SPEKTROSKOPIA NMR PODEJŚCIE PRAKTYCZNE DR INŻ. TOMASZ LASKOWSKI CZĘŚĆ: IV. mgr inż. Marcin Płosiński

Transkrypt

1 SPEKTROSKOPIA NMR PODEJŚIE PRAKTYZNE ZĘŚĆ: IV DR INŻ. TOMASZ LASKOWSKI mgr inż. Marcin Płosiński

2 PROLOGOS: ODSPRZĘGANIE SPINÓW (DEOUPLING)

3 ODSPRZĘGANIE SPINÓW Eliminacja zjawiska sprzężenia spinowo-spinowego występującego pomiędzy wybranym protonem a jego sąsiadami poprzez selektywne naświetlanie tego protonu. Naświetlanie napromieniowywanie próbki falą elektromagnetyczną o częstotliwości rezonansowej wybranego protonu przed rejestracją widma. W efekcie: 1) sygnał rezonansowy protonu naświetlonego nie pojawia się w widmie; 2) w multipletowości dotychczasowych partnerów sprzężenia naświetlonego protonu nie jest zawarta informacja o sprzężeniu z naświetlonym protonem.

4 ODSPRZĘGANIE SPINÓW 3 A A B D D O B ppm B D ppm

5 ODSPRZĘGANIE SPINÓW 3 A A B D D O B A ppm D ppm

6 ODSPRZĘGANIE SPINÓW 3 A A B D D O B A ppm B D ppm

7 ODSPRZĘGANIE SPINÓW 3 A A B D D O B A ppm B ppm

8 ODSPRZĘGANIE SPINÓW ZALETY 1. Decoupling zwalnia z obowiązku określania multipletowości wszystkich sygnałów rezonansowych. 2. Ustalanie sekwencji sprzężeń nie wymaga pomiarów stałych sprzężenia. WADY 1. Ustalenie sekwencji sprzężeń wymaga przeprowadzenia kilku eksperymentów. 2. Może zostać przeprowadzone jedynie na protonach znacznie różniących się przesunięciem chemicznym.

9 EPEISODION I: SPINOWO-SPINOWE SPRZĘŻENIA OMOJĄDROWE w 2D OSY ORRELATED SPETROSOPY TOSY TOTAL ORRELATED SPETROSOPY

10 OSY widmo 1 F1 ( p pm ) sygnał autokorelacyjny diagonala sygnał korelacyjny (crosspeak) 3.0 oś wtórna (F1) F 2 ( p p m ) oś pierwotna (F2)

11 OSY B D A A F1 ( p pm ) B,A A D O B D B A,B F 2 ( p p m )

12 OSY B D A A F1 ( p pm ) B,A B, 3 A D O B D B ,B A,B F 2 ( p p m )

13 OSY B D A A F1 ( p pm ) 1.4 B,A B, A B,D D O B D B D,B,B A,B F 2 ( p p m )

14 OSY B D A A F1 ( p pm ) B,A B, D, A B,D D O B D B D,B,D,B A,B F 2 ( p p m )

15 OSY B D A A F1 ( p pm ) B,A B, D, A B,D D O B D B D,B,D,B A,B F 2 ( p p m )

16 OSY

17 OSY B D A A F1 ( p pm ) B,A B, D, A B,D D O B D B D,B,D,B A,B F 2 ( p p m )

18 OSY B D A A F1 ( p pm ) 1.4 B,A 1.6 NIEPRAWIDŁOWA OBRÓBKA WIDMA B, D, A B,D D O B D B D,B,D,B A,B F 2 ( p p m )

19 OSY B D A A F1 ( p pm ) B,A D,A,A INNY WARIANT OBRÓBKI B, D, A B,D D O B D B D,B,D,B A,B F 2 ( p p m )

20 OSY ZALETY 1. Bardzo mała różnica przesunięć chemicznych (nakładanie się) sygnałów rezonansowych oraz ich nieczytelna multipletowość nie przeszkadzają (za bardzo) w interpretacji wyników. 2. Do ustalenia sekwencji sprzężeń w danym układzie spinowym wystarcza przeprowadzenie jednego eksperymentu. 3. Stosunkowo łatwe (choć nie zawsze) w wykonaniu, obróbce i interpretacji. WADY 1. Interpretacja skomplikowanych widm OSY drastycznie zwiększa zapotrzebowanie mózgu na glukozę. 2. Niewielka rozdzielczość widm OSY konieczność stosowania odmian eksperymentu OSY (np. DQF-OSY) do badania bardziej złożonych układów.

21 OSY

22 TOSY

23 TOSY ZALETY 1. Duża ilość sygnałów korelacyjnych. 2. Możliwość szybkiego określenia przynależności protonów do poszczególnych układów spinowych. 3. Możliwość rozpoznania struktury układów spinowych na podstawie ilości sygnałów korelacyjnych bądź obecności sygnałów rezonansowych protonów charakterystycznych. WADY 1. Duża ilość sygnałów korelacyjnych.

24 OSY protony amidowe: 7-8 [ppm]; sprzężenie skalarne z α

25 TOSY protony amidowe: 7-8 [ppm]; sprzężenie skalarne z α

26 STASIMON I: SPINOWO-SPINOWE SPRZĘŻENIA ETEROJĄDROWE

27 SPRZĘŻENIE 1-19 F J,F = z 4 J,F = 4-5 z

28 SPRZĘŻENIE % 3 J, dublet % 1 J, 1 J, dublet dubletów widmo 1 NMR: linie satelitarne (sidebands) 1 J, = z δ [ppm] 0,5 % 99 % 0,5 %

29 SPEKTROSKOPIA 13 NMR 1 DEOUPLING; SPRZĘŻENIE 13-1 PRZEZ JEDNO WIĄZANIE 1 J, = z

30 SPEKTROSKOPIA 13 NMR SPRZĘŻENIE 13-1 PRZEZ WIELE WIĄZAŃ 2,3 J, = 0-60 z

31 SPEKTROSKOPIA 13 NMR DEPT (DISTORIONLESS ENANEMENT BY POLARIZATION TRANSFER) 3 2 X

32 SPEKTROSKOPIA 13 NMR δ [ppm] typ 2 50 sp 3 (alkanowy) sp 3 (-O), sp sp 3 (O--O) sp 2 (nie: =O) > 160 sp 2 (=O)

33 SPRZĘŻENIE F (IEKAWOSTKA!) WIDMO 13 NMR, 1 -DEOUPLING, BRAK 19 F-DEOUPLING =O

34 EPEISODION II: SPINOWO-SPINOWE SPRZĘŻENIA ETEROJĄDROWE w 2D SQ ETERONULEAR SINGLE-QUANTUM OERENE MB ETERONULEAR MULTIPLE BOND ORRELATION

35 SQ

36 SQ

37 MB 3,1 1,3 1,2

38 DYWAGAJE STRUKTURALNE KOMPLET EKSPERYMENTÓW gosy, gsq i gmb Ol 2? 2 2 1

39 DYWAGAJE STRUKTURALNE KOMPLET EKSPERYMENTÓW gosy, gsq i gmb ,6 5,6 gosy 2 1,2 4 3, , ,1

40 DYWAGAJE STRUKTURALNE KOMPLET EKSPERYMENTÓW gosy, gsq i gmb ,6 2 5/6 gsq 5/6,5/ ,3 4,4 2, ,

41 DYWAGAJE STRUKTURALNE KOMPLET EKSPERYMENTÓW gosy, gsq i gmb ,6 2 5/6 gmb 2 1, ,4 1 4,2 4,3 2,4 2, ?

42 SPEKTROSKOPIA 13 NMR δ [ppm] typ 2 50 sp 3 (alkanowy) sp 3 (-O), sp sp 3 (O--O) sp 2 (nie: =O) > 160 sp 2 (=O)

43 DYWAGAJE STRUKTURALNE KOMPLET EKSPERYMENTÓW gosy, gsq i gmb ,6S 2 5/6 gmb 2 1, ,4 1 4,2 4,3 2,4 2, ,8 5 3,

44 1-13 SQ, 1-13 MB ZALETY I ZASTOSOWANIE SQ pomocne przy rekonstrukcji izolowanych układów spinowych jąder 1 (bezlitośnie wskazuje diastereotopowe grupy 2 ) SQ pozwala na pełne przyporządkowanie sygnałów rezonansowych w widmie 13 NMR MB pozwala na płynne poruszanie się pomiędzy izolowanymi układami spinowymi jąder 1. WADY MB nie wszystkie teoretycznie możliwe sygnały korelacyjne pojawiają się w widmie. I BRAK NIE JEST DOWODEM NA NIEPOPRAWNOŚĆ ZAŁOŻONEJ STRUKTURY!

45 STASIMON II: DIPOLOWE SPRZĘŻENIA OMOJĄDROWE NOE NULEAR OVERAUSER EFFET

46 NULEAR OVERAUSER EFFET Jądrowy efekt Overhausera zjawisko wzmocnienia (bądź osłabienia) sygnału rezonansowego protonu, który znajduje się blisko w przestrzeni protonu naświetlanego. hv NOE δ [ppm] NOE δ [ppm] Zasięg efektu Overhausera: ok. 4-5 Å. Jego wystąpienie jest dowodem bliskości jąder w przestrzeni.

47 NULEAR OVERAUSER EFFET E stan równowagi B 0 B 1 0 δ 0 A Naświetlenie protonu A powoduje odejście od stanu równowagi i wysycenie jego spinu, tj. liczba jąder w stanie o niższej energii jest dokładnie równa liczbie jąder w stanie o wyższej energii. Sygnał protonu A znika z widma. δ A

48 NULEAR OVERAUSER EFFET E stan równowagi W 2 B 0 B 1 δ 0 A RELAKSAJA DWUKWANTOWA, W 2 efektywna w małych cząsteczkach droga relaksacji polegająca na powrocie populacji jąder naświetlanych ( A ) do stanu równowagi przy jednoczesnym ciągnięciu ze sobą (wymuszeniu zmiany orientacji) spinów jąder sąsiadujących ( O ), znajdujących się w stanie o wyższej energii.

49 NULEAR OVERAUSER EFFET E stan równowagi W 2 B 0 B 1 δ 0 A W wyniku powrotu populacji jąder A do stanu równowagi na drodze W 2 część jąder O przechodzi ze stanu o wyższej energii do stanu o niższej energii.

50 NULEAR OVERAUSER EFFET E stan równowagi W 2 B 0 B 1 0 A δ

51 NULEAR OVERAUSER EFFET E stan równowagi W 2 B 0 B 1 δ 0 A Następnie, proton A po raz kolejny ulega naświetleniu i następuje ponowne wysycenie populacji spinów tego jądra w próbce. Ponownie, liczba jąder A w stanie o niższej energii jest dokładnie równa liczbie jąder w stanie o wyższej energii.

52 NULEAR OVERAUSER EFFET E stan równowagi B 0 B 1 0 δ 0 A Wreszcie, następuje rejestracja widma 1D i obserwacja protonu O. Ponieważ w populacji istnieje teraz większa liczba spinów O w stanie o niższej energii niźli było ich przed naświetlaniem A, sygnał protonu O ma większą intensywność!!! OBSERWUJEMY DODATNI EFEKT OVERAUSERA. δ 0 δ widmo różnicowe A A

53 NULEAR OVERAUSER EFFET E stan równowagi W 0 B 0 B 1 δ 0 A RELAKSAJA ZEROKWANTOWA, W 0 efektywna w dużych cząsteczkach droga relaksacji polegająca na powrocie populacji jąder naświetlanych ( A ) do stanu równowagi przy jednoczesnym ciągnięciu ze sobą (wymuszeniu zmiany orientacji) spinów jąder sąsiadujących ( O ), znajdujących się w stanie o niższej energii.

54 NULEAR OVERAUSER EFFET E stan równowagi W 0 B 0 B 1 δ 0 A W wyniku powrotu populacji jąder A do stanu równowagi na drodze W 0 część jąder O przechodzi ze stanu o niższej energii do stanu o wyższej energii.

55 NULEAR OVERAUSER EFFET E stan równowagi W 0 B 0 B 1 0 A δ

56 NULEAR OVERAUSER EFFET E stan równowagi W 0 B 0 B 1 δ 0 A Następnie, proton A po raz kolejny ulega naświetleniu i następuje ponowne wysycenie populacji spinów tego jądra w próbce. Ponownie, liczba jąder A w stanie o niższej energii jest odkładnie równa liczbie jąder w stanie o wyższej energii.

57 NULEAR OVERAUSER EFFET E stan równowagi B 0 B 1 δ 0 A Wreszcie, następuje rejestracja widma 1D i obserwacja protonu O. Ponieważ w populacji istnieje teraz mniejsza liczba spinów O w stanie o niższej energii niźli było ich przed naświetlaniem A, sygnał protonu O ma mniejszą intensywność!!! OBSERWUJEMY UJEMNY EFEKT OVERAUSERA. δ 0 0 δ widmo różnicowe A A

58 NULEAR OVERAUSER EFFET AcO AcO OAc 1 5 O 2 NOE O 2'' 3 NOE O 1'' O 2' 1' 4' 3'

59 NULEAR OVERAUSER EFFET WYMIANA EMIZNA i-pro 2 O (t-buo) 3 SiS 2 N( 2 )N 2 widmo 1 NMR widmo NOE wymiana chemiczna: NOE < 0 (ujemne)

60 NULEAR OVERAUSER EFFET PODSUMOWANIE 1. Jeżeli jądra O oraz A sąsiadują ze sobą w przestrzeni, to zjawisko odpowiedzialne za wymuszenie zmiany orientacji spinu jądra sąsiadującego ( A ) w wyniku naświetlania jądra O nazywa się sprzężeniem dipolowym i stanowi podstawę fizyczną efektu Overhausera. 2. Ww. wymuszenie zmiany orientacji może nastąpić zgodnie z mechanizmem relaksacji dwukwantowej (W 2 ) lub zerokwantowej (W 0 ). 3. Dodatni efekt Overhausera (dodatnie NOE) obserwujemy dla małych cząsteczek (M < 1 kda), a konkretnie dla cząsteczek szybko obracających się w roztworach. Dla małych cząsteczek dominuje relaksacja W Ujemny efekt Overhausera (ujemne NOE) obserwujemy dla dużych cząsteczek (M > 2 kda), a konkretnie dla cząsteczek wolno obracających się w roztworach. Dla dużych cząsteczek dominuje relaksacja W Wymiana chemiczna protonów labilnych również generuje sygnały w widmach NOE. Są one zawsze ujemne. 6. Małe cząsteczki, które wolno obracają się w roztworach (np. w wyniku tworzenia agregatów), generują ujemne NOE.

61 EPEISODION III: DIPOLOWE SPRZĘŻENIA OMOJĄDROWE w 2D NOESY NULEAR OVERAUSER EFFET SPETROSOPY ROESY ROTATING-FRAME OVERAUSER EFFET SPETROSOPY

62 NOESY/ROESY PRZYKŁADOWE WIDMO 17 NOE NOE 20b 12 NOE

63 NOESY/ROESY ZASTOSOWANIE 1. Eksperymenty bardzo użyteczne w analizie konformacyjnej. 2. Wygodna metoda ustalania konfiguracji względnej centrów asymetrii, a niekiedy konfiguracji absolutnej. O O 3 O O NOE O O O 3 O O O NOE

64 NOESY/ROESY ZASTOSOWANIE 1. Eksperymenty bardzo użyteczne w analizie konformacyjnej. 2. Wygodna metoda ustalania konfiguracji względnej centrów asymetrii, a niekiedy konfiguracji absolutnej. 3. Wygodna metoda ustalania sekwencji aminokwasów w polipeptydach, a także sekwencji zasad w niewielkich odcinkach kwasów nukleinowych. NOE (słabe) NOE (silne)

65 NOESY/ROESY ZASTOSOWANIE 1. Eksperymenty bardzo użyteczne w analizie konformacyjnej. 2. Wygodna metoda ustalania konfiguracji względnej centrów asymetrii, a niekiedy konfiguracji absolutnej. 3. Wygodna metoda ustalania sekwencji aminokwasów w polipeptydach, a także sekwencji zasad w niewielkich odcinkach kwasów nukleinowych.

66 NOESY/ROESY ZASTOSOWANIE 1. Eksperymenty bardzo użyteczne w analizie konformacyjnej. 2. Wygodna metoda ustalania konfiguracji względnej centrów asymetrii, a niekiedy konfiguracji absolutnej. 3. Wygodna metoda ustalania sekwencji aminokwasów w polipeptydach, a także sekwencji zasad w niewielkich odcinkach kwasów nukleinowych. WADY 1. Nie wszystkie teoretycznie możliwe sygnały korelacyjne pojawiają się w widmie. I BRAK NIE JEST DOWODEM BRAKU BLISKOŚI JĄDER ATOMOWY W PRZESTRZENI!

67 NOESY/ROESY ZYM RÓŻNI SIĘ EKSPERYMENT ROESY OD NOESY? sygnał NOESY ROESY diagonala ujemny* ujemny małe cząsteczki dodatni dodatni średnie cząsteczki BRAK dodatni duże cząsteczki ujemny dodatni wymiana chemiczna ujemny ujemny * W rzeczywistości sygnały korelacyjne w widmach NOESY i ROESY mają fazy względne, ustalane względem diagonali. Powyższa tabela jest prawdziwa dla sytuacji, w której diagonala znajduje się w fazie ujemnej (co jest ustawiane domyślnie dla wszystkich eksperymentów).

68 NOESY/ROESY ZYM RÓŻNI SIĘ EKSPERYMENT ROESY OD NOESY? Eksperyment ROESY pozwala na obserwację korelacji w cząsteczkach o dowolnych masach, w przeciwieństwie do eksperymentu NOESY, który nie widzi cząsteczek o masach z zakresu 1 kda < M < 2 kda (relaksacja dwukwantowa konkuruje wtedy z relaksacją zerokwantową, co wygasza sygnał NOE). Wadą stosowania eksperymentu ROESY w każdej możliwej okazji jest jego mniejsza czułość dla dużych cząsteczek, co wymaga stosowania większych stężeń (co nie zawsze jest łatwe).

69 NOESY/ROESY POMIAR ODLEGŁOŚI MIĘDZYATOMOWY Dla krótkich czasów miksowania (τ m ) zależność intensywności NOE (I) od odległości między atomami (r) da się wyrazić wzorem: I = k r IS -6 Stałą k wyznacza się na podstawie wzorca.

70 STASIMON III: ZESTAWIENIE WIDM 2D

71 ZESTAWIENIE WIDM 2D eksperyment typ korelacji typ sprzężenia OSY homojądrowe skalarne* TOSY homojądrowe skalarne* SQ heterojądrowe skalarne* MB heterojądrowe skalarne* NOESY homojądrowe dipolowe** ROESY homojądrowe dipolowe** * skalarne = spinowo-spinowe; ** dipolowe = przez przestrzeń.

72 EKSODOS: ZAWIJANIE SYGNAŁÓW

73 ZAWIJANIE SYGNAŁÓW Szerokość okna spektralnego zakres częstotliwości, w którym wykonano pomiar. δ = 205,7 ppm ( 3 ) 2 =O, 13 NMR 3 =O Dl p p m Szerokość okna spektralnego = 200 ppm. zawinięty sygnał =O δ = 5,7 ppm p p m

74 ZAWIJANIE SYGNAŁÓW Szerokość okna spektralnego zakres częstotliwości, w którym wykonano pomiar. δ = 205,7 ppm ( 3 ) 2 =O, 13 NMR 3 =O Dl p p m Szerokość okna spektralnego = 190 ppm. zawinięty sygnał =O δ = 15,7 ppm p p m

75 ZAWIJANIE SYGNAŁÓW Szerokość okna spektralnego zakres częstotliwości, w którym wykonano pomiar. δ = 205,7 ppm ( 3 ) 2 =O, 13 NMR 3 =O Dl p p m Szerokość okna spektralnego = 150 ppm. zawinięty sygnał =O δ = 55,7 ppm p p m

76 ZAWIJANIE SYGNAŁÓW Szerokość okna spektralnego zakres częstotliwości, w którym wykonano pomiar. δ = 205,7 ppm ( 3 ) 2 =O, 13 NMR 3 =O Dl p p m Szerokość okna spektralnego = 120 ppm. brak sygnału =O p p m

77 ZAWIJANIE SYGNAŁÓW δ rzeczywiste = δ sygnału zawiniętego + szerokość okna spektralnego δ sygnału zawiniętego = δ rzeczywiste - szerokość okna spektralnego Uwaga: szerokości okna spektralnego nie należy utożsamiać z szerokością skali wydruku. Te dwie wielkości są sobie równe tylko wtedy, jeśli widmo zostało wydrukowane w całym zakresie pomiarowym.

78 DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ! (...i powodzenia na kolokwium)