QUANTA Lite h-ttg Screen Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite h-ttg Screen Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie Test badania przesiewowego QUANTA Lite TM h-ttg jest testem immunoabsorpcji enzymatycznej (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał IgA i IgG ludzkiej transglutaminazy tkankowej (h-ttg) w ludzkiej surowicy. Obecność tych przeciwciał można wykorzystać w połączeniu z wynikami klinicznymi i innymi testami laboratoryjnymi do wspomagania diagnozy celiakii z wystarczającym lub niewystarczającym poziomem IgA oraz opryszczkowego zapalenia skóry. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Celiakia lub enteropatia związana z nadwrażliwością na gluten to choroba przewlekła, której główne cechy obejmują stan zapalny i charakterystyczne histologiczne spłaszczenie błony śluzowej przewodu pokarmowego, którego skutkiem jest zespół złego wchłaniania. Dokładna etiologia choroby pozostaje nieznana, ale gliadyna lub rozpuszczalna w alkoholu frakcja glutenu pszennego jest zdecydowanie czynnikiem toksycznym. 1 Pierwotnie do diagnozowania celiakii i powiązanych zaburzeń stosowano serię biopsji jelitowych. Ostatnio zasugerowano wykonywanie badań serologicznych jako badań przesiewowych wykonywanych u pacjentów z podejrzeniem enteropatii wrażliwej na gluten, jak również do monitorowania przestrzegania diety. 2-5 Europejskie Towarzystwo Gastroenterologii Pediatrycznej (European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN)) w celu zmniejszenia liczby biopsji jelita potrzebnych do postawienia rozpoznania zaleciło stosowanie markerów serologicznych, takich jak gliadyna, jak również przeciwciał przeciwko retikulinie (białko tkanki łącznej układu chłonnego) i śródmięsnej (endomysium). 6 Antygen śródmięsnej został zidentyfikowany jako enzym sieciujący białka, znany jako transglutaminaza tkankowa (ttg). 7,8 Badania ELISA pod kątem antygenów obejmujące ttg stanowią rzetelną i obiektywną metodę wobec tradycyjnych immunofluorescencyjnych badań obejmujących cienkie skrawki przełyku naczelnych jako substrat Badanie ELISA może być przystosowane do dużych jak i małych ilości próbek pacjentów. W ciągu ostatnich dwóch lat przy użyciu techniki rekombinacji wytworzono antygen ludzkiego ttg. Rekombinowany antygen ludzki może mieć pewne zalety w stosunku do bardziej tradycyjnego antygenu wątroby świnki morskiej. 9,10,13 Dwoma kolejnymi innowacjami w zakresie serologii celiakii jest użycie pierwotnej ludzkiej transglutaminazy tkankowej wyizolowanej z krwinek czerwonych oraz użycie testów umożliwiających wykrywanie transglutaminazy tkankowej klasy IgG. Użycie pierwotnych ludzkich czerwonych krwinek ttg zamiast krwinek świnki morskiej lub rekombinowanego antygenu ludzkiego zapewnia korzyści związane z ułatwieniem oczyszczania oraz umożliwia uzyskanie preparatów pozbawionych bakterii, insektów oraz innych zanieczyszczających białek. 14,15,16,17 Badania ELISA ludzkiego antygenu ttg, które są przedstawiane w literaturze cieszą się dobrą opinią w porównaniu z bardziej tradycyjnymi testami bazującymi na antygenie świnki morskiej. 9,10,13-16 Zestaw przeciwciał gliadyny klasy IgG jest już używany od jakiegoś czasu, przede wszystkim w celu zapewnienia pomocy w badaniu osób z niedoborem IgA. Liczne przeprowadzone badania wykazały zdatność kliniczną wykrywania przeciwciał klasy IgG wobec ttg. 10,13,14 W jednym z badań wrażliwość testu została zwiększona z 91,5 dla przeciwciał IgA do 98,5% przy rozpatrywaniu wyników IgA i IgG. 10 Opryszczkowe zapalenie skóry skóry (ang. Dermatitis Herpetiformis, DH) to choroba skóry wywoływana, podobnie jak celiakia, przez trawienie białka pszenicy. Większość pacjentów z DH ma atrofię kosmków jelita czczego identyczną z występującą w przypadku celiakii i ścisła dieta bezglutenowa powoduje poprawę zmian chorobowych jelit oraz skóry. 18,19 Bieżące metody serologiczne, takie jak testy EMA i ttg wykazują niezadowalającą wydajność podczas badania pod kątem DH (wrażliwość w zakresie zaledwie 60 75%) 20,21 w porównaniu z wrażliwością 95% i wyższą w przypadku celiakii. Badanie przesiewowe The QUANTA Plex TM h-ttg jest badaniem na przeciwciała wykrywane u osób z celiakią oraz z powiązanym opryszczkowym zapaleniem skóry. Umożliwia ono jednoczesne wykrywanie przeciwciał IgA i IgG przeciw selektywnie deamidowanym syntetycznym peptydom oraz h-ttg oraz umożliwia wykrywanie celiakii nawet z jednoczesnym niedoborem IgA. Zasada badania Pierwotna ludzka transglutaminaza tkankowa wiąże się z dołkami płytek polistyrenowych w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego naturalnym stanie. Wstępnie rozcieńczone kontrole oraz surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków, umożliwiając związanie wszelkich występujących przeciwciał IgG i h- ttg IgA z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem koniugatu przeciwciał przeciw-ludzkich IgA i IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgA i IgG znakowanych enzymem związanie się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgA i IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. 1

2 Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczoną ludzką transglutaminazą tkankową (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał IgA i IgG przeciwko h-ttg, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia, 1,2 ml 3. Słabo pozytywne badanie przesiewowe ELISA h-ttg, 1 fiolka buforu zawierającego środek konserwujący oraz przeciwciała IgA i IgG surowicy ludzkiej przeciwko h-ttg, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia, 1,2 ml 4. Silnie pozytywne badanie przesiewowe ELISA h-ttg, 1 fiolka buforu zawierającego środek konserwujący oraz przeciwciała IgA i IgG surowicy ludzkiej przeciwko h-ttg, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP h-ttg IgG/IgA badania (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG i IgA, 1 fiolka bezbarwny, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0.344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego powodu słabo pozytywna kontrola testu ELISA badania przesiewowego h-ttg, wysoko pozytywna kontrola testu ELISA badania przesiewowego h-ttg i kontrola negatywna testu ELISA powinny być przeprowadzane w taki sam sposób jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 2

3 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. 23 Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami testu ELISA badania przesiewowego h-ttg (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli h-ttg ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli h-ttg ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu HRP h-ttg IgG/IgA, (koziego), przeciw-ludzkie IgG i IgA 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0.344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje stabilność przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu ELISA badania przesiewowego h-ttg, wysoko pozytywnej kontroli testu ELISA badania przesiewowego h-ttg i kontroli negatywnej testu ELISA. 4. Oznaczenie obecności lub braku przeciwciał IgA i/lub IgG h-ttg z wykorzystaniem jednostek dowolnych wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli lub jednego bądź dwóch dołków dla każdej próbki pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 3

4 2. Dodać do dołków 100 µl wstępnie rozcieńczonej kontroli słabo pozytywnej testu ELISA badania przesiewowego h-ttg, kontroli silnie pozytywnej test ELISA badania przesiewowego h-ttg, kontroli negatywnej testu ELISA oraz rozcieńczonych próbek pacjenta. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu HRP h-ttg IgG/IgA. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Z każdą serią próbek należy oznaczać słabo pozytywną kontrolę testu ELISA badania przesiewowego h-ttg, wysoko pozytywną kontrolą testu ELISA badania przesiewowego h-ttg i kontrolą negatywną testu ELISA, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury są prawidłowe. 2. Uwaga: w związku z tym, że słaba pozytywna kontrola badania ELISA the h-ttg, silna pozytywna kontrola badania ELISA h-ttg oraz negatywna kontrola ELISA są wstępnie rozcieńczone, nie mają one zastosowania w metodach badań związanych z rozcieńczeniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze - 20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu ELISA badania przesiewowego h-ttg musi być wyższa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ELISA badania przesiewowego h-ttg, która musi być wyższa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA. b. Wstępnie rozcieńczona silnie pozytywna kontrola testu ELISA badania przesiewowego h-ttg musi mieć absorbancję wyższą niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej nie może przekraczać 0,2. c. Absorbancja słabo pozytywnej kontroli testu ELISA badania przesiewowego h-ttg musi być przynajmniej dwukrotnie wyższa od kontroli negatywnej testu ELISA lub przekraczać 0,25. d. Kontrola negatywna testu ELISA oraz wysoko pozytywna kontrola testu ELISA badania przesiewowego h-ttg mają monitorować występowanie poważnych nieprawidłowości związanych z odczynnikami. Wysoko pozytywna kontrola testu ELISA badania przesiewowego h-ttg nie zapewni precyzji na poziomie wartości granicznej testu. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QA można znaleźć w dokumencie CLSI (NCCLS) C24-A3. 24 Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność dla każdej próbki można następnie obliczyć dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli testu ELISA badania przesiewowego h-ttg. Wynik jest mnożony przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu ELISA badania przesiewowego h-ttg występującej na etykiecie. Wartość próbki = (jednostki) Gęstość optyczna próbki x słabo pozytywna kontrola testu ELISA badania przesiewowego h-ttg Gęstość optyczna słabo pozytywnej (jednostki) kontroli testu ELISA badania przesiewowego h-ttg 4

5 Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna lub pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywny <20 Pozytywna Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał IgA i/lub IgG h-ttg i sugeruje możliwość występowania określonych enteropatii wrażliwości na gluten, takich jak celiakia i zapalenie opryszczkowate skóry. Jeśli wymagane jest potwierdzenie niedoboru IgA, próbka powinna być przebadana przy użyciu testu ilościowego IgA. 2. Wynik negatywny wskazuje brak przeciwciał przeciwciał IgA i/lub IgG h-ttg lub ich poziom poniżej wartości granicznej testu. 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki zostały uzyskane przy użyciu zestawu INOVA QUANTA Lite badania przesiewowego h-ttg. Wartości h-ttg Ig G/A uzyskane przy użyciu analiz innych producentów nie mogą być używane zamiennie. Rząd wielkości poziomów raportowanego przeciwciała nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Wynik negatywny u nieleczonego pacjenta nie wyklucza całkowicie enteropatii wrażliwości na gluten. 2. fałszywie pozytywnych (wysokie poziomy przeciwciał bez charakterystycznych wyników histologicznych). Mogą być przeprowadzone inne specyficzne testy serologiczne na celiakię, takie jak śródmięśniowy peptyd gliadyny (EMA) deamidowany peptyd gliadyny (DGP) w celu potwierdzenia pozytywnych wyników. Mogą być również mierzone poziomy surowicy IgA w celu sprawdzenia niedoboru IgA. 3. Ten test wykrywa jednocześnie przeciwciała IgA i IgG. Jeśli wymagane jest indywidualne oznaczanie swoistych przeciwciał IgA lub IgG, firma INOVA zapewnia w tym celu oddzielne zestawy ELISA dla przeciwciał IgA i IgG (QUANTA Lite h-ttg IgA oraz QUANTA Lite h-ttg IgG). 4. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 5. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. 6. To badanie nie zostało zatwierdzone do stosowania w przypadku populacji dziecięcej. Spodziewane wartości Normalny zakres 381 losowych bezobjawowych, zdrowych osób mieszkających w Stanach Zjednoczonych poddano badaniom pod kątem przeciwciał h-ttg. Wśród nich 269 dawców mieściło się w zakresie wieku od 14 do 78 lat i grupa obejmowała 141 mężczyzn i 128 kobiet. 8 próbek (2,1%) wypadło powyżej 20-jednostkowej wartości granicznej. 7 próbek było pozytywnych i miało wartość 20,3, 20,4, 22,1, 22,6, 23,3, 28,4 i 32,4 jednostki. Ostatnia pozytywna wartość wynosiła 54,9 jednostki i jest ona traktowana jako prawdziwa celiakia, ponieważ wyniki h-ttg IgA wynosiły 72,4 jednostek. Średnia wartość spośród tych 381 wynosiła 8,6 jednostki. Standardowe odchylenie próbek wyniosło 4,4 jednostki. Średnia wartość wynosi 2,5 standardowych odchyleń poniżej 20-jednostkowej wartości granicznej. Specyficzna charakterystyka wyników Porównanie z urządzeniami predykatowymi 125 próbek z 4 referencyjnych laboratoriów celiakii zostało przebadanych wewnętrznie za pomocą testu QUANTA Lite h-ttg IgA oraz QUANTA Lite h-ttg IgG ELISA i QUANTA Lite h-ttg ELISA. Te wyniki oraz 381 normalnych przedstawiono poniżej. Próbka została potraktowana jako pozytywna przez urządzenia predykatowe, jeśli występował pozytywny wynik w jednym z 2 urządzeń predykatowych (wynik nie musiał być pozytywny w przypadku obu urządzeń). Próbka została potraktowana jako negatywna przez urządzenia predykatowe, jeśli występował negatywny wynik we wszystkich trzech urządzeniach predykatowych. QUANTA Lite h-ttg IgA lub IgG Pozytywna Negatywny Łącznie QUANTA Lite Pozytywna 52 13* 65 Badanie przesiewowe h-ttg Negatywny Łącznie

6 Procentowa zgodność wyników pozytywnych: 52/52 (100%), przedział ufności 95%: od 93,2% do 100% Procentowa zgodność wyników negatywnych: 441/454 (97,1%), przedział ufności 95%: od 95,2% do 98,5% Ogólna zgodność: 493/506 (97,4%), przedział ufności 95%: od 96,7% do 99,1% *Z 13 próbek sklasyfikowanych jako pozytywne w ramach badania przesiewowego h-ttg, ale sklasyfikowanych jako negatywne w ramach obu badań h-ttg, 7 pochodziło z normalnego badania. Z pozostałych 6 pacjentów, 3 pochodziło od pacjentów z celiakią na diecie bezglutenowej, dwóch było krewnymi 1. stopnia a ostatnia osoba była zdrowa. Wszystkie 13 próbek miało wartości poniżej 30 jednostek. Badania kliniczne Próbki określone klinicznie jako pochodzące od pacjentów z celiakią, od pacjentów z celiakią z niedoborem IgA, od pacjentów z celiakią utajoną, od pacjentów z celiakią będących na diecie bezglutenowej, krewnych pierwszego stopnia pacjentów z celiakią, kontroli z niedoborem IgA, pacjentów z opryszczkowym zapaleniem skóry oraz pacjentów nie cierpiących na celiakię badano z użyciem badania przesiewowego QUANTA Lite h-ttg. Poniżej podano podsumowanie dla określonych klinicznie próbek i próbek z zakresu normalnego przedstawionych powyżej. Grupa pacjentów # Pozytywne h-ttg % Nieleczona celiakia % Niedobór przeciwciał IgA w celiakii % Celiakia na diecie bezglutenowej % krewni 1. stopnia % Opryszczkowe zapalenie skóry % Kontrole choroby % Normalne * 2.4% *1 z 10 pozytywnych został stwierdzony jako pozytywny w ramach indywidualnych badań h-ttg ELISA oraz pozytywny dla w ramach fazy płynnej RIA. Wyniki badania przesiewowego h-ttg ELISA wykrywanie celiakii: Badanie przesiewowe QUANTA Lite h-ttg Pozytywna (nieleczona celiakia i niedobór IgA) Diagnoza* Negatywny (krewni 1. stopnia, kontrole chorych i kontrole zdrowych) Łącznie Pozytywna Negatywny Łącznie *Nie obejmuje 33 pacjentów z celiakią na diecie bezglutenowej. Czułość: 87,8% (36/41), przedział ufności 95%: od 73,8% do 95,9% Swoistość: 97,1% (462/476); przedział ufności 95% (CI): od 95,1% do 98,4% Czułość całkowita czułość w przypadku celiakii jest obliczana przez zgrupowanie wyników dla wszystkich pacjentów celiakii oprócz tych, którzy obecnie już są na diecie bezglutenowej. Całkowita liczba chorych na celiakię lub opryszczkowe zapalenie skóry wynosi 41, z czego 36 lub 87,8% ma wyniki pozytywne. Swoistość swoistość może być obliczona przez zgrupowanie wyników 414 normalnych pacjentów, 44 kontroli choroby oraz 18 krewnych pierwszego stopnia. Ta grupa liczy łącznie 476 próbek. Z nich tylko 14 próbek było pozytywnych, dając swoistość wynoszącą 97,1%. Reaktywność krzyżowa W celu oceny potencjalnych problemów związanych z reaktywnością krzyżową z innymi autoprzeciwciałami, za pomocą zestawu QUANTA Lite badania przesiewowego h-ttg oznaczono szereg próbek o wysokim mianie autoprzeciwciał. Ogółem, przeprowadzono badania dla 44 próbek. Wiele próbek stanowiło wysoko pozytywną kontrolę z innych zestawów testowych autoprzeciwciał INOVA QUANTA Lite. Swoistości obejmowały chromatynę (4), centromer (4), GBM (4), SS-B (4), RNP (5), Scl-70 (6), Jo-1 (5), Sm (4), SS-A (4) oraz TPO (4). Średnia wartość dla tych 44 próbek wyniosła 5,27 jednostek. Wszystkie próbki były negatywne w teście QUANTA Lite badania przesiewowego h-ttg. Średnia wartość wynosi 4,6 standardowych odchyleń poniżej 20-jednostkowej wartości granicznej. Precyzja w ramach laboratorium Wydajność w obrębie badania dla testu ELISA QUANTA Lite TM badania przesiewowego h-ttg oceniano, testując 9 próbek po 5 razy każdą. Ten test był przeprowadzony przez pojedynczego operatora w INOVA Diagnostics przy użyci jednej partii zestawu.wyniki przedstawiono poniżej. Wydajność w obrębie badania testu ELISA QUANTA Lite TM badania przesiewowego h-ttg Jednostki średnie SD CV % Zmienność pomiędzy badaniami oceniono, przeprowadzając dwukrotnie badanie panelu 12 próbek 6 razy w ciągu 5 dni. Ten test był przeprowadzony przez pojedynczego operatora w INOVA Diagnostics przy użyci 6

7 jednej partii zestawu. Podsumowanie tych wyników przedstawiono poniżej. Wydajność w pomiędzy badaniami testu ELISA QUANTA Lite badania przesiewowego h-ttg Jednostki średnie SD CV % Zmienność pomiędzy seriami Sprawdzanie zmienności pomiędzy serami zostało przeprowadzone w INOVA Diagnostics przez dwóch różnych operatorów przy użyciu trzech różnych serii zestawów w ciągu trzech różnych dni. Podsumowanie tych wyników przedstawiono poniżej. Próbka Seria 1 Seria 2 Seria 3 Jednostki średnie Std. odchyl. CV % Wysoka pozytywna kontrola Pozytywne Pozytywne Pozytywne Pozytywne Pozytywne Pozytywne Pozytywne Pozytywne Pusty odczynnik Negatywna kontrola Negatywne Negatywne Negatywne Negatywne Piśmiennictwo 1. Trier JS: Celiac Sprue. New England Journal of Medicine 325: , Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: , McMillan SA, Haughton DJ, et al.: Predictive value for celiac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: , Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. Journal of Internal Medicine 241: , Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for celiac disease. Arch Dis Child 66: , Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of celiac disease. Arch Dis Child 65: , Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, et al.: Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Medicine 3: , Sollid LM, Molberg O, McAdam S, Lundin K, et al.: Autoantibodies in celiac disease: tissue transglutaminase guilt by association? Gut 41: , Beutner EH, et al. A case of dermatitis herpetiformis with IgA endomysial antibodies but negative direct immunofluorescent findings. J Am Acad Dermatol 43: 329, Sardy M, et al.: Recombinant human tissue transglutaminase ELISA for the diagnosis of gluten-sensitive enteropathy. Clin Chem 45: 2142, Sblattero D, et al.: Human recombinant tissue transglutaminase ELISA : an innovative diagnostic assay for celiac disease. Am J Gastroenterology 95: 1253, Sugai E, et al.: Tissue transglutaminase antibodies in celiac disease: assessment of a commercial kit. Am J Gastro 95: , Lampasona V, et al.: Tissue transglutaminase and combined screening for celiac disease and type 1 diabetes-associated autoantibodies. Lancet 352: , Hansson T, et al.: Antibody reactivity against human and guinea pig tissue transglutaminase in children with celiac disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 30: 379, Andersson AS, et al.: Inhibition of endomysial staining with human tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, Axiö-Frekricksson UB, et al.: Differences in human and guinea pig tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, Signorini M, et al.: Human erythrocyte transglutaminase: Purification and preliminary characterization. Biological Chemistry 369: 275, Stober W: Gluten-sensitive enterophy: A nonallergic immune hypersensitivity of the gastrointestional tract. J. Allergy Clin. Immunol. July , Smecuol E, et al.: Permeability, Zonulin Production, and Enteropathy in Dermatitis Herpetiformis. Clinical Gastroenterology and Hepatology 3: , Beutner EH, et al.: Sensitivity and Specificity of IgA-class antiendomysial antibodies for dermatitis herpetiformis and findings relevant to their pathogenic significance. Journal of the American Academy of Dermatology 15: , Porter WM, et al.: Tissue Transglutaminase Antibodies in Dermatitis Herpetiformis Correspondence. Gastroenterology 117: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition,

8 23. CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38), CLSI (NCCLS). Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures: Principles and Definitions; Approved Guideline- 3rd edition NCCLS Document C24-A3, Vol. 26(25),

9 QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Marzec 2011 Wersja 0 9