KREW: 1. Oznaczenie stężenia Hb. Metoda cyjanmethemoglobinowa: Zasada metody:

Transkrypt

1 KREW: 1. Oznaczenie stężenia Hb Metoda cyjanmethemoglobinowa: Hemoglobina i niektóre jej pochodne są utleniane przez K3 [Fe(CN)6]do methemoglobiny, a następnie przekształcane pod wpływem KCN w trwały związek cyjanmethemoglobinę, której natężenie barwy mierzymy kolorymetrycznie przy przy długości fali 540 nm i obliczamy stężenie Hb stosując podany poniżej wzór lub na podstawie ekstynkcji oraz stężenia wzorcowego roztworu cyjanomethemoglobiny. 1. Do 5 cm 3 odczynnika Drabkina dodać 0,020 cm 3 krwi. 2. Po upływie 20 minut odczytać absorbancję wobec odczynnika Drabkina (ślepa próba) przy długości fali 540 nm. 3. Wzorzec cyjanomethemoglobiny wlać do kuwety i odczytać absorbancję wobec odczynnika Drabkina. Obliczenia: a. Obliczenie na podstawie wzoru. Abad x x 200 Hb (g/100 cm 3 krwi) = x 10 x rozcieńczenie krwi = 5,025 : 0, masa molowa Hb (g/mol) 44 - milimolowy współczynnik absorbancji przy λ = 540 nm (jest to absorbancja jaką wykazuje roztwór o stężeniu 1 mmol/dm 3 i grubości warstwy 1 cm) dzielnik 10 wynika z przeliczenia z 1 dm 3 na 100 cm 3 dzielnik 1000 wynika z przeliczenia z milimoli na mole b. Obliczenie C próby badanej na podstawie A próby badanej oraz A próby wzorcowej i C próby wzorcowej.

2 2. Oznaczenie stężenia mocznika. Do trzech długich probówek oznaczonych symbolami W (wzorzec), P (próba badana), 0 (próba ślepa) dodać kolejno: Odczynniki (ml) W P 0 Ureaza 0,1 0,1 0,1 Wzorcowy roztwór mocznika 0, Surowica - 0,01 - H2O - - 0,01 Roztwór fenolu z nitroprusydkiem sodu Inkubować w temp. 37 o C 5 min. 0,5 0,5 0,5 Podchloryn sodu 0,5 0,5 0,5 Pozostawić w temperaturze pokojowej 10 min. H2O Ekstynkcję próby wzorcowej i badanej zmierzyć wobec próby ślepej przy długości fali 630 nm. Obliczyć stężenie mocznika w surowicy wyrażone w mg/dl przyjmując, że stężenie wzorca wynosi 60 mg/dl. Przedstawić wynik także w mg/l. 3. Oznaczenie stężenia kwasu moczowego. Do trzech długich probówek oznaczonych symbolami W (wzorzec), P (próba badana), 0 (próba ślepa) dodać kolejno:

3 Składnik próby (ml) Próba badana Próba wzorcowa Próba odczynnikowa Wzorcowy roztwór kwasu moczowego 1,0 - surowica 1,0 - H2O - - 1,0 Węglan sodu 0,5 0,5 0,5 Kwas fosforowolframowy 0,5 0,5 0,5 Wymieszać i pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie zmierzyć absorbancję próby badanej i próby wzorcowej względem próby odczynnikowej przy długości fali 700 nm. Pomiar zakończyć w ciągu minut (po tym czasie pojawia się zmętnienie). Obliczyć stężenie kwasu moczowego w surowicy wyrażone w mg/dl przyjmując, że stężenie wzorca wynosi 1,4 mg/dl. Przedstawić wynik także w mg/l. 4. Oznaczenie stężenia ceruloplazminy oraz aktywności właściwej ceruloplazminy w surowicy. Oznaczanie aktywności ceruloplazminy metodą Ravina: W metodzie wykorzystuje się enzymatyczną aktywność ceruloplazminy jako oksydazy. Ceruloplazmina utlenia substrat, którym jest p-fenylenodiamina (PPD). Dzięki wytworzeniu komleksu Cp-PPD elektrony z substratu zostają przeniesione na Cu enzymu. Cu ulega redukcji z +2 na +1 stopień utlenienia, a z substratu powstaje wolny rodnik. Cu zawarta w cząsteczce enzymu ulega utlenieniu przez tlen i dzięki temu może utleniać kolejną cząsteczkę substratu. 3 cząsteczki substratu tworzą barwny produkt zwany zasadą Bandrowskiego.

4 Azydek sodu hamuje reakcję enzymatyczną. Do dwóch probówek oznaczonych P (próba badana), O (próba ślepa) dodać kolejno: Odczynniki (ml) P O 0,4 N bufor octanowy ph 5,6 4 4 Surowica 0,05 0,05 0,5 % azydek sodu - 0,5 0,5 % chlorowodorek p-fenylenodwuaminy 0,5 0,5 Inkubować w temp C 1 godz. 0,5 % azydek sodu 0,5 - Zmierzyć ekstynkcję przy długości fali 530 nm. a. Obliczyć stężenie ceruloplazminy w mg/dl Według wzoru: c = Ep x 50 mg/dl (współczynnik wyznaczony eksperymentalnie przy użyciu surowic wzorcowych). b. Obliczyć aktywność w jednostkach międzynarodowych IU. Obliczanie aktywność właściwej w jednostkach U/mg białka. Molowy współczynnik absorpcji dla produktu powstającego z 3 cząsteczek substratu wynosi 1,91 1, mikromol/ml A x mikromol/ml x-jest to stężenie (mikromol/ml) produktu w badanym roztworze, którego objętość wynosi 5,05 ml. y = ilość mikromoli produktu reakcji w objętości 5,05 ml czyli y = x pomnożone przez 5,05ml Ilość mikromoli substratu (PPD) jest 3 razy większa, bo 1 cząsteczka produktu powstaje z 3 cząsteczek substratu. Ilość moli PPD została utleniona przez 60 min, więc należy tę wartość podzielić

5 przez 60, aby otrzymać wynik na minutę bo to wynika z definicji U. Aby podać aktywność właściwą U/mg białka należy stężenie ceruloplazminy (wyliczone w punkcie a) odnieść do 0,05 ml roztworu zastosowanego w oznaczeniu i U podzielić przez tę wartość (U/mg). 5. Wykrywanie żelaza. Do 2 probówek dodać odczynniki wg schematu zamieszczonego w tabelce: Odczynniki (ml) O P Odbiałczona surowica - 1 H2O 1 - Odczynnik zawierający hydroksylaminę i fenantrolinę Zanotować wynik obserwacji. 1 1 Zamieszać i ogrzewać w temp. 100 o C 5 minut 6. Wykrywanie magnezu. W roztworze o odczynie alkalicznym, zawierającym calmagit (kwas 1-/1-hydroksy-4-metylo-2-fenylozo/-2-naftolo-4-sulfonowy) magnez tworzy różowo-fioletowy kompleks. Reakcja ta jest specyficzna w obecności EGTA (kwas /etylenoglycol-bis/2-aminoetylo-eter/-n,n-czterooctowy). Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia magnezu. Do 2 polistyrenowych probówek dodać odczynniki wg schematu zamieszczonego w tabelce: Odczynniki (ml) O P Odbiałczona surowica - 0,02 H2O 0,02 - Odczynnik zawierający calmagit i EGTA Zanotować wynik obserwacji. 1 1 Zamieszać i pozostawić w temp. pokojowej na 5 minut

6