E.coli Transformer Kit

Transkrypt

1 E.coli Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli. Metoda chemiczna. wersja x 40 transformacji Nr kat Zestaw zawiera komplet odczynników do przeprowadzenia sześciu preparatyk komórek kompetentnych. Każda z preparatyk wystarcza na przeprowadzenie czterdziestu transformacji. Produkt przeznaczony wyłącznie do badań naukowych. 1

2 Skład zestawu Składnik Ilość Temp. Przechowywania Roztwór S1 15 ml +4 do +8 ºC Roztwór S2 15 ml +4 do +8 ºC Zestaw był testowany na pochodnych szczepów Escherichia coli: B, K-12. Firma A&A Biotechnology udziela rocznej gwarancji na niniejszy zestaw. Firma nie gwarantuje poprawnego działania zestawu w wypadku: odstępstwa od dostarczonego wraz z zestawem protokołu braku zalecanego w niniejszym protokole wyposażenia i materiałów użycia innych odczynników niż zalecane lub które nie wchodzą w skład zestawu użycia przeterminowanych lub niewłaściwie przechowywanych odczynników 2

3 Przygotowanie komórek kompetentnych Wyposażenie i materiały niezbędne do przygotowania komórek kompetentnych nie wchodzące w skład zestawu wytrząsarka 37 ºC jałowa pożywka LB Miller (LB) (nr kat , ) jałowe pożywka LB Agar Miller (LA) (nr kat , ) jałowe probówki o poj. 50 ml typu Falcon wirówka z rotorem do wirowania probówek o poj. 50 ml typu Falcon sterylne probówki o poj. 1,5 ml typu Eppendorf szczep Escherichia coli Przed przystąpieniem do protokołu Bakterie Escherichia coli należy przesiać redukcyjnie na płytkę z podłożem LA. Płytkę inkubować przez noc w temp. 37 ºC. Roztwory S1 i S2 należy schłodzić w lodzie. Protokół przygotowania komórek kompetentnych 1. W 10 ml pożywki LB (w razie konieczności z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku) zaszczepić pojedynczą kolonię E.coli uzyskaną z posiewu redukcyjnego. Inkubować hodowlę w wytrząsarce przez noc w temp. 37 ºC. 2. Do 100 ml świeżej pożywki LB (w razie konieczności z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku) dodać 1 ml hodowli nocnej. 3. Inkubować w wytrząsarce przez 2-3 godz. przy RPM w temp. 37 ºC, do uzyskania OD600=0,3-0,5, kiedy to bakterie osiągną fazę logarytmicznego wzrostu. 4. Po osiągnięciu odpowiedniego OD600 hodowlę przez 15 min chłodzić w lodzie. 5. Odwirować hodowlę przez 5 min przy 3500 RPM (~1500 x g) w wirówce z rotorem schłodzonym do temp. +4 ºC. Jeżeli supernatant nie jest klarowny, zwiększyć prędkość wirowania do 3000 x g i wydłużyć czas wirowania do 10 min. 6. Zlać supernatant. 3

4 7. Osad delikatnie zawiesić w 2 ml roztworu S1. Roztwór S1 należy uprzednio schłodzić w lodzie. 8. Ostrożnie dodać po 2 ml roztworu S2 i delikatnie wymieszać. 9. Mieszaninę chłodzić w lodzie przez 15 min. 10. Rozporcjować zawiesinę komórek kompetentnych po 100 μl do jałowych probówek o poj. 1,5 ml typu Eppendorf. Na jedną transformację należy używać 100 μl komórek kompetentnych. NIe zaleca się wielokrotnego zamrażania/rozmrażania komórek kompetentnych. 11. Tak przygotowane komórki kompetentne można użyć bezpośrednio do transformacji (patrz strona 5) lub zamrozić w -80 ºC, w celu późniejszego użycia. Bardzo ważne jest, aby komórki kompetentne zamrażać powoli. Nie wolno zamrażać komórek w ciekłym azocie. Zaleca się przechowywanie komórek kompetentnych w pudełku styropianowym, w temp. -80 ºC. 4

5 Transformacja komórek kompetentnych Wyposażenie i materiały niezbędne do transformacji komórek kompetentnych nie wchodzące w skład zestawu termoblok 37 ºC jałowa pożywka LB Miller (LB) (nr kat , ) płytki z podłożem selekcyjnym - 1 płytka na 1 transformację jałowe probówki o poj. 50 ml typu Falcon wirówka z rotorem do wirowania probówek o poj. 50 ml typu Falcon Przed przystąpieniem do protokołu Przygotować odpowiednią liczbę płytek z podłożem selekcyjnym. Przed przystąpieniem do transformacji podłoża powinny mieć temp. pokojową. Zaleca się przygotowanie dodatkowej płytki z podłożem selekcyjnym dla kontroli negatywnej transformacji. Protokół 1. Do każdej transformacji użyć 100 μl komórek kompetentnych E.coli, rozmrożonych w lodzie lub świeżo przygotowanych i schłodzonych w lodzie. 2. Do komórek kompetentnych dodać plazmidowego DNA lub mieszaniny ligacyjnej i delikatnie wymieszać. Objętość DNA / mieszaniny ligacyjnej nie powinna być większa niż 20 μl. 3. Mieszaninę DNA i komórek kompetentnych chłodzić w lodzie przez min. Podczas inkubacji w lodzie nie należy potrząsać probówką z mieszaniną ani jej mieszać, ponieważ wpływa to na obniżenie efektywności transformacji. Dłuższy czas inkubacji polepsza efektywność transformacji. 4. Inkubować przez 10 min w temp. 37 ºC. Można to zrobić również w łaźni ultradźwiękowej. Wówczas mieszaninę wstawiamy na 5-10 s do włączonej łaźni (w temp. pokojowej). 5. Mieszaninę transformacyjną przez 2 min chłodzić w lodzie. Jeśli transformowany jest plazmid z opornością na ampicylinę, przejść do pkt. 7. 5

6 6. Jeśli transformowany jest plazmid bez oporności na ampicylinę (lub z opornością na inny antybiotyk): - do mieszaniny należy dodać 1 ml podgrzanej do temp. 37 ºC pożywki LB bez antybiotyku. - inkubować hodowlę przez 45 min z wytrząsaniem przy 220 RPM w temp. 37 ºC w celu ekspresji genów odpowiedzialnych za oporność na antybiotyk. 7. Wysiać po μl mieszaniny transformacyjnej na płytkę z podłożem selekcyjnym. 8. Płytki inkubować przez noc w temp. 37 ºC. Średnia wydajność transformacji komórek E.coli TOP10F plazmidem puc19 wynosi CFU. 6

7 Pożywki LB Agar Miller (LA) (nr kat , ) Przygotowanie 1000 ml pożywki: 1. Do odpowiedniego naczynia odważyć 40 g podłoża. 2. Uzupełnić do 1000 ml jałową wodą i wymieszać. 3. Zawiesinę autoklawować przez min w temp. 121 ºC. 4. Po schłodzeniu do temp ºC ponownie wymieszać przed użyciem. Po rozpuszczeniu i autoklawowaniu, końcowe ph=7,0 w temp. 25 ºC. LB Miller (LB) (nr kat , ) Przygotowanie 1000 ml pożywki: 1. Do odpowiedniego naczynia odważyć 25 g podłoża. 2. Uzupełnić do 1000 ml jałową wodą i wymieszać. 3. Zawiesinę autoklawować przez min w temp. 121 ºC. 4. Po schłodzeniu do temp ºC ponownie wymieszać przed użyciem. Po rozpuszczeniu i autoklawowaniu, końcowe ph=7,0 w temp. 25 ºC. 7

8 Produkty powiązane Składniki i gotowe podłoża Ilość Nr kat. LB Agar Miller (LA) LB Miller (LB) 250 g g g g g Agar 500 g g g YPD 500 g g g YPDA 500 g g Ampicylina 5 g Informacje bezpieczeństwa UWAGA S1, S2 roztwór H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. P305+P351+P338 W przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. 8