Ćwiczenie Ilościowe oznaczanie glutationu i witaminy C A. Ilościowe oznaczanie glutationu (GSH) metodą Ellmana

Transkrypt

1 Ćwiczenie Ilościowe oznaczanie glutationu i witaminy C A. Ilościowe oznaczanie glutationu (GSH) metodą Ellmana Wzór chemiczny glutationu (γ-glutamylocysteinyloglicyna) Glutation (GSH) jest tiolowym tripeptydem o powyższym wzorze strukturalnym, występującym w komórce zwierzęcej w ilości 1-10 mmol. Jego aktywność biologiczna wynika z obecności grupy sulfhydrylowej (-SH), która uczestniczy w reakcjach antyoksydacyjnych oraz detoksykacyjnych. Nukleofilowa grupa SH glutationu może reagować z elektrofilowymi substancjami pochodzenia zarówno endogennego, jak i egzogennego (ksenobiotyki), tworząc koniugaty. Skutkuje to tworzeniem związków o większej rozpuszczalności i mniejszej toksyczności, a tym samym łatwiej wydalanych z organizmu. Glutation odgrywa istotną rolę w metabolizmie i detoksykacji leków, a także przeciwdziała ubocznym skutkom radio- i chemioterapii. obniżenie poziomu glutationu w komórkach towarzyszy takim stanom patologicznym jak niedożywienie, choroba Parkinsona lub AIDS. Często terapia związana jest z reakcjami oksydacyjnymi powodującymi zakłócenie w komórkach fizjologicznej równowagi pomiędzy prooksydantami i antyoksydantami. GSH jest również istotnym antyoksydantem komórkowym. Reaguje z nadtlenkiem wodoru i nadtlenkami organicznymi w procesie katalizowanym przez peroksydazę glutationową: GSH + HSG +H 2 O 2 GS-SG + 2H 2 O GSH + HSG +ROOH GS-SG + ROH + H 2 O Regeneracja zredukowanej formy glutationu zachodzi w obecności reduktazy glutationowej zgodnie z równaniem reakcji: GS-SG + NADPH+H + 2GSH + NADP + Antyutleniające działanie glutationu przejawia się również w odtwarzaniu w białkach grup tiolowych, które uległy utlenieniu do grup disiarczkowych lub sulfonowych. Dzięki temu utrzymuje grupy SH białek w formie zredukowanej, co jest niezbędne dla ich aktywności biologicznej. W krwinkach czerwonych zredukowany glutation (GSH) pełni funkcję buforu hydrosulfidowego, utrzymującego reszty cysteinowe hemoglobiny i innych białek w formie zredukowanej. Erytrocyty, które nie zawierają dostatecznej ilość tej formy glutationu ulegają hemolizie. 1

2 Glutation uczestniczy ponadto w redukcji rybonukleotydów z utworzeniem deoksyrybonukleotydów, czyli bezpośrednio wpływa na biosyntezę DNA. Glutation utrzymuje także sprawność układu odpornościowego poprzez udział w powstawaniu i funkcjonowaniu limfocytów (zwłaszcza grasicozależnych T niszczących obce komórki) oraz ochrania witaminy E i C przed utlenianiem, utrzymując ich prawidłowy poziom w organizmie. Glutation uczestniczy również w syntezie leukotrienów LTC 4 i LTD 4, którym przypisuje się zdolność do powolnego kurczenia mięśni gładkich dróg oddechowych i przewodu pokarmowego oraz zwiększenia przepuszczalności naczyń włosowatych, co sprzyja powstawaniu obrzęków zapalnych. Wspomniany tripeptyd uczestniczy w przekształceniu prostaglandyny PGG 2 w PGH 2 na etapie katalizowanym przez hydroperoksydazę prostaglandynową, czyli syntazę PGH 2. W komórkach zwierzęcych zredukowany glutation uczestniczy również w transporcie aminokwasów do komórki drogą cyklu γ-glutamylowego. Po zewnętrznej stronie błony komórkowej dowolny aminokwas (z wyjątkiem proliny) wiąże się z przenośnikiem, czyli γ-glutamylotranspeptydazą, która jest integralnym składnikiem błony komórkowej. Podczas przemieszczania się przez błonę aminokwas wytwarza wiązanie izopeptydowe z grupą γ-karboksylową glutaminianu pochodzącego z glutationu i powstaje γ- glutamyloaminokwas. Ten dipeptyd nie wykazuje powinowactwa do przenośnika, uwalniany jest do cytozolu, gdzie pod wpływem γ-glutamylocyklotransferazy następuje jego rozpad do pierwotnej formy aminokwasu. Natomiast reszta glutaminianu przekształca się w 5-oksoprolinę, która w obecności 5- oksoprolinazy tworzy glutaminian. Pozostały fragment glutationu, czyli cysteinyloglicyna ulega hydrolizie do cysteiny i glicyny. Tym samym aminokwas został przetransportowany do komórki, a glutation rozpadł się na elementy składowe Glu, Cys, Gly mogące uczestniczyć w odtworzeniu glutationu. Glutaminian reaguje bowiem z cysteiną tworząc γ-glutamylocysteinę, która przyłącza glicynę odtwarzając strukturę glutationu mogącego ponownie włączyć sie w kolejny obrót cyklu γ-glutamylowego. Transport jednej cząsteczki aminokwasu drogą cyklu γ-glutamylowego jest kosztowny energetycznie, wymaga bowiem 2

3 wykorzystania aż 3 cząsteczek ATP, czyli jest 9 razy więcej niż transport tego związku z wykorzystaniem symportowego przenośnika zależnego od Na +. Cykl γ-glutamylowy funkcjonuje w wielu narządach, szczególnie w jelitach i kanalikach nerkowych. Jednak dysfunkcje związane na przykład z wrodzonym brakiem γ-glutamylotranspeptydazy nie powodują żadnych zaburzeń w transporcie aminokwasów. prawdopodobnie komórki dysponują kilkoma alternatywnymi mechanizmami transportu aminokwasów. 3

4 Zasada oznaczenia ilości glutationu metodą Ellmana Glutation stanowi prawie 97% niebiałkowych związków tiolowych i dlatego oznaczając niebiałkowe grupy SH w odbiałczonym przy użyciu kwasu trichlorooctowego (TCA) homogenacie wątroby glutation oznaczany jest praktycznie ilościowo. Ten tripeptyd oznacza się technika spektrofotometryczną z wykorzystaniem metody Ellmana, która polega na redukcji kwasu 5,5-ditiobis-(2-nitrobenzoesowego), czyli DNTB przez związki tiolowe do barwnego kwasu 2-nitro-5-merkaptobenzoesowego, wykazującego maksimum absorbancji przy długości fali λ = 412 nm. 4

5 Odczynniki: 1) 0,1M bufor fosfornowy ph=7,25 2) 0,2M bufor fosforanowy ph=7,8 3) 0,006M roztworu DTNB 4) 50% roztwór TCA 5) 2,5% roztwór TCA 6) 1mM roztwór glutationu w 2,5% roztworze TCA Wykonanie: I. Sporządzić krzywą wzorcową dla glutationu. W tym celu sporządzić szereg rozcieńczeń 1 mm roztworu GSH postępując zgodnie ze wskazówkami umieszczonymi w poniższej tabeli. objętość roztworów [µl] próba 1 próba 2 próba 3 próba 4 próba 5 Odnośnik 1 mm GSH X 0,2M bufor fosfor. ph 8, ,006M DNTB ,5 % TCA X X X X X 100 końcowe stęż. r-ru GSH [mm] A λ=412nm 1. 10,0 g tkanki wątrobowej homogenizować w 40 ml 0,1 M buforu fosforanowego, uzupełnić buforem homogenat do 50 ml, a następnie w celu odbiałczenia do 1 ml homogenatu dodać 75 µl 50% TCA. 2. Homogenaty mieszać przez 30 s na vorteksie, a następnie wirować 10 min ( obr./min). 3. Supernatant przenieść do oddzielnej probówki chłodzonej lodem. 4. Próbę badaną przygotować według poniższych zaleceń. 0,2M bufor 0,006M fosfor. ph 8,2 DNTB supernatant 2,5 % TCA A λ=412nm próba badana [µl]

6 odnośnik [µl] X Zmierzyć absorbancję przy długości fali λ = 412 nm względem próby ślepej dokładnie po 2 min. od wprowadzenia supernatantu. 6. Na podstawie krzywej wzorcowej oblicz stężenie glutationu w µmolach na gram tkanki wątrobowej przyjmując, że 100 µl supernatantu odpowiada 19 mg mokrej masy wątroby. Stężenie glutationu w wątrobie waha sie dobowo, zależy od diety i wieku zwierząt i wynosi od 4 do 8 µmoli/g mokrej masy tkanki. Zagadnienia do przygotowania 1. Struktura chemiczna i funkcje glutationu (rola w detoksykacji wolnych rodników tlenowych i organicznych oraz nadtlenku wodoru i nadtlenków organicznych) 2. Znaczenie i przebieg cyklu γ-glutamylowego 3. Zasada oznaczenia glutationu metodą Ellmana B. Oznaczanie witaminy C Kwas L-askorbinowy (witamina C) jest związkiem krystalicznym, dobrze rozpuszczalnym w wodzie a jego roztwory mają kwaśny smak. Wykazuje właściwości redukujące. Jego forma utleniona to kwas dehydroaskorbinowy. Układ oksydoredukcyjny kwas askorbinowy kwas dehydroaskorbinowy może uczestniczyć w regulowaniu potencjału oksydoredukcyjnego w komórce i brać udział w transporcie elektronów. Ponieważ witamina C występuje w znacznych ilościach w gruczołach nadnercza, przypuszcza się, że uczestniczy ona w syntezie hormonów sterydowych. Witamina C uczestniczy w produkcji kolagenu i podstawowych białek w całym organizmie (kości, chrząstki, ścięgna, więzadła). Jako jeden z najważniejszych przeciwutleniaczy pełni także istotną funkcję w reakcjach odtruwania i odporności organizmu chroniąc go przed procesami utleniania, uczestniczy w metabolizmie tłuszczów, cholesterolu i kwasów żółciowych. Wśród metod oznaczania witaminy C można wyróżnić metody fizykochemiczne: chromatografia cieczowa, metoda spektrofotometryczna i metoda potencjometryczna oraz metody chemiczne. Odczynniki: - r-r 2,6-dichlorofenolindofenolu (2,6-DPIP) - 1% FeCl 3 6

7 - 1% K 3 Fe(CN) 6-1% witamina C - 1% i 2% kwas szczawiowy - 10% kwas trichlorooctowy (TCA) - 2% H 2 SO 4-10% NaOH - odczynnik Folina - 10% HCl 1. Reakcja z żelazicyjankiem potasu Przygotować dwie próbówki. Do pierwszej dodać 5 kropli 1% r-ru witaminy C, a do drugiej 5 kropli wody. Następnie do obydwu próbówek dodać 1 kroplę 10% NaOH i 1 kroplę 1% żelazicyjanku potasu. Zawartość probówki wymieszać, a następnie dodać 3 krople 10% HCl i 1 kroplę 1% FeCl 3. Obserwacje zanotować w zeszycie. 2. Oznaczanie witaminy C metodą Folina Zasada oznaczenia W obecności kwasu askorbinowego kwas fosfomolibdenowy (VII) ulega redukcji do mieszaniny niższych tlenków molibdenu błękitu molibdenowego. Odczynnik ten jest również specyficznie redukowany przez kwas askorbinowy w ph 1-7. W tym zakresie ph i poza witaminą C inne reduktory obecne w płynach ustrojowych i tkankach nie redukują go. Wykonanie 1. Otrzymanie homogenatu Każdy 1 g tkanki zalać 1 cm 3 10% TCA, a następnie homogenizować przez 5 minut. Osad odwirować przy 3000 obr./min 2. Przygotowanie krzywej wzorcowej Przygotować krzywą standardową poprzez wykonanie szeregu rozcieńczeń roztworu wzorcowego kwasu askorbinowego o stężeniu 0,1mg / cm 3 według tabeli : Stężenie kwasu 0 g/ml 2,5 g/ml 5 g/ml 12,5 g/ml 25 g/ml 35 g/ml askorbinowego R-r wzorcowy [ml] 0 0,05 0,1 0,25 0,5 0,7 10% TCA [ml] 2,0 1,95 1,9 1,75 1,5 1,3 Do przygotowanych prób dodać po 0,2 ml odczynnika Folina i natychmiast po dodaniu energicznie zamieszać. 3. Oznaczenie witaminy C w materiale biologicznym Do oznaczeń pobrać 0,2-0,5 ml supernatantu. Objętość prób uzupełnić do 2 ml 10% TCA, a następnie dodać 0,2 ml odczynnika Folina i energicznie zamieszać 7

8 Absorbancję mierzyć przy długości fali 750 nm względem próby zerowej. Obliczyć ilość witaminy C w badanym materiale biologicznym. Obliczyć ilość materiału biologicznego, który zaspokajałby dzienne zapotrzebowanie dorosłego człowieka na tę witaminę. Ilość zaspokajająca dzienne zapotrzebowanie na wit. C Badany materiał biologiczny dorosłego człowieka [g] 3. Oznaczanie witaminy C metodą Tillmansa Zasada oznaczenia Metoda Tillmansa oparta jest na redukcji barwnika 2,6-dichlorofenoloindofenolu przez kwas askorbinowy. Utleniony DCIP jest niebieski, zredukowany bezbarwny. Reakcja przebiega według równania: Oznaczanie kwasu askorbinowego polega na miareczkowaniu próby badanej w kwaśnym środowisku (zapobiega to samoutlenieniu kwasu askorbinowego tlenem z powietrza oraz chroni przed działaniem oksydaz). Barwnik jest zarazem indykatorem, po wyczerpaniu kwasu askorbinowego zabarwia on próbę miareczkowaną na kolor różowy. Wiadomo, że większość surowców roślinnych zawiera barwniki antocyjanowe, które nadają ekstraktom witaminy C różowe zabarwienie, a także mają właściwości redukujące. Ponadto w produktach, w których oznaczany witaminę C, występują inne związki ulegające utlenieniu podczas miareczkowania odczynnikiem Tillmansa. Należą do nich reduktony związki obdarzone silnymi właściwościami redukującymi, które należy przypisywać obecności ugrupowania endiolowego. W przypadku oznaczania witaminy C w owocach i warzywach oraz ich przetworach mamy do czynienia z reduktonami białkowymi (aminokwasy lub białka zawierające grupy sulfhydrylowe, które są utleniane przez odczynnik Tillmansa do wiązań disulfidowych) oraz cukrowymi (pochodne cukrów, które powstają podczas obróbki termicznej). Wykonanie 1. Wyznaczanie miana roztworu 2,6-dichlorofenolindofenolu (2,6-DPIP) Pobrać 25 ml wzorcowego roztworu kwasu askorbinowego (4 mg kwasu w 100 ml 2% kwasu siarkowego) i zmiareczkować roztworem 2,6-dichlorofenolindofenolu do jasnoróżowego zabarwienia utrzymującego się przez 30 sek. 8

9 2. Oznaczanie zawartości witaminy C w badanych próbkach 2-3 g jabłka, zhomogenizować z 20 ml 1% kwasu szczawiowego. Po homogenizacji roztwór uzupełnić do objętości 100 ml 1% kwasem szczawiowymi przesączyć. 25 ml klarownego przesączu miareczkować w kolbie stożkowej mianowanym roztworem 2,6- dichlorofenoloindofenolu do uzyskania różowego zabarwienia utrzymującego się przez 30 sekund. Z równania reakcji kwasu askorbinowego z 2,6-DPIP wynika, że 1 ml roztworu barwnika odpowiada 0,5 μmola kwasu tj, 0,088 mg. Korzystając z tej zależności oraz znając dokładne stężenie roztworu barwnika należy wyliczyć ilość witaminy C w badanej próbce. Wynik podać w miligramach przypadających na 100 g materiału roślinnego. Otrzymane dane porównać z wartościami literaturowymi. 9