Otrzymany w pkt. 8 osad, zawieszony w 2 ml wody destylowanej rozpipetować do 4 szklanych probówek po ok. 0.5 ml do każdej.

Transkrypt

1 Kwasy nukleinowe izolacja DNA, wykrywanie składników. Wymagane zagadnienia teoretyczne 1. Struktura, synteza i degradacja nukleotydów purynowych i pirymidynowych. 2. Regulacja syntezy nukleotydów. Podstawowe enzymopatie metabolizmu puryn i pirymidyn (dna moczanowa, zespół Lesch-Nyhana, acyduria orotanowa, niedobory; deaminazy adenozyny, fosforylazy nukleozydów purynowych, fosforybozylotransferazy adeninowej, 5`-nukleazy pirymidynowej). 3. Rola wolnych nukleotydów. 4. Analogi zasad azotowych (5-fluorouracyl, merkaptopuryna, tioguanina) i nukleozydów (cytarabina, kladrybina) jako leki przeciwnowotworowe. 5. Budowa i organizacja DNA w komórkach eukariotycznych. I. Preparatyka kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) z wątroby. 1. Odważone 0.5 g świeżej lub mrożonej wątroby rozdrobnić przy pomocy skalpela w porcelanowym moździerzu, dodając stopniowo, początkowo kroplami 6 ml buforu A ( 0.25M roztwór sacharozy w 0.9% NaCl; ph 7.0). Całość bardzo dokładnie wymieszać aż do uzyskania homogennej zawiesiny i ucierać w moździerzu przez 5 minut. 2. Przenieść homogenat do probówki wirówkowej i wirować obr/ min przez 10 minut 3. Supernatant wylać. Do pozostałego w probówce osadu ( zawiera jądra komórkowe) dodać 2.5 ml buforu B (1M NaCl) i energicznie wytrząsać przez 10 minut. 4. Do otrzymanej zawiesiny dodać powoli kroplami 0.6 ml buforu C(5% roztwór SDS w 45% etanolu); całość bardzo delikatnie wymieszać przez 30 s., a następnie wirować przy 3000/4000obr/min. przez 10 minut. 5. Po odwirowaniu oddzielić supernatant, który zawiera DNA od osadu, który zawiera białka. 6. Supernatant przelać do czystej probówki wirówkowej i dodać powoli dwukrotnie większą objętość schłodzonego 95% etanolu. Delikatnie zamieszać przy pomocy bagietki powstają galaretowate włókna kw. deoksyrybonukleinowego owijające się dookoła bagietki. 7. Wyizolowany DNA przenieść delikatnie do czystej probówki wirówkowej, dodać 3 ml schłodzonego 70% etanolu i wirować 3000/4000obr/min przez 10 minut. 8. Superanatant wylać. Otrzymany osad zawiesić w 2 ml wody destylowanej i użyć do dalszej analizy wykrywania obecności fosforanów, zasad purynowych i cukrów. 9. Na osadzie otrzymanym w pkt. 5 należy wykonać próbę biuretową. Osad zawiesić w 1 ml wody destylowanej, następnie dodać 1 ml 2N roztworu NaOH i wkroplić kilka kropli 1% roztworu CuSO 4. Całość dokładnie wymieszać. Fiołkowe zabarwienie roztworu świadczy o obecności związku zawierającego wiązania peptydowe. II. Charakterystyka kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) otrzymanego z wątroby. Otrzymany w pkt. 8 osad, zawieszony w 2 ml wody destylowanej rozpipetować do 4 szklanych probówek po ok. 0.5 ml do każdej. Probówka 1. Wykrywanie obecności zasad purynowych. Do 0.5 ml r-ru DNA dodać kroplami bardzo powoli ciągle mieszając 1% r-r AgNO 3 ( ok. 6 kropli) i 0.5 ml 2N NH 4 OH Po chwili pojawi się biały osad soli srebrowych zasad purynowych, które są nierozpuszczalne w amoniaku. Probówka 2. Wykrywanie obecności fosforanów. Do 0.5 ml r-ru DNA dodać ostrożnie 0.5 ml 2N HNO 3, a następnie 1 ml molibdenianu amonowego, dokładnie wymieszać. Po wymieszaniu probówkę wstawić do wrzącej łaźni wodnej i ogrzewać do momentu kiedy w probówce pojawi się żółte zabarwienie świadczące o obecności fosforanów. Po ostygnięciu wypada żółty osad fosfomolibdenianu amonu. Probówka 3. Wykrywanie obecności cukru. (reakcja Molischa) Do 0.5 ml r-ru DNA dodać 0.5 ml odczynnika Molischa ( α naftol w etanolu), dokładnie wymieszać, a następnie ostrożnie podwarstwić 0.5 ml stężonym H 2 SO 4. Nie mieszać!! Na granicy cieczy pojawia się fioletowo-purpurowy pierścień świadczący o obecności cukru.

2 Probówka 4. Wykrywanie obecności deoksyrybozy (reakcja Dischego) Do 0.5 ml r-ru DNA dodać bardzo ostrożnie 1 ml odczynnika Dischego ( dwufenyloamina DPA; rozpuszczona w stężonym CH 3 COOH ze stężonym H 2 SO 4 ), delikatnie wymieszać. Po wymieszaniu wstawić probówkę do wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. Pojawia się niebieskie zabarwienie świadczące o obecności deoksyrybozy.

3 BIOCHEMIA Imię i nazwisko GS Kwasy nukleinowe - izolacja DNA z wątroby, wykrywanie składników. I. Preparatyka DNA z wątroby. Zasada metody:... II. Wykrywanie składników DNA za pomocą reakcji barwnych: Próba odczynnikowa Obserwacje: Wnioski: III. Na osadzie otrzymanym w pkt. 5 wykonać próbę biuretową Wniosek końcowy Umiejętności: Kompetencje: zaliczono nie zaliczono ocena pozytywna ocena negatywna Data i podpis prowadzącego

4 ILOŚCIOWE OZNACZANIE KWASU MOCZOWEGO W SUROWICY KRWI Wyjaśnienie Kwas moczowy jest końcowym produktem katabolizmu nukleotydów purynowych u ssaków. Kwas moczowy redukuje kwas fosforowolframowy w obecności węglanu sodowego do tlenku wolframu barwy niebieskiej. Intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do zawartości kwasu moczowego. Przygotowanie próby badanej Do probówki wirówkowej odpipetować 0,9 ml surowicy, następnie dodać 4,5 ml 2% roztworu Na 2 WO 3 oraz 3,6 ml roztworu 0,16 N H 2 SO 4 i wymieszać. Wirować 5 minut przy 3000 obrotów/min. Supernatant zlać do probówki wirówkowej. Odpipetować 3 ml supernatantu do szklanej probówki chemicznej i dodać 0,6 ml roztworu Na 2 CO 3 z mocznikiem oraz 0,15 ml odczynnika Folina-Denisa, wymieszać i pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej. Przygotowanie próby kontrolnej Do szklanej probówki chemicznej odpipetować 0,9 ml wody destylowanej, następnie dodać 4,5 ml 2% roztworu Na 2 WO 3 oraz 3,6 ml 0,16 N roztworu H 2 SO 4 i wymieszać. Po wymieszaniu, odpipetować 3 ml powyższego roztworu do drugiej szklanej probówki chemicznej, następnie dodać 0,6 ml roztworu Na 2 CO 3 z mocznikiem oraz 0,15 ml odczynnika Folina-Denisa i wymieszać. Po 10 minutach oznaczyć ekstynkcję próby badanej wobec próby kontrolnej przy długości fali 635 nm. Zawartość kwasu moczowego odczytać z krzywej kalibracyjnej.

5 BIOCHEMIA Imię i Nazwisko GS... Data... Zasada metody: Oznaczanie stężenia kwasu moczowego w surowicy krwi Obliczenie i interpretacja wyniku: Wniosek końcowy: Umiejętności: Kompetencje: zaliczono nie zaliczono ocena pozytywna ocena negatywna Data i podpis prowadzącego