Wyznaczanie struktury długich łańcuchów RNA za pomocą Jądrowego Rezonansu Magnetycznego. Marta Szachniuk Politechnika Poznańska

HTML
DOWNLOAD

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Wyznaczanie struktury długich łańcuchów RNA za pomocą Jądrowego Rezonansu Magnetycznego. Marta Szachniuk Politechnika Poznańska"

Bogusław Zalewski
9 lat temu
Przeglądów:

1 Wyznaczanie struktury długich łańcuchów RNA za pomocą Jądrowego Rezonansu Magnetycznego Marta Szachniuk Politechnika Poznańska

2 Plan prezentacji 1. Wprowadzenie do problematyki badań: cel i zasadność projektu. 2. Metodyka analizy strukturalnej z wykorzystaniem technik NMR. 3. Problem analizy długich łańcuchów RNA. 4. Zastosowanie znakowania deuterem w analizie strukturalnej długich łańcuchów RNA. 5. Przebieg obliczeń w projekcie CALPAS. 6. Techniczna strona projektu obliczeniowego.

Problem analizy długich łańcuchów RNA. 4.

3 Analiza strukturalna I rzędowa struktura RNA określa sekwencję reszt nukleotydowych w łańcuchu RNA. C G C G C G II rzędowa struktura RNA określa występowanie jedno- i dwuniciowych fragmentów RNA. Aranżacja fragmentów przedstawiona jest na płaszczyźnie. III rzędowa struktura RNA definiuje sposób ułożenia jedno- i dwuniciowych fragmentów RNA w przestrzeni. Jest zależna od: - oddziaływań elektrostatycznych, - oddziaływań van der Waalsa, - wiązań wodorowych, - oddziaływań warstwowych. Struktura trzeciorzędowa jednoznacznie określa pofałdowanie pierścienia rybozy, kąty torsyjne i sposób parowania się zasad.

III rzędowa struktura RNA definiuje sposób ułożenia jedno- i dwuniciowych fragmentów RNA w przestrzeni.

4 Przedmiot badań: III rzędowa struktura RNA TAR RNA trans-aktywatorowy fragment RNA (trans-activation-response region) o strukturze spinki (stem loop), z 6-nukleotydową pętlą aplikalną i 3-nukleotydowym wybrzuszeniem. Fragment struktury HIV TAR RNA ( Struktura typu spinka. TAR RNA Znajduje się na końcu 5' wszystkich transkrypcji wirusa HIV. Składa się z 59 reszt nukleotydowych. Odgrywa istotną rolę w procesie regulacji transkrypcji wirusów HIV poprzez mechanizm transaktywacji zależnej od białka Tat.

umaryland.edu). Struktura typu spinka. TAR RNA Znajduje się na końcu 5' wszystkich transkrypcji wirusa HIV.

5 Cel i uzasadnienie projektu Cel projektu Określenie minimalnego i optymalnego zbioru danych potrzebnych do wyznaczania struktur długich łańcuchów RNA. 1. W przypadku długich łańcuchów RNA, silne nakładanie się sygnałów rezonansowych Uzasadnienie powoduje utrudnienia w analizie strukturalnej. Szczególnie dotyczy to sygnałów 1 H. 2. Selektywne deuterowanie pozwala zredukować liczbę sygnałów 1 H NMR. 3. Selektywne deuterowanie nukleotydów jest bardzo kosztowne. 4. Chcemy zaplanować taki schemat deuterowania, który pozwoli otrzymać jak największą ilość informacji strukturalnych przy minimalnej liczbie podstawień.

Szczególnie dotyczy to sygnałów 1 H. 2. Selektywne deuterowanie pozwala zredukować liczbę sygnałów 1 H NMR. 3.

6 Metodyka NMR wyznaczania struktury 1. Przygotowanie próbki RNA do badań (synteza chemiczna, metody enzymatyczne). W przypadku selektywnego deuterowania będzie to zbiór próbek o różnych deuterowanych fragmentach badanego RNA. 2. Wykonanie zestawu widm NMR jedno- i wielowymiarowych dla każdej próbki RNA. 3. Identyfikacja sygnałów rezonansowych (określenie przesunięć chemicznych atomów). 4. Wyznaczenie więzów strukturalnych 5. Wygenerowanie rodziny struktur i ich analiza (wprowadzenie więzów do struktur początkowych, dynamika molekularna).

Wykonanie zestawu widm NMR jedno- i wielowymiarowych dla każdej próbki RNA. 3.

7 Widma NMR Widmo 2D NOESY dupleksu RNA z jednowymiarową projekcją. dupleks: GCAGA A GAGCG CGUCU CUCGC Sygnał korelacyjny tworzą dwa protony, których wzajemna odległość jest na ogół mniejsza niż 6 Å.

8 Identyfikacja sygnałów rezonansowych Widmo 2D NOESY r(cgcgcg) 2. a) Znamy strukturę pierwszorzędową analizowanego związku. b) Chcemy znaleźć przesunięcia chemiczne jąder 1 H (p.p.m.). c) Widmo 2D NOESY ilustruje sygnały generowane przez pary protonów. d) Przypisujemy sygnał do odpowiedniej pary protonów. Przypisanie sygnału: d1) Znalezienie ścieżki przekazywania magnetyzacji przez oddziaływania dipolowe H6/H8-H1' (ścieżka NOE). d2) Odwzorowanie ścieżki na strukturę pierwszorzędową związku. Fragment widma 2D NOESY.

d) Przypisujemy sygnał do odpowiedniej pary protonów.

9 Więzy strukturalne Dokładność określenia struktury związku na podstawie NMR zależy od pomiaru jak największej liczby więzów strukturalnych. Należą do nich: 1. jądrowy efekt Overhausera (NOE) daje informacje o odległości między protonami oddalonymi o mniej niż 5 Å, 1Å=1.0 * m 2. homo- i heterojądrowe sprzężenia skalarne związane z kątami torsyjnymi zależnością Karplusa 3. przesunięcia chemiczne 4. kąty torsyjne wyznaczane na podstawie wicynalnych stałych sprzężeń, przesunięć chemicznych, odległości NOE 5. orientacja wiązań chemicznych względem kierunku zewnętrznego pola magnetycznego na podstawie resztkowych sprzęzeń dipolowych 6. przesunięcie paramagnetyczne

homo- i heterojądrowe sprzężenia skalarne związane z kątami torsyjnymi zależnością Karplusa 3. przesunięcia chemiczne 4.

10 Sprzężenia skalarne Widmo DQF COSY dupleksu: GCAGA GCAGA A GAGCG CGUCU CUCGC Sprzężenia skalarne (J couplings) interakcje pojawiające się pomiędzy jądrami atomów oddalonych od siebie do 3 wiązań chemicznych. Oddziaływania między jądrami magnetycznymi są przenoszone przez elektrony wiązań chemicznych. Na podstawie struktury subtelnej sygnałów zmierzono stałe sprzężeń: 3 J H1 H2 A5 3.3 A6 3.3 G Istnieje zależność między stałą sprzężenia przez trzy wiązania a kątem torsyjnym i wyraża się ona równaniem Karplusa: lub JXY(φ) = a + bcos(φ) + ccos(2φ) JXY(φ) = Acos 2 (φ) + Bcos(φ) + Csin 2 (φ)

Oddziaływania między jądrami magnetycznymi są przenoszone przez elektrony wiązań chemicznych.

11 Kąty torsyjne W kwasach nukleinowych istotne są następujące kąty torsyjne (torsion angles): α, β, γ, δ, ε, ζ, χ, υ0, υ1, υ2, υ3, υ4. Kąty te określają strukturę trzeciorzędową. 1 e e32 3 e43 e23 Kąt torsyjny definiowany jest przez 4 atomy i wyraża się wzorem: θ=sign cos -1 (-[(e 12 x e 23 ) (e 43 x e 32 )]), dla - 0 gdzie sign jest znakiem wyrażenia: [-(e 12 x e 23 ) x (e 43 x e 32 )] e 23.

1 e12 4 2 e32 3 e43 e23 Kąt torsyjny definiowany jest przez 4 atomy i wyraża się wzorem: θ=sign cos

12 Problem analityczny: nachodzenie sygnałów Jednym z najtrudniejszych etapów przy rozwiązywaniu struktur RNA za pomocą jądrowego rezonansu magnetycznego jest identyfikacja i przypisanie sygnałów rezonansowych. Wynikiem zwiększenia długości analizowanego łańcucha jest duże zagęszczenie sygnałów na widmie. Duża liczba sygnałów w badanym regionie widma powoduje nakładanie się sygnałów i utrudnia znalezienie ścieżki przekazywania magnetyzacji (NOE), a zatem i właściwe przypisanie sygnałów.

Wynikiem zwiększenia długości analizowanego łańcucha jest duże zagęszczenie sygnałów na widmie.

13 Zastosowanie znakowania deuterem Deuter (D lub 2 1 H) Izotop wodoru o liczbie masowej 2 (jądro składa się z protonu i neutronu). Ma inne właściwości magnetyczne niż proton (inna częstotliwość rezonansowa). Zastąpienie protonu cięższym izotopem nie wpływa istotnie na strukturę elektronową stąd właściwości chemiczne są porównywalne. Deuterowanie Proces zamiany protonów na deuter w cząsteczkach związku. Cel deuterowania Zmiana właściwości magnetycznych związku. Maskowane protony przestają być widoczne na widmie. Zalety Zwiększenie czytelności widma. Umożliwienie przypisania sygnałów. Wady Niemożność zamaskowania wszystkich protonów. Wydłużenie czasów relaksacji T 1 i skrócenie T 2 w oknie protonowanym. Duży koszt metody.

Zastąpienie protonu cięższym izotopem nie wpływa istotnie na strukturę elektronową stąd właściwości chemiczne są porównywalne.

14 Problem analityczny: niekorzystna relaksacja Relaksacja jądrowa proces przechodzenia wzbudzonego układu fizycznego do stanu równowagi termodynamicznej. Spektrometr NMR Bruker Avance 600 ( 1. Próbka RNA umieszczana jest w silnym jednorodnym polu magnetycznym generowanym przez magnes. 2. Przyłożenie impulsu powoduje wytrącenie cząsteczki RNA ze stanu równowagowego. 3. Obserwujemy proces przechodzenia do stanu równowagi, który odbywa się w wyniku przekazywania energii przez cząsteczkę do otoczenia. Rejestrujemy sygnał NMR. 4. W wyniku deuterowania następuje skrócenie czasu relaksacji T 2, co powoduje: - poszerzenie sygnałów rezonansowych, } - zmniejszenie intensywności, zła jakość - nakładanie się sygnałów, widma - dłuższy czas wykonywania eksperymentu.

Obserwujemy proces przechodzenia do stanu równowagi, który odbywa się w wyniku przekazywania energii przez cząsteczkę do otoczenia. Rejestrujemy sygnał NMR. 4.

15 Obliczenia w projekcie CALPAS Przygotowanie struktury wejściowej (pdb). Konwersja plików. Obliczenia pośrednie. Obliczanie resztkowych sprzężeń dipolowych: PALES Wyznaczenie intensywności NOE: IRMA Obliczenie sprzężeń skalarnych. Konwersja plików. Obliczenia pośrednie. Obliczenie odległości NOE. Konwersja plików. Wyznaczenie kątów torsyjnych: X-PLOR Konwersja plików. Obliczenia pośrednie. Ustalenie zbioru parametrów istotnych. Porównanie struktur wyjściowych ze strukturą początkową. Wyznaczenie rodziny struktur: X-PLOR

Konwersja plików. Obliczenia pośrednie. Obliczenie odległości NOE. Konwersja plików.

16 Techniczna strona projektu Zbiór danych testowych: łańcuchy RNA o znanej strukturze krystalicznej (rrna, trna) w formacie pdb, pobrane z Protein Data Bank Programy wykorzystywane do obliczeń: a) PALES Prediction of ALignmEnt from Structure (Ad Bax, Markus Zweckstetter), b) IRMA (Ralf Boelens, Alexandre Bonvin), c) X-PLOR (Axel T. Bruenger), d) CYANA Combined assignment and dynamics Algorithm for NMR Applications (Peter Guentert), e) własne moduły CALPAS CALculating optimal PArameter Set for rna deuteration Implementacja projektu CALPAS: Fortran77, środowisko Unix

(Ralf Boelens, Alexandre Bonvin), c) X-PLOR (Axel T.

17 Temat realizowany jest pod kierunkiem profesora Christiana Griesingera oraz doktor Teresy Carlomagno w Instytucie Chemii Biofizycznej Maxa Plancka w Getyndze

Podobne dokumenty

Kombinatoryczna analiza widm 2D-NOESY w spektroskopii Magnetycznego Rezonansu Jądrowego cząsteczek RNA. Marta Szachniuk

Kombinatoryczna analiza widm 2D-NOESY w spektroskopii Magnetycznego Rezonansu Jądrowego cząsteczek RNA Marta Szachniuk Plan prezentacji Wprowadzenie do tematyki badań Teoretyczny model problemu Złożoność