UWAGA NA WRZĄCY OLEJ!!!!

Transkrypt

1 ĆWICZENIE 4 Lipidy Wykazanie obecności glicerolu próba akroleinowa 0,5 ml oleju 0,5ml glicerolu kilka kryształów bezwodnego CuSO 4 2x pipetka plastikowa kuchenka elektryczna 1x chwytak do probówek Przygotuj 2 probówki. Do pierwszej z nich wlej 0,5 ml glicerolu, do drugiej 0,5 ml oleju. Do obu probówek dodaj kilka kryształów bezwodnego CuSO 4 i następnie probówki ogrzewaj nad płytą kuchenki. UWAGA NA WRZĄCY OLEJ!!!! Stwierdzić charakterystyczny zapach wydzielającej się akroleiny. Wykrywanie glicerolu (reakcja z wodorotlenkiem miedziowym) 2 ml glicerolu 1 ml wody destylowanej 2 ml 10% NaOH 2 ml 7% roztworu CuSO 4 4x pipetki plastikowe Przygotować dwie probówki. Do każdej z nich nalać po 1 ml 7% roztworu CuSO 4 i 1 ml 10% roztworu NaOH. Wytrąci się osad Cu(OH) 2. Następnie do pierwszej probówki dodać 1 ml glicerolu a do drugiej 1 ml wody destylowanej. W probówce z glicerolem osad Cu(OH) 2 rozpuszcza się i roztwór przybiera intensywną niebieską barwę. 15

2 Zasadowa hydroliza tłuszczu (zmydlanie tłuszczów) 1 ml oleju 6 ml 5% etanolowego roztworu wodorotlenku sodowego 10 ml wody destylowanej kolbka na 50ml 3x probówki szklane 3x pipetki plastikowe Do kolbki na 50 ml nalać 1 ml oleju i dodać 6 ml 5% etanolowego roztworu wodorotlenku sodowego. Ogrzewać na płycie kuchenki przez około 5 min. Następnie kolbkę ochłodzić pod bieżącą wodą aż do uzyskania zestalonego mydła sodowego. Do kolbki dolać 10 ml wody destylowanej i ponownie ogrzewać do momentu rozpuszczenia się mydła i powstania jednorodnego roztworu mydła w wodzie. Otrzymany roztwór rozdzielić po równo do czterech probówek. W pierwszej stwierdzić obecność mydła za pomocą wytrząsania (w obecności mydła tworzy się piana) a pozostałe zostawić do dalszych doświadczeń. Wysalanie koloidu szczypta chlorku sodu Do probówki zawierającej roztwór mydła (2 ml) dodać szczyptę chlorku sodu i dobrze wymieszać. Poczekać aż wytrącony osad mydła opadnie na dno i zlać delikatnie nadsącz nie naruszając osadu mydła. Zbadać jego rozpuszczalność w nadmiarze wody destylowanej. W tym celu do probówki dodać ok 5 ml wody destylowanej i zawartość dokładnie wymieszać przez wytrząsanie. Wytrącanie kwasów tłuszczowych 5 ml 5% kwasu siarkowego Do roztworu mydła z poprzedniego ćwiczenia (druga probówka) dodać 5 ml 5% kwasu siarkowego 16

3 i zaobserwować tworzenie się kłaczków wolnych kwasów tłuszczowych nierozpuszczalnych w wodzie. Wytrącanie nierozpuszczalnych mydeł 1 ml 10% CaCl 2 Do roztworu mydła sodowego (trzecia probówka) dodać 4 krople 10% CaCl 2. Wytrąca się nierozpuszczalny, biały osad soli wapniowej kwasu tłuszczowego. Poczekać aż wytrącony osad mydła opadnie na dno i zlać delikatnie nadsącz nie naruszając osadu mydła. Zbadać jego rozpuszczalność w nadmiarze wody destylowanej. W tym celu do probówki dodaj ok 5 ml wody destylowanej i zawartość dokładnie wymieszać przez wytrząsanie. Utlenianie wiązania podwójnego 0,5 ml oleju 0,5 ml wody destylowanej 6 ml 1M Na 2 CO 3 1 ml 0,01 M KMnO 4 4x pipetki plastikowe Wrząca łaźnia wodna Przygotować dwie probówki. Do pierwszej probówki nalać 0,5 ml oleju, do drugiej 0,5 ml wody destylowanej (kontrola) a następnie do każdej dodać 3 ml 1M Na 2 CO 3 w celu zalkalizowania środowiska. Probówki ogrzać na wrzącej łaźni wodnej przez ok. 1 min. Do każdej dodać 1 krople 0,01 M KMnO 4, zamieszać i obserwować zmianę zabarwienia. W probówce z olejem tworzy się brunatny osad dwutlenku manganu MnO 2. Oznaczanie liczby kwasowej tłuszczów Zasada: Liczba kwasowa jest to ilość KOH potrzebna do zobojętnienia wolnych kwasów tłuszczowych zawartych w 1 g tłuszczu. Jej wartość jest miarą zawartości w tłuszczu wolnych kwasów tłuszczowych, powstałych wskutek rozerwania części wiązań estrowych, których ilość zależy od warunków i czasu przechowywania tłuszczu oraz obecnych zanieczyszczeń. Tłuszcze nieświeże lub zafałszowane wolnymi kwasami tłuszczowymi posiadają wysokie liczby kwasowe. 17

4 Rozpuszczony tłuszcz miareczkuje się 0,001 M roztworem KOH w obecności wskaźnika (fenoloftaleiny) do zmiany zabarwienia. Tak samo postępuje się z próbą ślepą, którą jest sam rozpuszczalnik. Liczba moli zużytego roztworu wodorotlenku potasu zużyta do miareczkowania równa jest liczbie moli wolnych kwasów tłuszczowych w analizowanej próbie. OBLICZANIE WYNIKÓW: liczba kwasowa = 56,11 * M * (x-y)/c gdzie: x ilość ml titrantu zużyta na miareczkowanie próby badanego tłuszczu y ilość ml titrantu zużyta na miareczkowanie próby ślepej c ilość ml tłuszczu M stężenie molowe titrantu (mol/dm 3 ) 5 ml tłuszczu 50 ml alkoholu etylowego 50 ml 0,001M roztworu KOH 1 ml fenoloftaleiny 1x pipeta na 25 ml 2x kolba stożkowa 100ml 1x cylinder miarowy 10 ml 1x cylinder miarowy 50 ml biureta Wrząca łaźnia wodna : Przygotować dwie kolby stożkowe o pojemności 100 ml, do których należy wprowadzić: 5 ml tłuszczu i 25 ml alkoholu etylowego do pierwszej kolby 25 ml alkoholu etylowego (próba ślepa) do drugiej kolby. Każdą próbę miareczkować 0,001 M roztworem KOH w obecności fenoloftaleiny. Obliczyć wartość liczby kwasowej. Oznaczanie zawartości dialdehydu malonowego (MDA) Odczynniki: TCA kwas trichlorooctowy (trichloroacetic acid) 5%. Przygotowanie (na 100 ml roztworu): odważyć 5 g TCA i rozpuścić go w ok. 70ml wody. Dopełnić wodą do 100 ml. TBA reagent (mieszanina 20% TCA i 0,5% tiobarbituric acid). Przygotowanie (na 100 ml): odważyć 20g TCA, rozpuścić w ok. 70ml wody, odważyć 0,5g TBA i wsypać do przygotowanego wcześniej roztworu. Wytrząsać overnight a następnie dopełnić do 100 ml wodą. na 1 gr (5 zespołów) potrzeba: zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści roślin poddanych stresowi i kontrolnych: 2x 300mg TCA 35ml TBA 70 ml 18

5 Sprzęt: Spektrofotometr wirówka wytrząsarka łaźnia wodna łaźnia lodowa probówki eppendorfa 1,5ml Probówki PP zakręcane (bo do wrzącej łaźni wodnej) (co najmniej 7-15ml) Kuwety szklane pipety szklane i automatyczne Materiał roślinny: wierzba poddana stresowi wierzba osobniki kontrolne. Procedura: do 6 probówek PP 10 ml odważyć po ok. 20mg zhomogenizowanego wcześniej proszku pochodzącego z roślin poddanych stresowi (3 probówki) i roślin kontrolnych (3 probówki), zanotować dokładną wagę naważki w mg do każdej probówki dodać 1 ml 5% TCA i wytrząsać przez 30 min na lodzie. włączyć łaźnię wodną na 93 st C. w międzyczasie wstawić do stojaka 7 probówek typu falcon na 15 ml (zakręcane) i dodać do nich pod digestorium 2 ml przygotowanego roztworu TBA. Falcony trzymać w pudełkach z wodą i lodem. odwirować probówki z proszkiem przez 10 min (5000 rpm) z każdej próbki pobrać 0,5ml ekstraktu i dodać do 2 ml przygotowanego wcześniej TBA w falconie. Zakręcić i zamieszać. Do jednego falcona zamiast ekstraktu dodać 0,5 ml czystego 5% TCA (kontrola-referencja). wstawić do łaźni wodnej na 30 min w temp 93stC. po wyjęciu z łaźni wodnej falcony szybko ochłodzić (wstawić stojaki do pudełek z wodą i lodem) nalać do kuwety pomiarowej 2 ml roztworu i oznaczać w spektrofotometrze. Pierwsza kuweta z kontrolą (referencja=tło). Kuwety 2-4 próbki z roślin poddanych stresowi, kuwety 5-7 próbki z roślin kontrolnych. Absorbancję odczytywać dla 532 i 600nm. Wyniki przenieść do arkusza kalkulacyjnego i obliczyć stężenie z wzoru: (((A532 - A600 ) / 155) * 2 * 5) / naważka w gramach) * 1000 [nm/g d.w.] 19