśnić, występującym względnie często w celiakii, selektywnym niedoborem IgA. 2. U leczonych pacjentów z ekspresją przeciwciał IgA, poziom IgA przeciwko gliadynie jest lepszym wskaźnikiem zgodności dietetycznej niż stężenie przeciwciał IgG przeciwko gliadynie fałszywie pozytywnych (wysokie poziomy przeciwciał bez charakterystycznych wyników histologicznych). Wiadomo, że inne zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego powodują pojawianie się w układzie krążenia przeciwciał przeciwko gliadynie; jest to głównie choroba Leśniowskiego-Crohna, nietolerancja białek pokarmowych (mleko krowie) oraz pozakaźny zespół złego wchłaniania Związek między opryszczkowym zapaleniem skóry a enteropatią związaną z nadwrażliwością na gluten jest tak duży, że sugerowano, że obie choroby mają tę samą etiologię; u takich pacjentów, oznaczanie przeciwciał przeciwko gliadynie przydaje się do wykrycia celiakii bezobjawowej i określenia stopnia zajęcia przewodu pokarmowego. 12,13 5. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 6. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Zdolność testu QUANTA Lite Gliadin IgG II do wykrywania przeciwciał IgG przeciwko gliadynie oceniono w porównaniu z testem ELISA, zamiast peptydu syntetycznego stosując całą natywną gliadynę na podłożu stałym. Normalny zakres Próbki pochodzące od pięciuset losowo wybranych dawców krwi przebadano na obecność przeciwciał IgG przeciwko gliadynie. Spośród nich, trzystu dawców było w wieku od 14 do 78 lat, a grupa obejmowała tę samą liczbę kobiet i mężczyzn. Trzy próbki (0,6%) wypadły powyżej 20-jednostkowej wartości granicznej. Spośród tych trzech wysokich wyników najwyższy z nich miał 38 jednostek. Średnia wartość dla 500 próbek wyniosła 4,5 jednostki ze standardowym odchyleniem 2,6 jednostki. Średnia wartość wynosi 5 standardowych odchyleń poniżej 20-jednostkowej wartości granicznej. Badania porównawcze Sto trzynaście próbek uzyskanych z trzech laboratoriów referencyjnych oznaczających celiakię badano na zestawie QUANTA Lite Gliadin IgG II i standardowym zestawie do oznaczania IgG przeciw gliadynie. Te wyniki oraz 500 normalnych przedstawiono poniżej. IgG przeciw gliadynie + - Łącznie IgG II przeciw gliadynie - 142* Łącznie Procentowa zgodność wyników pozytywnych: 29/171 (17.0%) Procentowa zgodność wyników negatywnych: 434/442 (98.2%) Ogólna zgodność: 463/613 (75.5%) * Przy użyciu standardowego zestawu do oznaczania IgG przeciw gliadynie 114 spośród tych 142 dało wynik fałszywie pozytywny, gdyż próbki te pochodziły od grupy normalnej. Swoistość i wrażliwość kliniczna Próbki określone klinicznie jako pochodzące od pacjentów z celiakią, bądź od pacjentów z celiakią na diecie bezglutenowej, bądź od pacjentów z celiakią na diecie bezglutenowej nadal wykazujących obecność przeciwciał śródmięśniowych lub od krewnego pierwszego stopnia pacjenta cierpiącego na celiakię badano, stosując zestaw testowy QUANTA Lite Gliadin IgG II i standardowy zestaw do przeprowadzania oznaczeń IgG przeciwko gliadynie ELISA. Poniżej podano podsumowanie dla określonych klinicznie próbek i próbek z zakresu normalnego. Liczba pozytywnych (%) Grupa pacjentów (liczba pacjentów) IgG II przeciw gliadynie (aktualny) peptyd IgG II przeciw gliadynie Próbka od pacjenta z celiakią (32) 25 (78%) 21 (66%) Próbka od pacjenta z celiakią na diecie bezglutenowej (30) 12 (40%) 5 (17%) Próbka od pacjenta z celiakią (5) 4 (80%) 3 (60%) na diecie bezglutenowej Występują przeciwciała przeciwko endomysium krewni pierwszego stopnia (20)* 11 (55%) 0 Niedobór przeciwciał IgA w celiakii (5) 5 (100%) 5 (100%) Próbka od osób zdrowych (521) 114 (22%) 3 (0,6%) * Spośród 20 z krewnych pierwszego stopnia, u żadnego nie wykazano obecności przeciwciał śródmięśniowych. 5

6 Reaktywność krzyżowa Aby ocenić kwestie potencjalnej reaktywności krzyżowej z innymi autoprzeciwciałami, na zestawie QUANTA Lite Gliadin IgG II przebadano wiele różnych, dających pozytywne wyniki, próbek o wysokich mianach autoprzeciwciał. Ogółem, przeprowadzono badania dla 45 próbek. Obejmowały one takie jak: aktyna (5), PCNA (1), AMA (1), fibrylaryna (1), chromatyna (1), histon (4), LKM (4), SS-B (4), Scl-70 (4), RNP (4), RF IgM (4), centromer (4), β 2 IgG (2), β 2 IgM (1), β 2 IgA (1) i GBM (4). Średnia wartość dla tych 45 próbek wyniosła 5,0 jednostek. Próbka o najwyższym mianie, jedna z próbek zawierających aktynę, uzyskała 51 jednostek. Próbka ta dała również wynik pozytywny na referencyjnym zestawie do oznaczania IgG przeciw gliadynie. Średnia wartość wynosi cztery standardowe odchylenia poniżej 20-jednostkowej wartości granicznej. Precyzja i powtarzalność Precyzję w obrębie badania dla QUANTA Lite Gliadin IgG II określono, przeprowadzając 5-krotne badanie 9 tych samych próbek. Wyniki zostały podsumowane tabeli 1 poniżej. Tabela 1: Precyzja w obrębie badania dla QUANTA Lite Gliadin IgG II Jednostki średnie 22,4 28,3 52,5 55,5 35, 7 59,7 3,7 4,0 3,8 SD 0,9 1,4 2,0 1,7 1,0 2,0 0,3 0,4 0,3 CV % 3,9 5,1 3,9 3,1 2,9 3,4 8,1 10,0 8,4 Zmienność pomiędzy badaniami oceniono przeprowadzając badanie panelu 5 próbek i dołączonej do zestawu wysoko pozytywnej kontroli (HPC); dwa razy dziennie (rano i popołudniu) przez 3 dni, w dwóch powtórzeniach. Wyniki zostały podsumowane tabeli 2 poniżej. Tabela 2: Precyzja pomiędzy badaniami dla QUANTA Lite Gliadin IgG II HPC A B C D E Jednostki średnie 110,6 57,0 89,0 113,8 5,2 5,7 SD 4,1 1,9 3,0 3,4 0,3 0,6 CV % 3,7 3,3 3,4 3,0 5,2 9,8 6

7 Piśmiennictwo 1. Trier JS: Celiac Sprue. N Engl J Med 325: , Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: , McMillan SA, Haughton DJ, et al.: Predictive value for coeliac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. J Intern Med 241: , Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Arch Dis Child 66: , Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Arch Dis Child 65: , Osman AA, et al.: B-Cell epitopes of gliadin. Clin Exp Immunol 121: , Aleanzi M, et al.: Celiac disease: Antibody recognition against native and selectively deamidaion gliadin peptides. Clin Chem 47: , Schwertz E, et al.: Serologic assay based on gliadin-related nonapeptides as a highly sensitive and specific diagnostic aid in celiac disease. Clin Chem 50: , Collin P, et al.: Selective IgA deficiency and coeliac disease. Scand J Gastroenterol 27: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, 2007, Fifth Edition. 12. Stober W: Gluten-sensitive enterophy: A nonallergic immune hypersensitivity of the gastrointestinal tract. J. Allergy Clin. Immunol. July , Smecuol E, et al.: Permeability, Zonulin Production, and Enteropathy in Dermatitis Herpetiformis. Clinical Gastroenterlogy and Hepatology 3: ,

8 QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Marzec 2011 Wersja 0 8