Laboratorium 8 Badanie stresu oksydacyjnego jako efektu działania czynników toksycznych Literatura zalecana: Jakubowska A., Ocena toksyczności wybranych cieczy jonowych. Rozprawa doktorska, str. 28 31. Politechnika Śląska. Gliwice Zadanie: Badanie aktywności enzymów antyoksydacyjnych: CAT, SOD i GST w rzęsie drobnej (Lemna minor) poddanej działaniu herbicydu Roundup (glifosat) Odczynniki, szkło laboratoryjne: Herbicyd r-r wyjściowy: 40 cm 3 na 1 dm 3 wody (stężenia: 1%; 0,1%; 0,01%; 0,001%) pożywka 20 x AAP bufor 0,06 M sodowo-fosforanowy o ph 7,4 bufor 0,05 M węglanowy o ph 10,2 bufor 0,1 M potasowo-fosforanowy o ph 6,5 32,4 mm molibdenian (VI) amonu (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 65 mm H 2 O 2 w 0,06 M buforze sodowo-fosforanowym o ph 7,4 adrenalina 1 mm 1-chloro-2, 4-dinitrobenzen (CDNB) w 99% alkoholu etylowym, Glutation GSH naczyńka (np. płytki 6-dołkowe), homogenizator (ew. moździerz), probówki, pipety automatyczne, wirówka, spektrofotometr Wykonanie: a. Po zakończeniu tygodniowej ekspozycji rzęsy na poszczególne stężenia herbicydu (1%; 0,1%; 0,01%; 0,001%) wykonać w moździerzu ekstrakty enzymatyczne (homogenaty) z roślin testowych (próby badane i kontrolne bez herbicydu). Homogenaty przygotować w odpowiednim buforze dla każdej badanej aktywności enzymatycznej: 1. do oznaczania katalazy (CAT) bufor 0,06 M sodowo-fosforanowy o ph 7,4 2. do oznaczania dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) bufor 0,05 M węglanowy o ph 10,2 3. do oznaczania S-transferazy glutationowej (GST) bufor 0,1 M potasowo-
fosforanowy o ph 6,5. Dla aktywności CAT i SOD (i prób kontrolnych: K CAT i K SOD ) homogenizować rzęsy w 1 cm 3 schłodzonego buforu (wszystkie 15 roślin z dołka), a dla aktywności GST (i próby kontrolnej K GST ) - w 2 cm 3 schłodzonego buforu (łącznie 30 roślin z obu dołków). Próby z dodatkowych dołków kontrolnych potraktować jako rezerwę. b. Uzyskane homogenaty odwirować przez 20 min., przy 4000 rpm, w temp. 4 0 C. UWAGA! Przed wirowaniem zrównoważyć probówki. Wirowanie homogenatów z prób do oznaczania CAT i SOD wykonać w eppendorfkach, natomiast wirowanie homogenatów z prób do oznaczeń GST - w probówkach wirówkowych (ze względu na 2x większą objętość) c. Otrzymane supernatanty wykorzystać do oznaczania aktywności enzymatycznych d. Przed przystąpieniem do oznaczania aktywności enzymów, wykonać pomiar ilości białka w każdym z uzyskanych supernatantów (z prób badanych i kontrolnych). Pomiar zawartości białka w supernatantach metodą Bradforda Metoda polega na zdolności łączenia się białka z barwnikiem Coomasie Brilliant Blue G-250 (CBB) i tworzenia z nim niebieskiego kompleksu. Intensywność zabarwienia tego kompleksu jest wprost proporcjonalna do ilości białka. Zawartość białka w badanej próbie określa się ostatecznie korzystając z krzywej wzorcowej (kalibracyjnej) wyznaczonej na podstawie reakcji barwnika ze znanymi ilościami białka wzorcowego (albuminy wołowej). Odczynniki: etanol 85% H 3 PO 4 kwas ortofosforowy Wzorcowa albumina wołowa (BSA) odczynnik Bradford: 100mg CBB rozpuścić w 50 cm 3 etanolu, dopełnić wodą do 600 cm 3. Dodać 100 cm 3 85% H 3 PO 4 i całość dopełnić do 1000 cm 3,
probówki Eppendorfa, pipety Wykonanie: a. W małych probówkach przygotować r-y o objętości 3 cm 3 : - r-y BSA do wyznaczenia krzywej wzorcowej (kalibracyjnej): 00; 25; 50; 100; 125; 200; 250; 375; 500 ng/cm 3 - badane supernatanty (ewentualnie ich rozcieńczenia) b. Do probówki Eppendorfa przenieść pipetą 300 µl przygotowanej próbki (supernatantu) i dodać 3 cm 3 odczynnika Bradford. Wymieszać i pozostawić na 5 min. w temp. pokojowej. c. Zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze Pharo 300 Merck przy długości fali λ = 595 nm wobec próby odczynnikowej (300µl buforu 0,06 M sodowo-fosforanowego o ph 7,4 i 3 cm 3 odczynnika Bradford również pozostawić na 5 min., jak próbę badaną) d. Sporządzić krzywą wzorcową (zależność absorbancji od stężenia białka wzorcowego BSA) i na jej podstawie określić zawartość białka w supernatantach. Uzyskane wartości będą użyte do określania aktywności badanych enzymów. Pomiar aktywności katalazowej (CAT) Metoda polega na łączeniu się H 2 O 2 nie rozłożonego przez katalazę, z molibdenianem (VI) amonu (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24, w barwny kompleks, który można zmierzyć spektrofotometrycznie. a. Do probówki wprowadzić 200 μl uzyskanego wcześniej ekstraktu enzymatycznego i 1 cm 3 świeżo przygotowanego substratu reakcji (65 mm H 2 O 2 w 0,06 M buforze sodowofosforanowym o ph 7,4) b. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez 1 min. w łaźni wodnej o temp. 37 0 C (cieplarka). c. Zatrzymać reakcję dodając 1 cm 3 32,4 mm molibdenianu (VI) amonu (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24
d. Zmierzyć absorbancję próby na spektrofotometrze Zeiss, przy długości fali λ = 405 nm względem próby odczynnikowej (200 μl 0,06 M buforu sodowo- fosforanowym o ph 7,4 i 1 cm 3 65 mm H 2 O 2 w 0,06 M buforze sodowo-fosforanowym o ph 7,4 również inkubować przez 1min. w 37 0 C, a następnie dodać 1 cm 3 32,4 mm molibdenianu (VI) amonu (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ). Aktywność CAT wyrazić w jednostce [μm H 2 O 2 /min/mg białka ]. Pomiar aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) Metoda wykorzystuje samoczynne zachodzenie reakcji utlenianiu adrenaliny do adenochromu w ph 10,2. Produktem tej reakcji jest anion ponadtlenkowy unieczynniany przez SOD. Miarą aktywności tego enzymu jest więc szybkość hamowania utleniania adrenaliny. a. Do probówki (kuwety) wprowadzić 2,8 cm 3 buforu węglanowego o ph 10.2, 100μl ekstraktu enzymatycznego oraz 100 μl adrenaliny (3x10-4 M) b. Prowadzić pomiar absorbancji próby na spektrofotometrze Pharo 300 Merck co minutę, przez 5 minut, przy λ = 480 nm, względem próby odczynnikowej (2,9 cm 3 buforu 0,05 M węglanowego o ph 10,2 oraz 100 μl adrenaliny(3x10-4 M). Aktywność SOD wyrazić w jednostce [JA/min/ mg białka ]. Jedna JA (jednostka aktywności) oznacza ilość enzymu powodującą inhibicję autooksydacji adrenaliny o 50% w czasie 1 min. w porównaniu z próbą kontrolną. Pomiar aktywności S-transferazy glutationowej (GST) GST katalizuje reakcję utleniania zredukowanej formy glutationu (GSH) w reakcji z nukleo- i elektrofilowymi związkami. Jako substrat reakcji stosowany jest 1-chloro-2, 4-dinitrobenzen (CDNB). Produktem reakcji jest barwny kompleks 2,4-dinitrofenylo-S-glutation.
a. Do probówki (kuwety) wprowadzić 1800 μl 0,1 M buforu potasowo-fosforanowego o ph 6.5, 600 μl ekstraktu enzymatycznego oraz 300 μl 5 mm GSH b. Bezpośrednio przed pomiarem dodać 300 μl 1 mm r-u CDNB w 99% alkoholu etylowym i mierzyć absorbancję na spektrofotometrze Pharo 300 Merck co minutę, przez 5 minut, przy λ =340 nm względem próby odczynnikowej (2400 μl 0,1 M buforu potasowo-fosforanowego o ph 6.5, 300 μl 10 mm GSH i - podanego bezpośrednio przed pomiarem- 300 μl 40 mm r-u CDNB ). Aktywność enzymu obliczyć za pomocą równania: A = ΔA V k / k t b Gdzie: ΔA zmiana absorbancji próbki, V k objętość końcowa mieszaniny reakcyjnej [ml] k współczynnik ekstynkcji równy 9,6 [mm/cm] t czas pomiaru [min] b stężenie białka w mieszaninie reakcyjnej Aktywność GST wyrazić jako [μm CDNB/min/mg białka ]
Krzywa wzorcowa (kalibracyjna) do określania stężenia białka metodą Bradforda (Spektrofotometr Pharo 300 Merck; 300 µl próby + 3 cm 3 odczynnika Bradford odczyt po 5 min.) C[µg/cm 3 ] A λ=595nm 0 0 5 0,057 10 0,108 15 0,158 25 0,280 50 0,546 75 0,727 100 1,178
Krzywa wzorcowa do określania stężenia H 2 O 2 (Spektrofotometr Zeiss ) C [µm/dm 3 ] A λ=405nm 250 0,002 325 0,003 500 0,003 2500 0,094 7500 0,220 12500 0,320 17500 0,417 22500 0,537 27500 0,628 32500 0,730