Ćwiczenie 3 Ilościowe oznaczanie glutationu (GSH) metodą Ellmana

Transkrypt

1 Ćwiczenie 3 Ilościowe oznaczanie glutationu (GSH) metodą Ellmana Wzór chemiczny glutationu (γ glutamylocysteinyloglicyna) Glutation (GSH) jest tiolowym tripeptydem o powyższym wzorze strukturalnym, występującym w komórce zwierzęcej w ilości 1 10 mmol. Jego aktywność biologiczna wynika z obecności grupy sulfhydrylowej ( SH), która uczestniczy w reakcjach antyoksydacyjnych oraz detoksykacyjnych. Nukleofilowa grupa SH glutationu może reagować z elektrofilowymi substancjami pochodzenia zarówno endogennego, jak i egzogennego (ksenobiotyki), tworząc koniugaty. Skutkuje to tworzeniem związków o większej rozpuszczalności i mniejszej toksyczności, a tym samym łatwiej wydalanych z organizmu. Glutation odgrywa istotną rolę w metabolizmie i detoksykacji leków, a także przeciwdziała ubocznym skutkom radio i chemioterapii. obniżenie poziomu glutationu w komórkach towarzyszy takim stanom patologicznym jak niedożywienie, choroba Parkinsona lub AIDS. Często terapia związana jest z reakcjami oksydacyjnymi powodującymi zakłócenie w komórkach fizjologicznej równowagi pomiędzy prooksydantami i antyoksydantami. GSH jest również istotnym antyoksydantem komórkowym. Reaguje z nadtlenkiem wodoru i nadtlenkami organicznymi w procesie katalizowanym przez peroksydazę glutationową: GSH + HSG +H 2 O 2 GS SG + 2H 2 O GSH + HSG +ROOH GS SG + ROH + H 2 O Regeneracja zredukowanej formy glutationu zachodzi w obecności reduktazy glutationowej zgodnie z równaniem reakcji: GS SG + NADPH+H + 2GSH + NADP + Antyutleniające działanie glutationu przejawia się również w odtwarzaniu w białkach grup tiolowych, które uległy utlenieniu do grup disiarczkowych lub sulfonowych. Dzięki temu utrzymuje grupy SH białek w formie zredukowanej, co jest niezbędne dla ich aktywności biologicznej. W krwinkach czerwonych zredukowany glutation (GSH) pełni funkcję buforu hydrosulfidowego, utrzymującego reszty cysteinowe hemoglobiny i innych białek w formie zredukowanej. Erytrocyty, które nie zawierają dostatecznej ilość tej formy glutationu ulegają hemolizie.

2 Glutation uczestniczy ponadto w redukcji rybonukleotydów z utworzeniem deoksyrybonukleotydów, czyli bezpośrednio wpływa na biosyntezę DNA. Glutation utrzymuje także sprawność układu odpornościowego poprzez udział w powstawaniu i funkcjonowaniu limfocytów (zwłaszcza grasicozależnych T niszczących obce komórki) oraz ochrania witaminy E i C przed utlenianiem, utrzymując ich prawidłowy poziom w organizmie. Glutation uczestniczy również w syntezie leukotrienów LTC 4 i LTD 4, którym przypisuje się zdolność do powolnego kurczenia mięśni gładkich dróg oddechowych i przewodu pokarmowego oraz zwiększenia przepuszczalności naczyń włosowatych, co sprzyja powstawaniu obrzęków zapalnych. Wspomniany tripeptyd uczestniczy w przekształceniu prostaglandyny PGG 2 w PGH 2 na etapie katalizowanym przez hydroperoksydazę prostaglandynową, czyli syntazę PGH 2. W komórkach zwierzęcych zredukowany glutation uczestniczy również w transporcie aminokwasów do komórki drogą cyklu γ glutamylowego. Po zewnętrznej stronie błony komórkowej dowolny aminokwas (z wyjątkiem proliny) wiąże się z przenośnikiem, czyli γ glutamylotranspeptydazą, która jest integralnym składnikiem błony komórkowej. Podczas przemieszczania się przez błonę aminokwas wytwarza wiązanie izopeptydowe z grupą γ karboksylową glutaminianu pochodzącego z glutationu i powstaje γ glutamyloaminokwas. Ten dipeptyd nie wykazuje powinowactwa do przenośnika, uwalniany jest do cytozolu, gdzie pod wpływem γ glutamylocyklotransferazy następuje jego rozpad do pierwotnej formy aminokwasu. Natomiast reszta glutaminianu przekształca się w 5 oksoprolinę, która w obecności 5 oksoprolinazy tworzy glutaminian. Pozostały fragment glutationu, czyli cysteinyloglicyna ulega hydrolizie do cysteiny i glicyny. Tym samym aminokwas został przetransportowany do komórki, a glutation rozpadł się na elementy składowe Glu, Cys, Gly mogące uczestniczyć w odtworzeniu glutationu. Glutaminian reaguje bowiem z cysteiną tworząc γ glutamylocysteinę, która przyłącza glicynę odtwarzając strukturę glutationu mogącego ponownie włączyć sie w kolejny obrót cyklu γ glutamylowego. Transport jednej cząsteczki aminokwasu drogą cyklu γ glutamylowego jest kosztowny energetycznie, wymaga bowiem wykorzystania aż 3 cząsteczek ATP, czyli jest 9 razy więcej niż transport tego związku z wykorzystaniem symportowego przenośnika zależnego od Na +. Cykl γ glutamylowy funkcjonuje w wielu narządach, szczególnie w jelitach i kanalikach nerkowych. Jednak dysfunkcje związane na przykład z wrodzonym brakiem γ glutamylotranspeptydazy nie powodują żadnych zaburzeń w transporcie aminokwasów. prawdopodobnie komórki dysponują kilkoma alternatywnymi mechanizmami transportu aminokwasów.

3

4 Zasada oznaczenia ilości glutationu metodą Ellmana Glutation stanowi prawie 97% niebiałkowych związków tiolowych i dlatego oznaczając niebiałkowe grupy SH w odbiałczonym przy użyciu kwasu trichlorooctowego (TCA) homogenacie wątroby glutation oznaczany jest praktycznie ilościowo. Ten tripeptyd oznacza się technika spektrofotometryczną z wykorzystaniem metody Ellmana, która polega na redukcji kwasu 5,5 ditiobis (2 nitrobenzoesowego), czyli DNTB przez związki tiolowe do barwnego kwasu 2 nitro 5 merkaptobenzoesowego, wykazującego maksimum absorbancji przy długości fali λ = 412 nm.

5 Odczynniki: 1) 0,1M bufor fosfornowy ph=7,25 2) 0,2M bufor fosforanowy ph=7,8 3) 0,006M roztworu DTNB 4) 50% roztwór TCA 5) 2,5% roztwór TCA 6) 1mM roztwór glutationu w 2,5% roztworze TCA Wykonanie: I. Sporządzić krzywą wzorcową dla glutationu. W tym celu sporządzić szereg rozcieńczeń 1 mm roztworu GSH postępując zgodnie ze wskazówkami umieszczonymi w poniższej tabeli. objętość roztworów [µl] próba 1 próba 2 próba 3 próba 4 próba 5 Odnośnik 1 mm GSH X 0,2M bufor fosfor. ph 8, ,006M DNTB ,5 % TCA X X X X X 100 końcowe stęż. r ru GSH [mm] A λ=412nm 1. 10,0 g tkanki wątrobowej homogenizować w 40 ml 0,1 M buforu fosforanowego, uzupełnić buforem homogenat do 50 ml, a następnie w celu odbiałczenia do 1 ml homogenatu dodać 75 µl 50% TCA. 2. Homogenaty mieszać przez 30 s na vorteksie, a następnie wirować 10 min ( obr./min). 3. Supernatant przenieść do oddzielnej probówki chłodzonej lodem. 4. Próbę badaną przygotować według poniższych zaleceń. 0,2M bufor fosfor. ph 8,2 0,006M DNTB supernatant 2,5 % TCA A λ=412nm

6 próba badana [µl] odnośnik [µl] X Zmierzyć absorbancję przy długości fali λ = 412 nm względem próby ślepej dokładnie po 2 min. od wprowadzenia supernatantu. 6. Na podstawie krzywej wzorcowej oblicz stężenie glutationu w µmolach na gram tkanki wątrobowej przyjmując, że 100 µl supernatantu odpowiada 19 mg mokrej masy wątroby. Stężenie glutationu w wątrobie waha sie dobowo, zależy od diety i wieku zwierząt i wynosi od 4 do 8 µmoli/g mokrej masy tkanki. Zagadnienia do przygotowania 1. Struktura chemiczna i funkcje glutationu (rola w detoksykacji wolnych rodników tlenowych i organicznych oraz nadtlenku wodoru i nadtlenków organicznych) 2. Znaczenie i przebieg cyklu γ glutamylowego 3. Zasada oznaczenia glutationu metodą Ellmana