pomiary stałych sprzężenia

pomiary stałych sprzężenia ważne parametry zależność Karplusa resztkowe sprzężenia dipolowe trudności eksperymentalne rozdzielczość błędy systematyczne

nakładanie się składowych widma w fazie zaniżenie sprzężenia widma w antyfazie - zawyżenie

efekty relaksacyjne szybka relaksacja podłużna sprzężonego jądra zaniżenie obserwowanej stałej J obs =J(1-2 ) ½ =Dr/2pJ Dr różnica prędkości relaksacji poprzecznej koherencji w fazie i antyfazie ~ prędkość relaksacji podłużnej sprzeżonego jądra podobny efekty wymiana chemiczna efekty analogiczne do celowego odprzęgania spinów efekty interferencyjne także zaniżają obserwowalne sprzężenia

metody eksperymentalne analiza kształtu sygnału duża liczba parametrów trudności z oddaniem właściwego kształtu krzywa Lorentza (L) i Gaussa (G) różne widoczne rozszczepienia dla tej samej stałej

pomiary w funkcji czasu a) y I(T) = I0cos( pjt)exp(-t/t 2) 1 H D 2 D 2 t 2 b) 15 N z-gradients 1 H t 1 j 1 j 2 t D 2 G 1 y D D 2 2 T CPD t 2 V 2.0 1.0 0.0 Tyr2 7.75 +/- 0.05 Hz Phe3 7.26 +/- 0.05 Hz Gln4 5.23 +/- 0.05 Hz Asn5 8.14 +/- 0.05 Hz Cys6 7.26 +/- 0.05 Hz Arg8 6.87 +/- 0.05 Hz 15 N z-gradients t 1 T j 1 j 2 t D G 1 CPD -1.0-2.0 0.0 0.1 0.2 0.3 t/s 3 Pomiary stałych J(HN-H a) w peptydach [Billeter et al., J.Biomol. NMR, 2, 257 (1992)] Intensywność sygnału: W. Koźmiński, JMR, 141, 185 (1999) I(T) = I cos( p 0 JT)exp(-T/T 2)

E.COSY jądra A i B aktywne, C pasywne uproszczony sygnał korelacyjny podobny efekt gdy C jest jadrem innego rodzaju i jego stan spinowy nie zmienia się w trakcie eksperymentu

względne znaki stałych sprzężenia

technika ACT (Active Coupling Tilting) W. Koźmiński, D. Nanz, J. Magn. Reson., 124, 383 (1997) dodawanie widm w fazie i atyfazie w dwóch wymiarach skalowanie obserwowalnego rozszczepienia

przeniesienie polaryzacji przez jedno wiązanie + TOCSY przeniesienie polaryzacji przez wiele wiązań

selektywna obserwacja składowych multipletów sygnały czerwone i czarne z widm zarejestrowanych osobno brak nakładania F 1 ( 15 N) W. Koźmiński, J. Magn. Reson, 137, 408 (1999)

Kwadratura w pośrednio próbkowanych wymiarach czasu przypadek 1) modulacja amplitudowa j x t x dwa eksperymenty na każdy krok czasu ewolucji t x modulacja: 1 j = x cos(wt x ) część rzeczywista 2 j = y sin(wt x ) część urojona tzw. metoda States a: D.J. States et al., J. Magn. Reson., 48, 286 (1982) States TPPI odwrócenie fazy j i odbiornika dla parzystych inkrementów t x przesunięcie pików aksjalnych na skraj widma D.J. Marion et al., J. Magn. Reson., 85, 393 (1989)

Kwadratura w pośrednio próbkowanych wymiarach czasu przypadek 2) modulacja fazowa t x PFG G 1 G 2 najczęściej eksperymenty z zastosowaniem selekcji koherencji z użyciem PG dwa eksperymenty na każdy krok t x : 1 G 1 = (g 2 /g 1 )G 2 cos(wt x ) i sin(wt x ) echo 2 G 1 = - (g2/g1)g 2 cos(wtx) + i sin(wt x ) antyecho konieczna rekombinacja danych

Kwadratura w pośrednio próbkowanych wymiarach czasu przypadek 2) modulacja fazowa t x PFG G 1 G 2 rekombinacja danych: 1 G 1 = (g 2 /g 1 )G 2 cos(wt x ) i sin(wt x ) echo 2 G 1 = - (g2/g1)g 2 cos(wtx) + i sin(wt x ) antyecho 1 echo + antyecho = cos(wt x ) część rzeczywista 2 echo - antyecho = sin(wt x ) część urojona korekta fazy dla 2

W modulacja amplitudowa w 2 - W S 0 w 1 W S exp. 1 cos(wt 1 ) W I W I R(t 1 ) I(t 1 ) w 2 exp. 2 sin(wt 1 ) w 1 W S

modulacja fazowa exp. 1 - echo cos(wt 1 ) - sin(wt 1 ) exp. 2 - antyecho cos(wt 1 ) + sin(wt 1 ) w 2 - W S 0 w 1 W S W I W I dla antyecha przeciwny znak częstości, nie absorbcyjny kształt linii

rekombinacja danych R 1 (t 2 ) + R 2 (t 2 ) cos(wt 1 ) I 2 (t 2 ) I 1 (t 2 ) sin(wt 1 ) odtworzona modulacja amplitudowa w 2 - W S 0 w 1 W S W I W I R(t 1 ) I(t 1 )

Czas pomiaru i czułość w widmach wielowymiarowych ograniczenie próbką: - stężenie, g, B 0, T, własności relaksacyjne ograniczenie próbkowaniem: liczba punktów (czas pomiaru) rośnie wykładniczo z liczbą wymiarów sekwencja N-wymiarowa exc t i mix i t N N 1 dla k i punktów w t i : k 1 k 2... k N-1 2 N-1 pomiarów 1D

Nowe podejścia Reduced Dimensionality ND 2D z wielokrotną kwadraturą (próbkowanie radialne): Koźmiński & Zhukov, J. Biomol. NMR, 26, 157 (2003) Kim & Szyperski, JACS, 125, 1385 (2003) jednoprzebiegowa rejestracja widm 2D (EPI) Frydman, Scherf & Lupulescu, PNAS, 99, 15858 (2002) Pelupessy, JACS, 125, 12345 (2003) rekonstrukcja widm wielowymiarowych z projekcji (próbkowanie radialne) : Kupče & Freeman, J. Biomol. NMR, 27, 383 (2003 statystyczne metody rekonstrukcji widm wielowymiarowych z oszczędnym próbkowaniem przestrzeni czasu wielowymiarowa transformata Fouriera Kazimierczuk, Koźmiński & Zhukov, J. Magn. Reson. 179, 323-328 (2006)

Próbkowanie przestrzeni czasu konwencjonalne radialne Accordion Spectroscopy t 1 t 1 t 2 t 2

Accordion Spectroscopy G. Bodenhausen and R.R. Ernst, J. Magn. Reson., 45, 367 (1981). jednoczesna zmiana dwóch (lub więcej) czasów oryginalne zastosowanie eksperymenty wymienne t mix = kt 1 szybkość wymiany zakodowana w kształcie sygnałów

Accordion spectroscopy jednoczesne próbkowanie częstości i sprzężeń skalowanie względnych rozszczepień Koźmiński, Sperandio & Nanz, Magn. Reson. Chem., 34, 311 (1996) Koźmiński & Nanz, J. Magn. Res., 124, 383 (1997)

Jednoczesne próbkowanie kilku czasów ewolucji Reduced Dimensionality próbkowanie radialne widmo projekcyjne z liniową kombinacją częstości obecnych w t 1 i t 2 t 1 t 2

Oryginalna implementacja Reduced Dimensionality n przesunięć chemicznych zakodowanych w (n - 1) wymiarów T. Szyperski, et al, J. Am. Chem. Soc., 115, 9307 (1993) jednocześnie próbkowana ewolucja jąder A i B 2n B F 1 d(a) n A + n A n A - n B n B Wady: znak częstości wyznaczony tylko dla jednego jądra podwojona liczba sygnałów podwojony zakres częstości dla B (by uniknąć niejednoznaczności).

Widma o zredukowanej wymiarowości z pełną informacja o znakach częstości Koźmiński & Zhukov, J. Biomol. NMR, 26, 157 (2003) próbkowanie każdego czasu ewolucji wymaga rejestracji dwóch interferogramów o modulacjach sin i cos tak jest we wszystkich eksperymentach wielowymiarowych!! 2 n zbiorów danych dla n częstości na każdy punkt przestrzeni czasu) konwersja modulacji fazowej na amplitudową n = 1 liczba zbiorów danych = 2 cos(w A t 1 ) sin(w A t 1 ) n = 2 liczba zbiorów danych = 4 cos(w A t 1 ) cos(w A t 1 ) sin(w A t 1 ) cos(w A t 1 ) cos(w A t 1 ) sin(w A t 1 ) sin(w A t 1 ) sin(w A t 1 ) w ND widmie zredukowanym do 2D N-1 czasów próbkowanych jednocześnie 2 N-1 zbiorów danych po 1D FT 2 N-2 niezależnych równań liniowych : ±W 1 ± W 2 ±... ± W N-1 nadmiar informacji dla N>3 (8 równań dla 3 częstości)

przykład: jednoczesne próbkowanie częstości A i B z modulacją fazową i amplitudową echo antiecho echo antiecho - W A 0 W A 2W B 2W B w 1 W I W I w 2 cos(w A t 1 ) sin(w A t 1 ) cos(w A t 1 ) sin(w A t 1 ) cos(w B t 1 ) sin(w B t 1 ) - W A 0 W A 2W B 2W B W I W I 0 W A - W B W A + W B W I

zastosowania 2D 3D i-1 i HNCA 3D : H N i (t 3 ) N i (t 1 ) Ca i, Ca i-1 (t 2 ) 2D : H N i (t 2 ) N i (t 1 ) Ca i, Ca i-1 (t 1 ) HN(CO)CA 3D : H N i (t 3 ) N i (t 1 ) CO Ca i-1 (t 2 ) 2D : H N i (t 2 ) N i (t 1 ) CO Ca i-1 (t 1 )

HSQC HN(CO)CA single quadrature HN(CO)CA double quadrature

HN(CO)CA HNCA

N C ++ + - ++ + - HN(CO)CA HNCA N C ++ + - ++ + -

4D 2D HACANH j 1 = x/y, j 2 = x/y, (G 1,y)/(-G 1,-y)

HACANH [H ( i), H (i-1) C (i), C (i-1) N(i)] ( t ) H (i) ( t ) a a a a 1 N 2 +++ + + + ++

Ca sprzężone widma DQ/ZQ HNCO W. Koźmiński, I. Zhukov, M. Pecul, J. Sadlej J. Biomol NMR, 31, 87 (2005) - prostota - w widmie dwukwantowym 1 J(C,Ca) + 2 J(N,Ca) - w widmie zerokwantowym 1 J(C,Ca) - 2 J(N,Ca) - 1 J(C,Ca) ca. 50 Hz, 2 J(N,Ca) 5-10 Hz - zmniejszenie błędów systematycznych w pomiarach stałych sprzężenia

widma ubikwityny znaczonej 13 C, 15 N 1 J(C,Ca) - 2 J(N,Ca) 1 J(C,Ca) + 2 J(N,Ca)

porównanie z wynikami obliczeń

Kiedy zawodzi technika zredukowanej wymiarowości?

Rekonstrukcja z projekcji częstości w widmach 2D z próbkowaniem czasu wzdłuż r pod kątem j : w 2 cos(j) + w 1 sin(j) Efekt: projekcja widma 3D na płaszczyznę nachyloną pod kątem j. konieczne jest wyznaczenie znaków wszystkich częstości t 1 r j t 2 oryginalny pomysł : Lauterbur, Nature, 242, 190 (1973)

Rekonstrukcja z projekcji Kupče & Freeman, J. Biomol. NMR, 27, 383 (2003) jeśli częstości F 3 nie są zdegenerowane wystarczą dwie płaszczyzny : F 1 F 3 i F 2 F 3 F 3 ( 1 H) w praktyce potrzeba wiele otrzymuje się prawdziwe widmo trójwymiarowe F 2 ( 15 N) F 1 F 3 t 2 =0 F 2 F 3 t 1 =0 F 1 ( 13 C)

kolejne projekcje pomagają usunąć niejednoznaczności F 3 ( 1 H) a F 2 ( 15 N) F 1 ( 13 C)

Kupče & Freeman, J. Biomol. NMR, 27, 383 (2003) 13 C, 15 N-ubikwityna dwie płaszczyzny rekonstrukcja konwencjonalne F 3 ( 1 H) =7.28 ppm F 3 ( 1 H) =8.31 ppm trzy płaszczyzny F 3 ( 1 H) =8.77 ppm

rekonstrukcja zaleta : prawdziwe widma wielowymiarowe wady: artefakty, które mogą tworzyć fałszywe sygnały zafałszowane kształty sygnałów zafałszowane stosunki intensywności wiele różnych podejść (deterministycznych i statystycznych) do rekonstrukcji widm jak dotąd żadna nie jest całkowicie wolna od wad i ogólna

Wielowymiarowa transformata Fouriera K. Kazimierczuk, W. Koźmiński, I. Zhukov, J. Magn. Reson. 179, 323-328 (2006) konwencjonalne widma wielowymiarowe: próbkowanie przestrzeni czasu na siatce prostokątnej wymagana jest duża liczba punktów (długi czas pomiaru) do osiągnięcia wysokiej rozdzielczości seria 1D FT (najczęściej korzystając z algorytmów FFT) f S t 2 ( = max 1 t1, w 2 f ( t1, t2 exp (- iw2t S( w = max 1, w2 S( t1, w2 exp (- iw1t 2 t2 = 0 t t1= 0 1 ( t, t S ( t, w S( w w 1 2 1 1 2 1, 2

Wielowymiarowa transformata Fouriera możliwa jest transformata wielowymiarowa obliczana w jednym kroku dla kilku częstości, np. dla dwóch wymiarów: S t 1 ( = max 2 max w, w exp (- iw t f ( t, t ) (- jw t 1 2 1 1 1 2 exp t = 0 t = 0 1 t 2 gdzie: i 2 = j 2 = k 2 = -1 and ij = -ji = k, jk = -kj = i, ki = -ik = j próbkowanie przestrzeni czasu może być dowolne! 2 2

Wielowymiarowa transformata Fouriera w praktyce dla zachowania informacji o znakach trzeba zarejestrować i transformaty czterech zbiorów danych:

Kwadratura :

Próbkowanie radialne i spiralne t 1 r j t 1 0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 t 2 0 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 t 2 K. Kazimierczuk, W. Koźmiński, I. Zhukov, J. Magn. Reson. 179, 323-328 (2006).

próbkowanie radialne i spiralne 400 MHz HNCO dla ubikwityny w 3 ( 1 H) =8.77 ppm konwencjonalne 10.5 h radialne (trzy promienie po 240 punktów) 1.5 h spiralne (160 punktów) - 1h K. Kazimierczuk, W. Koźmiński, I. Zhukov, J. Magn. Reson. 179, 323-328 (2006).

artefakty x5 radialne niejednoznaczność: w 1 cos(f ± w 2 sin(f = const spiralne regularne próbkowanie regularne artefakty Czemu nie próbkować losowo?

dlaczego Dt ma być stałe? ruch regulowany przypadkowy Przypadkowość może poprawić efektywność!

próbkowanie losowe może być używane do analizy sygnałów 1D o wielkiej częstotliwości za dużej do próbkowania ze stałym krokiem sygnały GHz Tarczynski and Allay, IEEE Trans Signal Processing 52, 3324 (2004).

Próbkowanie losowe: różne liczby punktów w czasie 1s 64 128 256 częstotliwość Nyquista 512 1024 regularne losowe nie ma zawijania!

Wielowymiarowa transformata Fouriera dowolne próbkowanie przestrzeni czasu próbkowanie radialne artefakty podobne jak dla rekonstrukcji z projekcji próbkowanie spiralne lepszy rozkład punktów czasu znacznie lepsze widmo próbkowanie losowe widma o wysokiej rozdzielczości bez artefaktów

Wielowymiarowa transformata Fouriera transformacja symulowanych widm 2D, jednakowa liczba (512) punktów czasu:

porównanie przekrojów przez widmo 3D HNCA próbkowanie konwencjonalne próbkowanie losowe

porównanie przekrojów przez widmo 3D NOESY- [ 1 H, 15 N]-HSQC próbkowanie konwencjonalne próbkowanie losowe

3D eksperymenty dla molekuł organicznych 3D TOCSY-HSQC 3D Heteronuclear Single Quantum Multiple Bond Correlation (HSQMBC) 3D COSY HMBC Misiak & Koźmiński, Magn. Res. Chem., 2007

3D TOCSY- HSQC 20 mm strychnina ten sam czas pomiaru próbkowanie tradycyjne F 2 ( 13 C) = 26.8 ppm próbkowanie losowe Misiak & Koźmiński, Magn. Res. Chem., praca w druku

3D COSY- HMBC of 20 mm strychnina F 3 ( 1 H) = 3.90 ppm próbkowanie tradycyjne próbkowanie losowe

metoda uniwersalna - NMR i MRI brak założeń maksymalna możliwa rozdzielczość na jednostkę czasu pomiaru